Summary
مصفوفة خارج الخلية المكررة (dECM) يمكن ان توفر العظة البيئية الدقيقة مناسبه لتلخيص الوظائف المتاصله في الانسجه المستهدفة في بناء هندسيا. توضح هذه المقالة البروتوكولات الخاصة بالتقطير الوراثي لأنسجه البنكرياس ، وتقييم الحبر الحيوي dECM المشتق من انسجه البنكرياس ، وإنشاء انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيه القرصنة البيولوجية.
Abstract
زرع الجزر البنكرياس هو علاج واعده للمرضي الذين يعانون من النوع 1 مرض السكري يرافقه نقص السكر في الكبد والمضاعفات الثانوية. ومع ذلك ، زرع جزيرة لا يزال لديها العديد من القيود مثل انخفاض القدرة علي البقاء من الجزر المزروعة بسبب الفقراء جزيرة البيئة المحيطة وعدائيه. الاضافه إلى ذلك ، الخلايا المنتجة للانسولين المتمايزة من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان لديها قدره محدوده علي إفراز الهرمونات الكافية التي يمكن ان تنظم مستوي الجلوكوز في الدم. ولذلك ، فان تحسين النضج عن طريق الخلايا مع العظة المناسبة البيئية الدقيقة مطلوب بشده. في هذه المقالة ، ونحن توضيح البروتوكولات لاعداد مصفوفة الخلايا السرطانية المشتقة من انسجه البنكرياس (pdECM) بيونك لتوفير البيئة الدقيقة المفيدة التي يمكن ان تزيد من حساسية الجلوكوز من الجزر البنكرياس ، تليها وصف العمليات الخاصة بإنشاء انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيه القرصنة المجهرية المستندة إلى الميكروبثق.
Introduction
في الاونه الاخيره ، يعتبر زرع جزيرة البنكرياس علاجا واعدا للمرضي الذين يعانون من مرض السكري من النوع 1. السلامة النسبية والحد الأدنى من الغزو من الاجراء هي مزايا كبيره لهذا العلاج1. ومع ذلك ، لديها العديد من القيود مثل معدل النجاح المنخفض لعزل الجزر والآثار الجانبية للادويه المثبطة للمناعة. علاوة علي ذلك, ينخفض الرقم من [اينغرتد] جزائر باطراد بعد عمليه زرع واجبه إلى البيئة عدائيه2. وقد تم تطبيق العديد من المواد الحيوية المتوافقة مثل الجينات ، الكولاجين ، بولي (حمض اللاكتيك-شارك-غليكوليك) (PLGA) أو البولي إيثيلين غليكول (PEG) لزرع جزيرة البنكرياس للتغلب علي هذه الصعوبات.
تظهر تقنيه الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد في هندسه الانسجه نظرا لإمكاناتها الكبيرة وأداءها العالي. وغني عن القول ان الأحبار الحيوية معروفه بأنها مكونات هامه لتوفير بيئة دقيقه مناسبه وتمكين تحسين العمليات الخلوية في تراكيب الانسجه المطبوعة. ويستخدم علي نطاق واسع عدد كبير من الهلام المائي ترقق القص مثل الليفينات ، الجينات ، والكولاجين والأحبار الحيوية. ومع ذلك ، تظهر هذه المواد نقص الهيكلية والكيميائية والبيولوجية والميكانيكية التعقيد مقارنه مع مصفوفة خارج الخلية (ECM) في الانسجه الاصليه3. الإشارات البيئية الدقيقة مثل التفاعلات بين الجزر الصغيرة و ECM هي إشارات هامه لتعزيز وظيفة الجزر. يمكن ان يعيد التركيب النوعي النسيجي لمكونات ECM المختلفة ، بما في ذلك الكولاجين ، الغليكوسامينوجليكانز ، والبروتينات السكرية (dECM). علي سبيل المثال ، الجزر الاساسيه التي تحتفظ ECMs الطرفية (علي سبيل المثال ، النوع الأول ، الثالث ، الرابع ، الخامس ، والسادس الكولاجين ، laminin ، وفيبروكتين) تظهر منخفضه المبرمج وحساسية الانسولين أفضل ، مما يدل علي ان التفاعلات خليه مصفوفةالانسجهالخاصة مهمة لتعزيز قدرتها علي العمل
في هذه الورقة ، نقوم بتوضيح البروتوكولات الخاصة باعداد مصفوفة الخلايا السرطانية المشتقة من انسجه البنكرياس (pdECM) لتوفير الإشارات البيئية الدقيقة المفيدة لتعزيز نشاط ووظائف الجزر البنكرياس ، تليها عمليات توليد انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيه القرصنة المجهرية (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع انسجه البنكرياس الخنازير من مسلخ محلي. تمت الموافقة علي التجارب الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من مركز أسان الطبي ، سيول ، كوريا.
