Summary
Decellularized extracellulära matrix (dECM) kan ge lämpliga mikromiljö signaler att recapitulate de inneboende funktionerna i målvävnaderna i en konstruerad konstruktion. Denna artikel belyser protokollen för decellularization av pankreasvävnad, utvärdering av pankreasvävnad-härledda dECM bioink, och generering av 3D pankreasvävnad konstruktioner med hjälp av en bioprinering teknik.
Abstract
Transplantation av pankreasöar är en lovande behandling för patienter som lider av typ 1-diabetes åtföljd av hypoglykemi och sekundära komplikationer. Men ö-transplantation har fortfarande flera begränsningar såsom den låga lönsamheten för transplanterade öar på grund av dålig ö-inympningar och fientliga miljöer. Dessutom har de insulinproducerande cellerna som skiljer sig från humana pluripotenta stamceller begränsad förmåga att utsöndra tillräckligt med hormoner som kan reglera blodsockernivån. Därför är det starkt nödvändigt att förbättra mogningen genom odling av celler med rätt mikromiljösignaler. I denna artikel, vi belysa protokoll för att förbereda en pankreasvävnad härledda decellularized extracellulära matrix (pdECM) bioink att ge en gynnsam mikromiljö som kan öka glukos känsligheten i bukspottskörteln öar, följt av beskriver processerna för att generera 3D-pankreasvävnad konstruktioner med hjälp av en microextrudering-baserade bioprinting teknik.
Introduction
Nyligen, bukspottskörteln ö-transplantation har ansetts vara en lovande behandling för patienter med typ 1-diabetes. Den relativa säkerheten och minimal invasivitet av förfarandet är stora fördelar med denna behandling1. Emellertid, det har flera begränsningar såsom den låga andelen framgångsrika isolerande öar och biverkningar av immunsuppressiva läkemedel. Dessutom minskar antalet inympade öar stadigt efter transplantation på grund av den fientliga miljön2. Olika biokompatibla material såsom alginat, kollagen, poly (mjölk-Co-glykolsyra) (PLGA) eller polyetylenglykol (PEG) har tillämpats på bukspottskörteln ö transplantation för att övervinna dessa svårigheter.
3D-cell tryckteknik växer fram i vävnadsteknik på grund av dess stora potential och hög prestanda. Självfallet är bioinks kända som viktiga komponenter för att tillhandahålla en lämplig mikromiljö och möjliggöra en förbättring av cellulära processer i tryckt vävnad konstruktioner. Ett stort antal skjuvningsförtunnande hydrogeler såsom fibrin, alginat och kollagen används ofta som bioinks. Emellertid, dessa material visar en brist på strukturell, kemisk, biologisk, och mekanisk komplexitet jämfört med den extracellulära matrisen (ECM) i infödda vävnad3. Mikromiljö ledtrådar som samspelet mellan kobbar och ECM är viktiga signaler för att förbättra funktionen av öar. Decellularized ECM (dECM) kan återskapa vävnads-specifika sammansättningen av olika ECM komponenter inklusive kollagen, glykosaminoglykaner (GAGs), och glykoproteiner. Till exempel, primära öar som behåller sina perifera ECMs (t. ex. typ I, III, IV, V, och VI kollagen, laminin, och fibronectin) uppvisar låg apoptos och bättre insulinkänslighet, vilket indikerar att vävnads-specifika cell-matris interaktioner är viktiga för att förbättra deras förmåga att fungera på samma sätt som original vävnad4.
I detta dokument, vi belysa protokoll för beredning av pankreasvävnad härledda decellularized extracellulära matrix (pdECM) bioink att ge nyttiga mikromiljö signaler för att öka aktiviteten och funktioner i bukspottskörteln öar, följt av processerna för att generera 3D-pankreasvävnad konstruktioner med hjälp av en microextrudering-baserade bioprinting teknik (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Porcin bukspottskörteln vävnader samlades in från ett lokalt slakteri. Djurförsök godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) i Asan Medical Center, Seoul, Korea.
1. vävnad decellularization
- Förbered lösningarna för decellularization.
Anmärkning: 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som används i alla lösnings preparat späds genom tillsats av destillerat vatten till 10X PBS.- För 1% Triton-X 100 lösning, lös upp 100 mL 100% Triton-X 100 lösning i 900 mL 1x PBS med en magnetisk röra bar med omrörning vid 150 RPM för 6 h. gör 400 mL 1% Triton-X 100 lösning med 40 mL 10% Triton-X 100 lösning och 360 mL 1x PBS beredd precis före användning.
