Summary
Decellularized extracellulaire matrix (dECM) kan geschikte micro-omgevings aanwijzingen bieden om de inherente functies van doelweefsels in een Engineered constructie te recapituleren. Dit artikel verheldeert de protocollen voor de decellularisatie van pancreas weefsel, evaluatie van decm bioink van de alvleesklier weefsel, en generatie van 3D-alvleesklier weefsel constructies met behulp van een bioprinten techniek.
Abstract
De transplantatie van pancreas eilandjes is een veelbelovende behandeling voor patiënten die lijden aan type 1 diabetes gepaard met Hypoglykemie en secundaire complicaties. Echter, Islet Transplantatie heeft nog steeds een aantal beperkingen, zoals de lage levensvatbaarheid van getransplanteerde eilandjes als gevolg van slechte eilandje engraftment en vijandige omgevingen. Bovendien, de insuline-producerende cellen onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen hebben beperkte mogelijkheid om te scheiden van voldoende hormonen die de bloedsuikerspiegel kan reguleren; Daarom is het sterk nodig om de rijping te verbeteren door cellen met goede micromilieuaanwijzingen te kweken. In dit artikel, we duidelijkheid protocollen voor het bereiden van een door de alvleesklier weefsel afgeleide decellularized extracellulaire matrix (pdecm) bioink om een gunstige micro-omgeving te bieden die de glucose gevoeligheid van alvleesklier eilandjes kan verhogen, gevolgd door het beschrijven van de processen voor het genereren van 3D-alvleesklier weefsel constructies met behulp van een microextrusie gebaseerde bioprinten techniek.
Introduction
Onlangs is de transplantatie van alvleesklier Islet beschouwd als een veelbelovende behandeling voor patiënten met diabetes type 1. De relatieve veiligheid en minimale invasiviteit van de procedure zijn grote voordelen van deze behandeling1. Echter, het heeft een aantal beperkingen, zoals de lage succespercentage van het isoleren van eilandjes en de bijwerkingen van immunosuppressieve drugs. Bovendien daalt het aantal geënt eilandjes gestaag na transplantatie als gevolg van de vijandige omgeving2. Verschillende biocompatibele materialen zoals alginaat, collageen, poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA) of polyethyleenglycol (PEG) zijn toegepast op het eiland van de alvleesklier transplantatie om deze moeilijkheden te overwinnen.
3D Cell Printing technologie is ontstaan in weefsel Engineering vanwege zijn grote potentieel en hoge prestaties. Onnodig te zeggen, bioinkten staan bekend als belangrijke componenten voor het verstrekken van een geschikte micro-omgeving en het mogelijk maken van de verbetering van cellulaire processen in gedrukte weefsel constructies. Een aanzienlijk aantal afschuifverdunnende hydrogels zoals fibrin, alginaat en collageen worden veel gebruikt als bioinkten. Echter, deze materialen vertonen een gebrek aan structurele, chemische, biologische en mechanische complexiteit in vergelijking met de extracellulaire matrix (ECM) in native weefsel3. Micromilieuaanwijzingen zoals de interacties tussen eilandjes en ECM zijn belangrijke signalen voor het verbeteren van de functie van eilandjes. Decellularized ECM (decm) kan de Weefselspecifieke samenstelling van verschillende ECM-componenten opnieuw maken, waaronder collageen, glycosaminoglycanen (Gags) en glycoproteïnen. Bijvoorbeeld, primaire eilandjes die hun perifere ECMs behouden (bijvoorbeeld, type I, III, IV, V, en VI collageen, laminine, en fibronectin) vertonen lage apoptosis en betere insulinegevoeligheid, wat aangeeft dat weefsel-specifieke cel-matrix interacties belangrijk zijn voor het verbeteren van hun vermogen om te functioneren op dezelfde manier naar oorspronkelijke weefsel4.
In dit document, we verhelderen protocollen voor het bereiden van alvleesklier weefsel afgeleide decellularized extracellulaire matrix (pdecm) bioink om gunstige microenvironmental cues voor het stimuleren van de activiteit en functies van pancreas eilandjes, gevolgd door de processen voor het genereren van 3D alvleesklier weefsel constructies met behulp van een microextrusie gebaseerde bioprinten techniek (Figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varkens alvleesklier weefsels werden verzameld van een lokaal slachthuis. Dierproeven werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Asan Medical Center, Seoel, Korea.