Anmärkning: 10% Triton-X 100 lösning kan förvaras i rumstemperatur tills det behövs. - För 0,1% perättiksyralösning, späd 8,5 mL av 4,7% Perättiksyra till 22,8 mL av 70% etanol med 368,7 mL destillerat vatten strax före användning.
- För 1% Triton-X 100 lösning, lös upp 100 mL 100% Triton-X 100 lösning i 900 mL 1x PBS med en magnetisk röra bar med omrörning vid 150 RPM för 6 h. gör 400 mL 1% Triton-X 100 lösning med 40 mL 10% Triton-X 100 lösning och 360 mL 1x PBS beredd precis före användning.
- Ta bort perifera vävnader i bukspottkörteln och skiva vävnaden innan decellularization.
- Tvätta resected svin bukspottkörteln med rinnande kranvatten och ta bort perifera vävnader med hjälp av steriliserad sax.
- Överför bukspottkörteln till en plastpåse med tång och frysa vid-80 ° c för 1 h för att skära bukspottkörteln effektivt för nästa steg.
- Skär den frusna bukspottkörteln i 1 mm tjocka bitar med ett rivjärn.
- Överför 50 g av den skivade vävnaden till en 500 mL plastbehållare.
Anmärkning: en plastbehållare med lock rekommenderas här för att skydda vävnader från kontaminering och förhindra avdunstning av lösningen.
- Behandling med reagenser.
Anmärkning: hela decellulariseringsprocessen bör utföras vid 4 ° c på en digital orbitalskak vid 150 RPM. I alla decellularization steg, fysisk avlossning med hjälp av pinkoppar krävs för att förhindra skivor av bukspottkörteln fastnar tillsammans. Det är nödvändigt att tvätta behållaren med destillerat vatten för att avlägsna restreagenser helt i behållaren.- Innan någon reagens behandling, tvätta 50 g skivad bukspottkörtel med 300 mL destillerat vatten med hjälp av en shaker.
- Rör om vävnaden kontinuerligt vid 150 rpm tills grumligt vatten försvinner (efter ca 12 h). Byt ut destillerat vatten varje 2 h.
Obs: byte av destillerat vatten varje timme rekommenderas för effektivitet för att avlägsna grumligt vatten snabbare. - Kassera vattnet och behandla 50 g av vävnader med 400 mL 1% Triton-X 100 i 1x PBS lösning för 84 h. uppdatera lösningen varje 12 h.
ANMÄRKNINGAR: vid denna punkt kommer mängden vävnad att minska eftersom de cellulära komponenterna börjar tas bort. - Behandla med 400 mL isopropanol (IPA) för 2 h för att ta bort resterande fett från bukspottkörteln.
Obs: det är normalt att vävnaden blir tuff på grund av avlägsnande av fett i denna process. - Efter 2 h, ta bort IPA och tvätta vävnaden med 400 mL 1x PBS för 24 h. uppdatera 1x PBS varje 12 h.
- För att sterilisera den decellularized vävnaden, kassera den tidigare lösningen och behandla med 400 mL av 0,1% Perättiksyra i 4% etanol för 2 h.
- För att ta bort kvarvarande tvättmedel, tvätta vävnaden med 400 mL 1x PBS för 6 h. uppdatera lösningen varje 2 h.
- Samla upp de decellularized vävnaderna i en 50 mL koniskt rör med pinkoppar.
- Frys provet vid-80 ° c i 1 h. Täck det koniska röret med en luddfri torka i stället för locket och fixera med ett gummiband för effektiv frystorkad.
- Lyophilize den decellularized vävnad vid-50 ° c för 4 d.
Anmärkning: för steg 1,3, 1 g icke-decellularized vävnad bör också frystorkad under samma betingelser.
2. bedömning av deellulariserade vävnader
Anmärkning: för att utvärdera den resterande mängden av dsDNA, glykosaminoglykaner (GAGs), och kollagen i den avfettade vävnaden jämfört med inhemsk vävnad, minst 1 g av varje icke-decellularized vävnad (infödda vävnad) och deellularized vävnad krävs för en bedömnings sats. Mängden dsDNA, GAGs och kollagen kan beräknas baserat på torrvikt av vävnaden.
- Förbered lösningar för biokemiska analyser.
- Förbered papain lösning för prov matsmältning.
Obs: mängden buffert som ska göras kan justeras enligt antalet prover.- Lös 119 mg av 0,1 M natriumfosfat (monobasic), 18,6 mg 0,5 mM Na2-EDTA och 8,8 mg 5 mM cystein-HCl i 10 mL autoklaverat vatten.
- Justera pH-värdet i lösningen till 6,5 genom att lägga till 10 M NaOH-lösning.
- Tillsätt 125 μL 10 mg/mL papain-lagerlösning till ovanstående lösning och Vortex, vilket gör att varje element blandas jämnt.
- Bered lösningar för dimetylmetylenblått (DMMB)-analys.
- För att göra DMMB färgämne, lös 8 mg 1, 9-dimetyl-metylenblått zinkklorid dubbel salt, 1,52 g glycin, och 1,185 g NaCl i 500 mL autoklaverat vatten. Justera pH till 3 genom att tillsätta 0,5 M HCl lösning samtidigt mäta förändringen av pH med en bänk pH-mätare. Sedan, filtrera detta genom en 500 mL flaska-Top vakuum filter.
- Gör 15 μL av 10 mg/mL Chondroitin Sulfate en lösning för standard.
- Bered lösningar för hydroxiprolin-analys.
- Lös upp 2,4 g natriumacetat, 1 g citronsyra och 0,68 g natriumhydroxid i 24 mL destillerat vatten och tillsätt 240 μL isättika, 10 μL toluen och 6 mL IPA, för kloraminlösningen.
Anmärkning: Lös upp alla pulver i lösning med en Vortex mixer. Kloramin arbetslösning kan förvaras vid 4 ° c i upp till tre månader. - Lös 0,35 g kloramin T i 20 mL kloraminlösning och tillsätt 2,5 mL IPA för kloramin. Virvel för att blanda alla komponenter.
Obs: Förbered dig omedelbart före användning. - För P-DAB-lösning, sätt 3,75 g P-DAB i 6,5 mL perklorsyra och 15 mL IPA; Linda in den i aluminiumfolie.
Obs: Förbered dig omedelbart före användning.
- Lös upp 2,4 g natriumacetat, 1 g citronsyra och 0,68 g natriumhydroxid i 24 mL destillerat vatten och tillsätt 240 μL isättika, 10 μL toluen och 6 mL IPA, för kloraminlösningen.
- Förbered papain lösning för prov matsmältning.
- Tillsätt 1 mL papain lösning till 10 mg frystorkat vävnad i ett 1,5 mL microcentrifugerör och Vortexblanda röret för att bättre smälta provet.
- Placera 1,5 mL microcentrifugeröret i ett gummi rack och smälta proverna i en 500 mL bägare som innehåller 300 mL vatten vid 60 ° c i 16 timmar.
- Centrifugera vid 9 500 x g i 20 min, samla supernatanten och överför den till ett nytt rör.
- Kvantifiera resterande DNA och större proteiner i den decellularized vävnaden.
- Fyll på 1 μL av smält provet i spektrometern och mät mängden dsDNA enligt tillverkarens anvisningar.
Anmärkning: försöksledaren bör binda håret tillbaka och bära en mask för att undvika kontaminering provet.
- Fyll på 1 μL av smält provet i spektrometern och mät mängden dsDNA enligt tillverkarens anvisningar.
- Utför en DMMB-analys för att kvantifiera mängden GAGs som återstår i den decellularized vävnaden.
- Blanda 1 μL av Chondroitin Sulfate en lösning och 499 μL 1x PBS för att göra standarder. Späd Chondroitin Sulfate en lösning med destillerat vatten vid koncentrationer av 0, 4, 8, 12, 16 och 20 μg/mL.
- Ladda tre exemplar av 50 μL av varje koncentration av standard-och smält proverna till en 96-brunn-platta.
- Tillsätt 200 μL av DMMB-färgämnet till varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett.
- Läs genast absorbansen vid 525 nm på en mikroplattläsare.
- Utför en hydroxiprolin-analys för att kvantifiera mängden kollagen.
- För att genomföra en hydroxiprolin-analys, inkubera 250 μL av smält provet med lika volymer HCl vid 120 ° c i 16 timmar.
- Torka av resterna i rumstemperatur under 3 timmar för att kyla proverna och lös sedan upp proverna i 1 mL 1x PBS.
- Centrifugera vid 2 400 x g i 10 min vid 4 ° c.