1. weefsel decellularisatie
- Bereid de oplossingen voor decellularisatie.
Opmerking: 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) die in alle oplossings preparaten wordt gebruikt, wordt verdund door gedistilleerd water toe te voegen aan 10x PBS.- Voor de 1% Triton-X 100 oplossing, los 100 mL van 100% Triton-X 100 oplossing op in 900 mL 1x PBS met behulp van een magnetische roerstaaf met het roeren bij 150 rpm gedurende 6 uur. Maak 400 mL 1% Triton-X 100 oplossing met 40 mL 10% Triton-X 100 oplossing en 360 mL 1x PBS voorbereid vlak voor gebruik.
Opmerking: de 10% Triton-X 100 oplossing kan tot op kamertemperatuur bewaard worden. - Verdun voor de 0,1% Perazijnzuur oplossing 8,5 mL 4,7% Perazijnzuur in 22,8 mL 70% ethanol met 368,7 mL gedistilleerd water vlak voor gebruik.
- Voor de 1% Triton-X 100 oplossing, los 100 mL van 100% Triton-X 100 oplossing op in 900 mL 1x PBS met behulp van een magnetische roerstaaf met het roeren bij 150 rpm gedurende 6 uur. Maak 400 mL 1% Triton-X 100 oplossing met 40 mL 10% Triton-X 100 oplossing en 360 mL 1x PBS voorbereid vlak voor gebruik.
- Verwijder de perifere weefsels van de alvleesklier en snijd het weefsel vóór de decellularisatie.
- Was de geperfectioneerde varkens alvleesklier met stromend kraanwater en verwijder de perifere weefsels met gesteriliseerde schaar.
- Breng de alvleesklier in een plastic zak met een tang en Vries bij-80 °C gedurende 1 uur om de alvleesklier effectief te snijden voor de volgende stap.
- Snijd de bevroren alvleesklier in 1 mm dikke stukjes met behulp van een rasp.
- Breng 50 g van het gesneden weefsel over in een plastic container van 500 mL.
Opmerking: een plastic bakje met deksel wordt hier aanbevolen om weefsels te beschermen tegen verontreiniging en de verdamping van de oplossing te voorkomen.
- Behandeling met reagentia.
Opmerking: het gehele decellularisatie proces moet bij 4 °C worden uitgevoerd op een digitaal rondschudapparaat bij 150 rpm. In alle decellularisatie stappen, fysieke loslating met behulp van een tang is nodig om te voorkomen dat de segmenten van de alvleesklier aan elkaar kleven. Het wassen van de container met gedistilleerd water is noodzakelijk om de rest reagentia volledig in de container te verwijderen.- Was vóór elke reagens behandeling 50 g gesneden alvleesklier met 300 mL gedistilleerd water met behulp van een shaker.
- Roer het weefsel continu op 150 rpm totdat het bewolkte water verdwijnt (na ongeveer 12 uur). Vervang het gedestilleerde water elke 2 uur.
Opmerking: het is raadzaam om het gedistilleerd water elk uur te veranderen voor efficiëntie om het bewolkte water sneller te verwijderen. - Gooi het water weg en behandel de 50 g weefsels met 400 mL 1% Triton-X 100 in 1x PBS oplossing voor 84 h. Vernieuw de oplossing elke 12 uur.
Opmerking: op dit punt, de hoeveelheid weefsel zal afnemen omdat de cellulaire componenten beginnen te worden verwijderd. - Behandel met 400 mL isopropanol (IPA) voor 2 uur om het resterende vet uit de alvleesklier te verwijderen.
Opmerking: het is normaal dat het weefsel sterk wordt door het verwijderen van vet in dit proces. - Na 2 h, verwijder de IPA en was het weefsel met 400 mL 1x PBS voor 24 h. Vernieuw de 1x PBS elke 12 h.
- Om het decellularized weefsel te steriliseren, gooi de vorige oplossing weg en behandel met 400 mL 0,1% Perazijnzuur in 4% ethanol voor 2 uur.