- Bered 100 μg/ml hydroxiprolin lösning som standard.
- Späd hydroxiprolin lösning med destillerat vatten vid en koncentration av 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL för en standardlösning.
- Ladda tripletter av 50 μl prover och standardlösning i en 96-brunn tallrik.
- Tillsätt 50 μL Kloramint-lösning och inkubera sedan i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 50 μL p-DAB-lösning och inkubera i 30 min vid 60 ° c.
Anmärkning: alikvot i ett mörkt rum. Efter tillsats, Linda plattan med aluminiumfolie. - Inkubera i rumstemperatur i 30 minuter.
- Efter kylning, Mät absorbansen vid 540 nm på en mikroplattläsare.
3. framställning av bioink
Anmärkning: pdECM pulver kan förvaras stabilt vid-80 ° c i minst ett år. Före pH-justeringen kan den smälta pdECM-lösningen förvaras vid-20 ° c i en månad. Före användning, Tina provet av fryst pdECM-lösning vid 4 ° c över natten. Den pH-justerade pdECM-lösningen kan förvaras vid 4 ° c i upp till en vecka. Den smälta pdECM-lösningen kan förvaras vid 4 ° c i minst ett par dagar, men bör inte överstiga 1 vecka.
- Smälta den frystorkade pdECM med pepsin.
- För effektiv nedbrytning av bioink, pulverisera den frystorkade pdECM med flytande kväve med hjälp av en mortel och stöt.
- Samla 200 mg av pdECM pulvret i 50 mL koniskt rör och tillsätt 20 mg Pepsin och 8,4 mL av den 0,5 M ättiksyra (slutkoncentration är 2 w/v%).
- Placera den magnetiska rör fältet i 50 mL koniska röret och rör vid 300 rpm för 96 h.
- Justera pH i smält pdECM lösning.
Anmärkning: för att undvika gelation före pH-justering, bör denna process utföras på is.- Filtrera bort de osmälta partiklarna i pdECM-lösningen med en cell-SIL på 40 μm med hjälp av en positiv deplacement-pipett på isen för att få optimal nedbrytning av delar.
- Tillsätt 1 mL av 10X PBS och Vortex innan du använder NaOH.
- Justera pH till 7 med 10 M NaOH kontrollera pH med pH-indikatorremsor.
Obs: Vortex varje gång NaOH tillsätts så att biobläcket blandas grundligt med de andra reagenser.
4. Reologisk analys
- Experimentell installation
- Bered 1,5% (w/v) av pdECM bioink för att bedöma de reologiska egenskaperna.
- Upprätta en 20 mm kon tallrik geometri (kon diameter på 20 mm med en vinkel på 2 °) i Rate-styrt läge av en rheometer.
- Skapa experimentella sekvenser i den installerade programvaran (TRIOS) för att mäta viskositeten, geleringskinetiken och den dynamiska Modulus av pdECM-biobläcket.
- Viskositet: placera pdECM-biobläcket på plattan. Mät komplex viskositet (PA · s) av pdECM bioink under en ökande skjuvning hastighet från 1 till 1 000 s-1 vid en konstant temperatur på 15 ° c.
- Gelation Kinetics: placera pdECM bioink på plattan. Beräkna den komplexa modulus (G *) genom att mäta lagring och förlust Modulus av pdECM bioink vid 4-37 ° c med en inkrementell ökningstakt på 5 ° c/min (Time-svep-läge).
- Dynamisk Modulus: placera pdECM-biobläcket på plattan vid 37 ° c i 60 min före mätningen. Mätfrekvens beroende lagringsmodulus (G) och förlustmodulus (G ' ') på pdECM-biobläcket i intervallet 0,1-100 rad/s vid 2% stam.
5.3D cell utskrift av pankreasvävnad konstruktioner med hjälp av Islet
- Beredning av isolerade öar
- Isolera primära öar från en råtta enligt de protokoll som beskrivs i ett tidigare arbete5.
- Att separera skräp och döda celler från den isolerade Holmen, passera cellsuspensionen genom en 70 μm cell SIL. Holkar med en diameter som är mindre än 70 μm anses vara döda eller onormala.
- Suspendera de isolerade holarna i RPMI-1640 medium och placera dem på petriskål. Ta bort holkar större än 300 μm i diameter genom att använda en P200 volympipett under mikroskopet (4x objektiv lins) i biosäkerhets skåpet.