- Om het resterende reinigingsmiddel te verwijderen, was het weefsel met 400 mL 1x PBS voor 6 h. Vernieuw de oplossing elke 2 uur.
- Verzamel de decellularized weefsels in een conische buis van 50 mL met een tang.
- Vries het monster bij-80 °C gedurende 1 uur. Bedek de conische buis met een pluisvrij doekje in plaats van het deksel en bevestig met een rubberen band voor efficiënte lyofilisatie.
- Lyophilize het decellularized weefsel bij-50 °C gedurende 4 d.
Opmerking: voor stap 1,3 moet 1 g niet-decellulariseerd weefsel ook worden gevriesdroogd onder dezelfde omstandigheden.
2. beoordeling van decellularized weefsels
Opmerking: om de resterende hoeveelheid dsDNA, glycosaminoglycanen (Gags) en collageen in het decellularized weefsel te evalueren in vergelijking met inheems weefsel, is ten minste 1 g van elk van de niet-decellulariseerde weefsels (native weefsel) en decellularized weefsel vereist voor één partij van de beoordeling. De hoeveelheid dsDNA, GAGs en collageen kan worden berekend op basis van het droge gewicht van het weefsel.
- Bereid oplossingen voor biochemische assays.
- Bereid papaïne oplossing voor monster spijsvertering.
Opmerking: de hoeveelheid buffer die moet worden gemaakt, kan worden aangepast op basis van het aantal monsters.- Los 119 mg van 0,1 M natriumfosfaat (monobasic), 18,6 mg 0,5 mM Na2-EDTA en 8,8 mg 5 mM cysteïne-HCl op in 10 mL geautoclaveerd water.
- Pas de pH van de oplossing aan 6,5 door toevoeging van 10 M NaOH-oplossing.
- Voeg 125 μL van 10 mg/ml papaïne stamoplossing toe aan de bovenstaande oplossing en Vortex, waardoor elk element gelijkmatig kan mengen.
- Bereid oplossingen voor dimethyl-methyleenblauw (DMMB) test.
- Om DMMB-kleurstof te maken, Los 8 mg van 0,9-dimethyl-methyleenblauw zinkchloride-dubbel zout, 1,52 g Glycine en 1,185 g NaCl in 500 mL geautoclaveerd water op. Pas de pH op 3 door toe te voegen 0,5 M HCl oplossing terwijl het meten van de verandering van de pH met behulp van een bench-top pH-meter. Filtreer vervolgens door een 500 mL fles-top vacuüm filter.
- Maak 15 μL van 10 mg/mL chondroïtinesulfaat een oplossing voor standaard.
- Bereid oplossingen voor hydroxyproline assay.
- Los voor de werkoplossing chlooramine 2,4 g natriumacetaat, 1 g citroenzuur en 0,68 g natriumhydroxide op in 24 mL gedistilleerd water en voeg 240 μL ijsazijn, 10 μL tolueen en 6 mL IPA toe.
Opmerking: Los alle poeders in de oplossing op met een Vortex mixer. Chlooramine-werkoplossing kan gedurende maximaal drie maanden bij 4 °C worden bewaard. - Voor chlooramine T oplossing, Los 0,35 g van Chloramine T in 20 mL van chlooramine werkoplossing en voeg 2,5 mL IPA. Vortex om alle componenten te mengen.
Opmerking: bereid onmiddellijk voor gebruik. - Voor P-DAB-oplossing, plaats 3,75 g P-DAB in 6,5 mL perchloorzuur en 15 mL IPA; Wikkel het in aluminiumfolie.
Opmerking: bereid onmiddellijk voor gebruik.
- Los voor de werkoplossing chlooramine 2,4 g natriumacetaat, 1 g citroenzuur en 0,68 g natriumhydroxide op in 24 mL gedistilleerd water en voeg 240 μL ijsazijn, 10 μL tolueen en 6 mL IPA toe.
- Bereid papaïne oplossing voor monster spijsvertering.
- Voeg 1 mL papaïne oplossing toe aan 10 mg gelyofiliseerd weefsel in een micro centrifugebuis van 1,5 mL en Vortex de buis om het monster beter te verteren.
- Plaats de microcentrifuge buis van 1,5 mL in een rubberen rek en verteren de monsters in een bekerglas van 500 mL dat 300 mL water bevat bij 60 °C gedurende 16 uur.
- Centrifugeer bij 9.500 x g gedurende 20 minuten, verzamel het supernatant en breng het over in een nieuwe buis.
- Kwantificeer het rest DNA en de grote eiwitten in het decellularized weefsel.
- Laad 1 μL verteerd monster in de spectrometer en meet de hoeveelheid dsDNA volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: de experimenteerder moet zijn haar terug binden en een masker dragen om verontreiniging van het monster te voorkomen.
- Laad 1 μL verteerd monster in de spectrometer en meet de hoeveelheid dsDNA volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer een DMMB-test uit om de hoeveelheid GAGs te kwantificeren die in het decellularized weefsel overblijft.
- Meng 1 μL chondroïtinesulfaat een oplossing en 499 μL 1x PBS om standaarden te maken. Verdun de chondroïtinsulfaat oplossing met gedistilleerd water in concentraties van 0, 4, 8, 12, 16 en 20 μg/mL.
- Laad triplicaten van 50 μL van elke concentratie van de standaard en verteerde monsters in een 96-well plaat.
- Voeg aan elk goed 200 μL van de DMMB-kleurstof toe met een meerkanaals pipet.
- Lees onmiddellijk de extinctie bij 525 nm op een microplaat lezer.
- Voer een hydroxyproline-test uit om de hoeveelheid collageen te kwantificeren.
- Om een hydroxyproline test uit te voeren, incuberen 250 μL verteerd monster met gelijke hoeveelheden HCl bij 120 °C gedurende 16 uur.
- Droog de resten bij kamertemperatuur gedurende 3 uur om de monsters af te koelen en de monsters vervolgens opnieuw op te lossen in 1 mL 1x PBS.
- Centrifugeer bij 2.400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
- Bereid 100 μg/mL hydroxyproline-oplossing als standaard.
- Verdunde hydroxyproline oplossing met gedistilleerd water in een concentratie van 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL voor een standaardoplossing.
- Laad triplicaten van 50 μL monsters en standaardoplossing in een 96-well plaat.
- Voeg 50 μL Chlooramine T-oplossing toe en incuberen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 50 μL p-DAB-oplossing toe en inincuberen gedurende 30 minuten bij 60 °C.
Opmerking: ALIQUOT in een donkere kamer. Na de toevoeging, wikkel de plaat met aluminiumfolie. - Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Meet na het koelen de extinctie op 540 nm op een microplaat lezer.
3. bioink preparaat
Opmerking: pdECM poeder kan stabiel worden bewaard bij-80 °C gedurende ten minste één jaar. Vóór de pH-aanpassing kan de verteerde pdECM-oplossing gedurende één maand bij-20 °C worden bewaard. Vóór gebruik het monster van de bevroren pdECM-oplossing bij 4 °C 's nachts ontdooien. De pH-gecorrigeerde pdECM-oplossing kan maximaal één week bij 4 °C worden bewaard. De verteerde pdECM-oplossing kan gedurende ten minste een paar dagen bij 4 °C worden bewaard, maar mag niet langer zijn dan 1 week.
- Verteren de gevriesdroogde pdECM met pepsine.
- Voor effectieve spijsvertering van bioink, pulverize de gelyofiliseerde pdECM met vloeibare stikstof met behulp van een mortier en een stamper.
- Verzamel 200 mg pdECM poeder in de conische buis van 50 mL en Voeg 20 mg pepsine en 8,4 mL van het 0,5 M azijnzuur toe (eindconcentratie is 2 w/v%).
- Plaats de magnetische roer stang in de conische buis van 50 mL en roer bij 300 rpm voor 96 h.
- Pas de pH van de verteerde pdECM-oplossing aan.
Opmerking: om gelatie vóór de aanpassing van de pH te voorkomen, moet dit proces op ijs worden uitgevoerd.- Filter de onverteerde deeltjes in de pdECM-oplossing met behulp van een 40 μm-celzeef met behulp van een pipet met positieve verdringing op ijs om de optimale vertering van onderdelen te verkrijgen.