- Holmen inkapsling i pdecm bioink
- Förbered pH-justerat pdECM-bioink och isolerad holme.
Anmärkning: för att undvika gelation före pH-justering, bör denna process utföras på is. - Blanda försiktigt pdECM-biobläcket och mediet suspenderat med holkar (ratio 3:1) med hjälp av en kolvpipett tills den är jämnt blandad.
Anmärkning: den slutliga koncentrationen av pdECM-biobläcket är 1,5% och CELLTÄTHETEN i pdECM-biobläcket är 3 000 IEQ/mL.
- Förbered pH-justerat pdECM-bioink och isolerad holme.
- 3D-cell utskrift av pankreasvävnad konstruktioner
- Förbered en steriliserad spruta och 22 G munstycke.
Anmärkning: denna mätare valdes för tryckning av holkar med en diameter på 100-250 μm. - Fyll på Holmen-lastat pdECM-biobläck i sprutan.
- Skriv ut biobläcket med det optimerade utskrifts villkoret (matningshastighet: 150 mm/min; pneumatiskt tryck: 15 kPa) vid 18 ° c i form av ett galler.
- För att korslänka biobläcket, placera den tryckta konstruktionen i inkubatorn i 30 min.
- Sänk den tryckta konstruktionen i Holmen Culture media som är RPMI-1640 medium kompletterat med 10% foster bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin och 100 U/mL streptomycin.
- Förbered en steriliserad spruta och 22 G munstycke.
6.3D-cell utskrift av bukspottskörteln konstruera med mönstrad struktur
- Beredning av två typer av bioink
- För att validera tryckning mångsidighet med hjälp av flera bioinks, förbereda två uppsättningar av pdECM bioinks och färga dem genom att lägga till 0,4% Trypan blå och Rose Bengal lösning i varje pdECM bioink med ett förhållande på 1:20, respektive.
Anmärkning: för att undvika gelation före pH-justering, bör denna process utföras på is. - Blanda försiktigt pdECM-biobläcket och mediet suspenderat med holkar (ratio 3:1) med hjälp av en kolvpipett tills den är jämnt blandad.
Anmärkning: den slutliga koncentrationen av pdECM-biobläcket är 1,5% och CELLTÄTHETEN i pdECM-biobläcket är 3 000 IEQ/mL.
- För att validera tryckning mångsidighet med hjälp av flera bioinks, förbereda två uppsättningar av pdECM bioinks och färga dem genom att lägga till 0,4% Trypan blå och Rose Bengal lösning i varje pdECM bioink med ett förhållande på 1:20, respektive.
- 3D cell Printing av multimaterial-baserade pankreasvävnad konstruktioner
- Förbered steriliserade sprutor och ett 25 G munstycke.
- Fyll på varje bioink (blått och rött) i två olika sprutor.
- Skriv ut biobläcket med optimerat utskrifts tillstånd (matningshastighet: 150 mm/min; pneumatiskt tryck: 15 kPa) vid 18 ° c i en form av ett galler med alternerande linjer av blått och rött.
- För att korslänka biobläcket, placera den tryckta konstruktionen i inkubatorn i 30 min.
- Sänk den tryckta konstruktionen i Holmen Culture media som är RPMI-1640 medium kompletterat med 10% foster bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin och 100 U/mL streptomycin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization av bukspottskörteln vävnader
Vi utvecklade processen för att förbereda pdECM bioink att ge pankreasvävnad-specifika mikromiljöer för att förbättra funktionaliteten hos holkar i en 3D bioprinted vävnad konstruera (figur 2a). Efter decellularization processen, 97,3% av dsDNA avlägsnades och representativa ECM komponenter såsom kollagen och GAGs förblev på 1278,1% och 96,9% jämfört med den inhemska pankreasvävnad, respektive (figur 2B).
Bioink beredning
För att tillämpa pdECM i tryckprocessen, var pdECM pulvret solubilized i svag syra med pepsin och neutraliseras med 10 M NaOH lösning. Den smälta pdECM-lösningen kan sedan spädas genom blandning med ett cellodlingsmedium eller 1x PBS. I denna studie, vi beredda pdECM bioink vid en slutkoncentration av 1,5% för ytterligare studier. PdECM bioink behöll en lösnings fas när den placerades under rumstemperatur och omedelbart omvandlades till en gel fas efter inkubering vid 37 ° c i 30 minuter. För att undersöka effekten av pdecm-biobläcket på kobbar inkapslades isolerade öar i pdecm-, natriumalginat-och kollagen-biobläck med en koncentration på 1,5%. Resultatet av det glukossänkande insulinsekretionstest visade kobbar i pdecm bioink utgjorde det högsta indexet (cirka 3,174) bland de experimentella grupperna, vilket indikerar högre funktionalitet jämfört med de allmänt tillämpade hydrogelerna för Holmen inkapsling5.