- Voeg 1 mL van de 10x PBS en Vortex toe voordat u NaOH gebruikt.
- Stel de pH in op 7 met 10 M NaOH controle van de pH met pH-indicator stroken.
Opmerking: Vortex telkens wanneer NaOH wordt toegevoegd, zodat de bioink grondig wordt vermengd met de andere reagentia.
4. Rheologische analyse
- Experimentele Setup
- Bereid de 1,5% (w/v) van pdECM bioink voor om de Rheologische eigenschappen te beoordelen.
- Stel een 20 mm kegel plaat geometrie in (kegel diameter van 20 mm met een hoek van 2 °) in de snelheids geregelde modus van een reometer.
- Maak experimentele sequenties in de geïnstalleerde software (TRIO'S) om de viscositeit, de gelatie kinetiek en de dynamische modulus van de pdECM bioink te meten.
- Viscositeit: plaats de pdECM bioink op de plaat. Meet de complexe viscositeit (PA · s) van pdECM bioink onder een stijgende afschuif snelheid van 1 tot 1.000 s-1 bij een constante temperatuur van 15 °c.
- Gelatie kinetiek: plaats de pdECM bioink op de plaat. Bereken de complexe modulus (G *) door meting van de opslag-en verlies modulus van pdECM bioink bij 4-37 °C met een incrementele verhoging van 5 °C/min (tijd-sweep-modus).
- Dynamische modulus: plaats de pdECM bioink op de plaat bij 37 °C gedurende 60 min vóór de meting. Meet de frequentie afhankelijke opslagmodulus (G ') en Loss modulus (G ' ') van de pdECM bioink in het bereik van 0,1-100 rad/s bij 2% stam.
5.3D-celafdrukken van alvleesklier weefsel constructies met behulp van Islet
- Bereiding van geïsoleerde eilandjes
- Isoleer primaire eilandjes van een rat volgens de protocollen beschreven in een vorig werk5.
- Om puin en dode cellen van het geïsoleerde eilandje te scheiden, passeert u de celsuspensie door een 70 μm celzeef. Eilandjes met een diameter kleiner dan 70 μm worden als dood of abnormaal beschouwd.
- Onderbreek de geïsoleerde eilandjes in RPMI-1640 medium en plaats ze op de petrischaal. Verwijder eilandjes groter dan 300 μm in diameter door gebruik te maken van een P200 volume pipet onder de Microscoop (4x objectief lens) in de bioveiligheidskast.
- Eilandje inkaping in pdECM bioink
- Bereid pH aangepast pdECM bioink en geïsoleerd eilandje.
Opmerking: om gelatie voor de pH-aanpassing te voorkomen, moet dit proces op ijs worden uitgevoerd. - Meng de pdecm bioink en de media die met de eilandjes zijn opgehangen (ratio 3:1) zachtjes met een pipet met positieve verdringing tot ze gelijkmatig gemengd zijn.
NB: de uiteindelijke concentratie van de pdECM bioink is 1,5% en de celdichtheid in de pdECM bioink is 3.000 IEQ/mL.
- Bereid pH aangepast pdECM bioink en geïsoleerd eilandje.
- 3D-cel afdrukken van alvleesklier weefsel constructies
- Bereid een gesteriliseerde spuit en een mondstuk van 22 G.
Opmerking: deze meter is geselecteerd voor het afdrukken van eilandjes met een diameter van 100-250 μm. - Laad eilandje-beladen pdECM bioink in de spuit.
- Druk de bioink af met de geoptimaliseerde afdruk conditie (voedingssnelheid: 150 mm/min; pneumatische druk: 15 kPa) bij 18 °C in de vorm van een rooster.
- Om de bioink te crosslinken, plaats de gedrukte constructie in de incubator voor 30 min.
- Dompel de gedrukte constructie onder in de eilandcultuur media die RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U/mL penicillaire en 100 U/mL streptomycine.
- Bereid een gesteriliseerde spuit en een mondstuk van 22 G.