Reologisk analys
Viskositet är en av de kritiska egenskaperna när man överväger en utskrivbar biomaterial. Vi uppmätt viskositet pdecm bioink med en frekvens som sträcker sig från 1 till 1 000 Hz vid 15 ° c för tryckning av olika decm bioinks6,7,8. Den pdECM bioink visade skjuvning-gallring beteende och värdet var cirka 10 pa · s vid skjuvning hastighet av 1/s, vilket indikerar pdECM bioink hade lämpliga rheologiska egenskaper för extrudering genom ett munstycke (figur 3a). Gelationen kinetik på en temperatur som spänner från 4 till 37 ° c indikerade gelationuppförandet av pdecm bioink på fysiologiskt relevant temperaturer. Den komplexa Modulus började öka när temperaturen nådde 15 ° c, och det ökade snabbt när temperaturen upprätthölls vid 37 ° c, vilket indikerar sol-gel övergången av pdECM bioink (figur 3B). Den dynamiska G "och G" av pdECM bioink undersöktes vid fysiologiskt relevanta temperaturer för att säkerställa dess stabilitet efter tryckprocessen, vilket resulterade i att ha en stabil Modulus under frekvens svep villkoret (figur 3C).
3D-cell utskrift
3D cell-lastat pankreasvävnad konstruktioner var fabricerade med hjälp av en microextrudering-baserade utskriftsprocessen. För att bygga en konstruktion som innehåller minst 3 000 ö-ekvivalenter (IEQ), som motsvarar vävnads volymen av en perfekt sfärisk holme med en diameter på 150 μm9, konstruerade vi konstruktionen med en dimension av 10 mm x 10 mm x 3 mm (figur 4a). Processparametrarna och villkoren för tryckning av pankreasöar valdes ut för att kapsla in öar, som är stora cellulära kluster i storlekar på mellan 100-250 μm i diameter (figur 4B). Med hjälp av en multi-Head utskriftssystem, olika typer av 3D konstruktioner-såsom formen på gallret har alternativa linjer av blått och rött-var fabricerade med hjälp av den utvecklade pdecm (figur 4C), som anger mångsidigheten hos pdecm för 3D bioprinting att harmonisera två eller flera typer av levande celler i en vävnad-liknande arrangemang.
Figur 1: Schematisk utveckling av decellularized pankreasvävnad, utvärdering av pdECM bioink och tillverkning av 3D pankreasvävnad konstruktioner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa bilder av decellulariseringsprocessen och biokemisk karakterisering av pdECM. (A) översikt av decellularization av svin bukspottskörteln vävnad. B) resultat av biokemiska analyser av inhemsk vävnad och pdECM. Felstaplar visar standardavvikelse. Copyright (2019) Kungliga sällskapet för kemi5. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Reologisk analys av pdECM-bioink. (A) viskositet pdECM och kollagen bioinks som uppvisade skjuvning gallring beteende. B) gelationskinetik för pdECM och kollagen bio bläck vid temperaturförändring. Cden komplexa Modulus av tvärbunden pdECM och kollagen bioinks. Copyright (2019) av Kungliga sällskapet för kemi5. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:3D cell utskrift av cell-lastat pdECM bioink för 3D pankreasvävnad konstruktioner. (A) dimensionerna av 3D pankreasvävnad konstruktioner. (B) bukspottskörteln Holmen-Laden och (C) multimaterial-baserade 3D pankreasvävnad konstruktioner. Copyright (2019) av Kungliga sällskapet för kemi5. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskrev utvecklingen av pdECM bioinks och tillverkning av 3D pankreasvävnad konstruktioner med hjälp av 3D-cell trycktekniker. Att recapitulate mikromiljön av målvävnaden i 3D-Engineered vävnad konstruera, valet av bioink är kritisk. I en tidigare studie, vi validerade att vävnads-specifika dECM bioinks är fördelaktigt att främja stamcells differentiering och proliferation10. Jämfört med syntetiska polymerer, dECM kan fungera som en cell-gynnsam miljö på grund av vävnads-specifik sammansättning och arkitektur11. Därför bör decellularization processen allvarligt övervägas för hög retention av viktiga komponenter i dECM.