6.3D-celdruk van de alvleesklier constructie met patroon structuur
- Bereiding van twee soorten bioink
- Voor het valideren van de veelzijdigheid van het afdrukken met behulp van meerdere bioinkten, bereid twee sets pdECM bioinks en vlek ze door het toevoegen van 0,4% Trypan blauwe en Rose Bengal oplossing in elke pdECM bioink in een verhouding van 1:20, respectievelijk.
Opmerking: om gelatie voor de pH-aanpassing te voorkomen, moet dit proces op ijs worden uitgevoerd. - Meng de pdecm bioink en de media die met de eilandjes zijn opgehangen (ratio 3:1) zachtjes met een pipet met positieve verdringing tot ze gelijkmatig gemengd zijn.
NB: de uiteindelijke concentratie van de pdECM bioink is 1,5% en de celdichtheid in de pdECM bioink is 3.000 IEQ/mL.
- Voor het valideren van de veelzijdigheid van het afdrukken met behulp van meerdere bioinkten, bereid twee sets pdECM bioinks en vlek ze door het toevoegen van 0,4% Trypan blauwe en Rose Bengal oplossing in elke pdECM bioink in een verhouding van 1:20, respectievelijk.
- 3D-celafdrukken van multi materiaal-gebaseerde alvleesklier weefsel constructies
- Bereid gesteriliseerde spuiten en een 25 G mondstuk.
- Laad elke bioink (blauw en rood) in twee verschillende spuiten, respectievelijk.
- Print de bioink met geoptimaliseerde afdruk conditie (voedingssnelheid: 150 mm/min; pneumatische druk: 15 kPa) bij 18 °C in een vorm van een rooster met wisselende lijnen blauw en rood.
- Om de bioink te crosslinken, plaats de gedrukte constructie in de incubator voor 30 min.
- Dompel de gedrukte constructie onder in een eilandje cultuur media die RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U/mL penicillaire en 100 U/mL streptomycine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularisatie van alvleesklier weefsels
We ontwikkelden het proces voor het bereiden van pdecm bioink om alvleesklier weefsel-specifieke micro-omgevingen te bieden voor het verbeteren van de functionaliteit van eilandjes in een 3D bioprinted weefsel constructie (Figuur 2a). Na het decellularisatie proces, 97,3% van dsDNA werd verwijderd en representatieve ECM componenten zoals collageen en GAGs bleven 1278,1% en 96,9% vergeleken met die van de inheemse alvleesklier weefsel, respectievelijk (Figuur 2B).
Bioink preparaat
Om de pdECM in het drukproces toe te passen, werd het pdECM-poeder gesolubiliseerd in zwak zuur met pepsine en geneutraliseerd met 10 M NaOH-oplossing. De verteerde pdECM-oplossing kan vervolgens worden verdund door menging met een celkweekmedium of 1x PBS. In deze studie bereidden we pdECM bioink voor op een eindconcentratie van 1,5% voor verdere studie. De pdECM bioink onderhield een oplossingsfase toen deze onder kamertemperatuur werd geplaatst en onmiddellijk werd omgezet in een gel-fase na incubatie bij 37 °C gedurende 30 minuten. Om het effect van de pdECM bioink op eilandjes te onderzoeken, werden geïsoleerde eilandjes ingekapseld in de pdECM-, alginaat-en collageen-bioinkten met een concentratie van 1,5%. Het resultaat van de glucose-gestimuleerde insuline secretie test toonde eilandjes in de pdecm bioink vertegenwoordigde de hoogste index (ongeveer 3,174) onder de experimentele groepen, wat duidt op een hogere functionaliteit over de algemeen toegepaste hydrogels voor Islet inkapseling5.
Rheologische analyse
Viscositeit is een van de kritische kenmerken bij het overwegen van een afdrukbare biomateriaal. We hebben de viscositeit van de pdecm bioink gemeten met een frequentie variërend van 1 tot 1.000 Hz bij 15 °c voor het printen van verschillende decm bioinks6,7,8. De pdECM bioink toonde afschuifverdunnende werking en de waarde was ongeveer 10 pa · s bij de afschuif snelheid van 1/s, wat aangeeft dat de pdECM bioink geschikte Rheologische eigenschappen had voor extrusie door middel van een nozzle (Figuur 3a). De gelatie kinetiek bij een temperatuur variërend van 4 tot 37 °C gaf het gelatie gedrag van de pdECM bioink aan bij fysiologisch relevante temperaturen. Het complex modulus begon te stijgen toen de temperatuur bereikte 15 ° c, en het steeg snel wanneer de temperatuur werd gehandhaafd op 37 ° c, met vermelding van de Sol-gel overgang van de pdECM bioink (Figuur 3B). De dynamische G ' en G ' van pdECM bioink werden onderzocht op fysiologisch relevante temperaturen om de stabiliteit na het drukproces te verzekeren, wat resulteerde in een stabiele modulus onder de frequentie sweep voorwaarde (Figuur 3C).