Urvalet av olika rengöringsmedel för decellularization av pankreasvävnad varierar resterande ECM beståndsdelen12. I processen för decellularization, märkte vi att användningen av natriumdodecyl sulfate (SDS) kan påverka förlusten av ECM proteiner13. Därför ändrade vi vårt tidigare protokoll genom att eliminera steget för behandling av SDS-lösning, som är en jonisk tensid används i många rengörings-och decellularization processer med relativt hårda egenskaper jämfört med andra som trion-X 100, eller 3-[(3-cholamidopropyl) dimetyl-lammonio] -1-propanesulfonat (käkar). I detta protokoll använde vi 1% Triton-X 100 lösning för 84 h istället för SDS lösning, som kunde ta bort de cellulära komponenterna effektivt samtidigt som det bevarar GAGs och kollagenous proteiner. Dessutom noterade vi att avlägsnande av restlipider genom att behandla med IPA är också en mycket viktig process för att inducera tvärbindningen av pdECM bioink och det kan förstås i samma sammanhang som en tidigare publicerad artikel4. Behandling med Perättiksyra lösning tillämpades också för sterilisering av decellularized vävnad. Dessutom är avlägsnande av kvarvarande rengöringsmedel och kemikalier i avfettad vävnad ett viktigt steg för att förhindra den inflammatoriska värd svar. Vi diskuterade emellertid inte denna fråga i detta protokoll. Protokoll som innehåller en sanering process i slutet av decellularization kommer att förbättra biokompatibilitet av decellularized materialet. Dessutom bör standarder för utvärderingskriterier övervägas för att säkerställa att tvätt-och rengöringsmedel och kemikalier avlägsnas helt.
Nedbrytningen av pdECM bioink med pepsin utfördes för att uppnå en homogen blandning av pdECM pulver i den sura lösningen genom klyvning av telopeptidregionen i det kollagenösa proteinet. I pH-justeringen, att hålla pdECM bioink på isen är avgörande för bevarandet av gelation. Efteråt kan vi producera fysiskt tvärbindningsbara pdECM pre-gel bioinks som kan komma in i en gel tillstånd genom inkuberande vid 37 ° c, vilket är en av de främsta fördelarna med dECM-baserade bioinks. Valet av rätt koncentration av pdECM-biobläcket är också viktigt10. En idealisk bioink bör skydda celler från yttre skador som uppstår under tryckprocessen som pneumatiskt tryck och temperaturförändring. Det är känt att den tillämpade skjuvkraften kan orsaka skador på cellerna och reducera cellernas lönsamhet i de tryckta konstrukterna10. Också, förbättra koncentrationer av bioink kan inducera celldöd5. Låga koncentrationer av bioink inducerar däremot låg viskositet vilket innebär dålig tryckbarhet och form återgivning vid tryckning. Det är nödvändigt att kontrollera viskositeten hos bioink och optimera dess koncentration.
För närvarande studerar forskarna aktivt utvecklingen av olika typer av vävnad-härledda bioinks för utskrift 3D vävnad konstruktioner14,15,16. Resultaten av dessa studier tyder på att bioink kan ge vävnads-specifika mikromiljöer för celler. Dessa unika förhållanden kan främja differentiering eller mognad av stamceller och spridningen av celler. Dessutom, utnyttja multi-Head utrustade 3D-cell-Printing System gör det möjligt att skriva ut flera typer av bioinks med hög precision samtidigt. Med denna teknik kan en struktur med ett specifikt mönster produceras, vilket visar design mångsidighet. Dessutom är det möjligt att kapsla in olika typer av celler i varje bioink att efterlikna Native cell arrangemang17. Dessa mönstrade strukturer kan utnyttjas i induktion av vaskularisering eller co-Culture effekt genom att förbättra cell-till-cell interaktioner, vilket kan vara nyckelfaktorer i den långsiktiga överlevnaden av specifika celler18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bio & medicinsk teknik utvecklingsprogram för National Research Foundation (NRF) som finansieras av den koreanska regeringen (MSIT) (2017M3A9C6032067) och "IKT Consilience Creative program" (IITP-2019-2011-1-00783) övervakas av IITP (Institute for information & planering av kommunikationsteknik & utvärdering).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C.
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M.