afdrukken in 3D-cellen
3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies werden vervaardigd met behulp van een microextrusiegebaseerd drukproces. Om een constructie te bouwen die ten minste 3.000 eilandje equivalenten (IEQ) bevat, die overeenkomt met het weefsel volume van een perfect bolvormig eilandje met een diameter van 150 μm9, hebben we de constructie ontworpen met een afmeting van 10 mm x 10 mm x 3 mm (Figuur 4a). De procesparameters en voorwaarden voor het afdrukken van pancreas eilandjes werden geselecteerd om eilandjes in te kapen, wat grote cellulaire clusters zijn in grootten variërend van 100-250 μm in diameter (Figuur 4B). Met behulp van een multi-Head Printing systeem, verschillende soorten 3D constructies-zoals de vorm van het rooster met alternatieve lijnen van blauw en rood-werden vervaardigd met behulp van de ontwikkelde pdecm (Figuur 4C), met vermelding van de veelzijdigheid van pdecm voor het doel van 3D bioprinten om twee of meer soorten levende cellen in een weefsel-achtige opstelling harmoniseren.
Figuur 1: schematische voorstelling van de ontwikkeling van decellularized pancreatisch weefsel, evaluatie van pdecm bioink en fabricage van 3D-alvleesklier weefsel constructies. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve beelden van het decellularisatie proces en Biochemische karakterisering van pdECM. A) overzicht van de decellularisatie van varkens pancreas weefsel. B) resultaten van biochemische assays van inheems weefsel en pdECM. Foutbalken tonen standaarddeviatie. Copyright (2019) de Royal Society of Chemistry5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: reologische analyse van pdECM bioink. (A) viscositeit van pdECM en collageen bioinkten die afschuifverdunnende gedrag vertoonden. B) de gelatie kinetiek van pdECM en collageen bioinkten tijdens de temperatuurverandering. C) de complexe modulus van gecrosslinked pdECM en collageen bioinkten. Copyright (2019) van de Royal Society of Chemistry5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4:3D-celdruk van cel-beladen pdecm-bioink voor 3D-alvleesklier weefsel constructies. A) de afmetingen van 3D-alvleesklier weefsel constructies. B) op het eilandje van de alvleesklier beladen en (C) op meerdere materialen gebaseerde 3D-alvleesklier weefsel constructies. Copyright (2019) van de Royal Society of Chemistry5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschreef de ontwikkeling van pdecm-bioinkten en de fabricage van 3D-alvleesklier weefsel constructies met behulp van 3D-celdruktechnieken. Om de micro-omgeving van het doelweefsel in de 3D-engineered weefsel constructie te recapituleren, is de keuze van bioink van cruciaal belang. In een eerdere studie, we gevalideerd dat weefsel-specifieke dECM bioinks gunstig zijn voor het bevorderen van stamcel differentiatie en proliferatie10. In vergelijking met synthetische polymeren, dECM kan dienen als een cel-gunstige omgeving vanwege de weefsel-specifieke samenstelling en architectuur11. Daarom moet het decellularisatie proces serieus worden overwogen voor de hoge retentie van belangrijke componenten in de dECM.
De selectie van verschillende detergenten voor decellularisatie van pancreas weefsel varieert de resterende ECM-component12. In het proces van decellularisatie, merkten we dat het gebruik van natriumdodecylsulfaat (SDS) kan invloed hebben op het verlies van de ECM-eiwitten13. Zo hebben we ons vorige protocol aangepast door het elimineren van de stap voor de behandeling van SDS Solution, dat is een ionische oppervlakteactieve stof die wordt gebruikt in veel reinigings-en decellularisatie processen met relatief harde eigenschappen in vergelijking met de andere, zoals Trion-X 100, of 3-[(3-cholamidopropyl) dimethyl-lammonio] -1-propanesulfonaat (CHAPS). In dit protocol gebruikten we 1% Triton-X 100 oplossing voor 84 h in plaats van SDS-oplossing, die de cellulaire componenten effectief kon verwijderen met behoud van GAGs en collagene eiwitten. Daarnaast hebben we opgemerkt dat het verwijderen van rest lipiden door de behandeling met IPA ook een zeer cruciaal proces is voor het induceren van de crosslinking van pdECM bioink en het kan worden begrepen in dezelfde context als een eerder gepubliceerd artikel4. Behandeling met Perazijnzuur oplossing werd ook toegepast voor de sterilisatie van decellularized weefsel. Bovendien is het verwijderen van de overblijvende reinigingsmiddelen en chemicaliën in het decellularized weefsel een cruciale stap om de ontstekingsreactie van de gastheer te voorkomen. We hebben dit onderwerp echter niet in dit protocol besproken. Protocollen die een ontsmettingsproces aan het einde van decellularisatie bevatten zal de biocompatibiliteit van het decellularized materiaal te verbeteren. Bovendien moeten normen voor evaluatiecriteria worden overwogen om ervoor te zorgen dat detergenten en chemicaliën volledig worden verwijderd.
De vertering van pdECM bioink met pepsine werd uitgevoerd om de homogene menging van pdECM poeder in de zure oplossing te bereiken door splitsing van de telopeptide regio in het collagene eiwit. In het pH-aanpassingsproces is het houden van de pdECM bioink op ijs van cruciaal belang voor het behoud van gelatie. Daarna kunnen we fysiek crosskoppelbare pdECM-bioinkten produceren die een geltoestand kunnen invoeren door te incuberen op 37 ° c, wat een van de belangrijkste voordelen is van op dECM gebaseerde biologische inkten. Selectie van de juiste concentratie van de pdECM bioink is ook belangrijk10. Een ideale bioink moet cellen beschermen tegen externe schade die optreedt tijdens het drukproces, zoals pneumatische druk en temperatuurverandering. Het is bekend dat de toegepaste shear Force schade aan de cellen kan veroorzaken en verminderen van de levensvatbaarheid van de cel in de gedrukte constructies10. Ook, verbetering van de concentraties van bioink kon induceren celdood5. Lage concentraties bioinkt induceert daarentegen een lage viscositeit, wat een slechte bedrukbaarheid en vorm getrouwheid betekent tijdens het printen. Het is noodzakelijk om de viscositeit van bioink te controleren en de concentratie ervan te optimaliseren.
Op dit moment, onderzoekers zijn actief bestuderen van de ontwikkeling van verschillende soorten weefsel-afgeleide bioinkten voor het afdrukken van 3D-weefsel constructies14,15,16. Uit de resultaten van deze studies blijkt dat de bioink weefsel-specifieke micro-omgevingen voor cellen kan bieden. Deze unieke voorwaarden kunnen de differentiatie of rijping van stamcellen en de proliferatie van cellen bevorderen. Bovendien maakt het gebruik van het multi-Head uitgeruste 3D-celdruksysteem het mogelijk om meerdere soorten bioinkten tegelijkertijd met hoge precisie af te drukken. Met behulp van deze techniek kan een structuur met een specifiek patroon worden geproduceerd, waardoor de veelzijdigheid van het ontwerp wordt getoond. Bovendien is het haalbaar om verschillende soorten cellen in elke bioink in te kapen om inheemse celregeling17na te bootsen. Deze patroon structuren kunnen worden gebruikt in de inductie van vascularisatie of co-cultuur effect door het verbeteren van cel-naar-cel interacties, die belangrijke factoren kunnen zijn in de lange termijn Overleving van specifieke cellen18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het bio & Medical Technology Development Program van de National Research Foundation (NRF), gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (2017M3A9C6032067) en "ICT consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) onder toezicht van het IITP (Institute for Information & Communications Technology planning & evaluatie).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C.
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M.