1-التقطير النسيجي
- اعداد الحلول الخاصة بالتقطير.
ملاحظه: يتم تخفيف 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) المستخدمة في جميع الاستعدادات الحل عن طريق أضافه الماء المقطر إلى 10x تلفزيوني.- ل 1 ٪ تريتون-X حل 100 ، تذوب 100 مل من 100 ٪ تريتون-X 100 حل في 900 mL من 1x تلفزيوني باستخدام شريط المغناطيسي ضجة مع التحريك في 150 rpm ل 6 ح. جعل 400 mL من 1 ٪ تريتون-X حل 100 مع 40 مل من 10 ٪ تريتون-X 100 الحل و 360 مل من 1x [ببس] أعدت فقط قبل استعمال.
ملاحظه: يمكن تخزين حل 10 ٪ تريتون-X 100 في درجه حرارة الغرفة حتى الحاجة. - لمحلول حمض البيروكسي 0.1 ٪ ، تمييع 8.5 مل من حمض البيرواستيك 4.7 ٪ إلى 22.8 مل من الايثانول 70 ٪ مع 368.7 مل من الماء المقطر فقط قبل الاستخدام.
- ل 1 ٪ تريتون-X حل 100 ، تذوب 100 مل من 100 ٪ تريتون-X 100 حل في 900 mL من 1x تلفزيوني باستخدام شريط المغناطيسي ضجة مع التحريك في 150 rpm ل 6 ح. جعل 400 mL من 1 ٪ تريتون-X حل 100 مع 40 مل من 10 ٪ تريتون-X 100 الحل و 360 مل من 1x [ببس] أعدت فقط قبل استعمال.
- أزاله الانسجه الطرفية من البنكرياس وشريحة الانسجه قبل التقطير.
- غسل البنكرياس الخنازير التي تم تقسيمها مع تشغيل مياه الصنبور وأزاله الانسجه الطرفية باستخدام مقص معقم.
- نقل البنكرياس إلى كيس من البلاستيك مع ملقط وتجميد في-80 درجه مئوية لمده 1 ساعة للمساعدة في خفض البنكرياس بشكل فعال للخطوة التالية.
- شريحة البنكرياس المجمدة في 1 مم قطعه سميكه باستخدام مبشره.
- نقل 50 غرام من الانسجه المقطعة إلى حاويه بلاستيكية 500 mL.
ملاحظه: ويوصي الحاويات البلاستيكية مع غطاء هنا لحماية الانسجه من التلوث ومنع التبخر الحل.
- العلاج مع الكواشف.
ملاحظه: يجب ان تتم عمليه التقطير بأكملها في 4 درجه مئوية علي شاكر المدارية الرقمية في 150 دوره في الدقيقة. في جميع خطوات التقطير ، مطلوب مفرزه الجسدية باستخدام ملقط لمنع شرائح البنكرياس من التصاق معا. غسل الحاوية مع الماء المقطر ضروري لأزاله الكواشف المتبقية تماما في الحاوية.- قبل اي علاج الكاشف ، وغسل 50 غرام من شرائح البنكرياس مع 300 mL من الماء المقطر باستخدام شاكر.
- يحرك النسيج بشكل مستمر في 150 لفه في الدقيقة حتى يختفي الماء الغائم (بعد حوالي 12 ساعة). استبدل الماء المقطر كل 2 ساعة.
ملاحظه: ينصح بتغيير الماء المقطر كل ساعة لكفاءة أزاله المياه الغائمة بسرعة أكبر. - تجاهل الماء وعلاج 50 غرام من الانسجه مع 400 مل من 1 ٪ تريتون-X 100 في 1x الحل بالنسبة 84 ح. تحديث الحل كل 12 ساعة.
ملاحظه: عند هذه النقطة ، سينخفض مقدار الانسجه بسبب بدء أزاله المكونات الخلوية. - علاج مع 400 مل من ايزوبروبانول (IPA) ل 2 ح لأزاله الدهون المتبقية من البنكرياس.
ملاحظه: من الطبيعي ان يصبح النسيج صعبا بسبب أزاله الدهون في هذه العملية. - بعد 2 ح ، وأزاله IPA وغسل الانسجه مع 400 مل من 1x تلفزيوني ل 24 ح. تحديث التلفزيوني 1x كل 12 ساعة.
- لتعقيم الانسجه المكررة ، وتجاهل الحل السابق وعلاج مع 400 مل من 0.1 ٪ حمض البيرواستيك في الايثانول 4 ٪ لمده 2 ساعة.
- لأزاله المنظفات المتبقية ، وغسل الانسجه مع 400 mL من 1x تلفزيوني ل 6 ح. تحديث الحل كل 2 ح.
- جمع الانسجه المكررة في أنبوب مخروطي 50 مل مع ملقط.
- تجميد العينة في-80 درجه مئوية ل 1 ح. تغطيه الأنبوب المخروطي مع مسحه خاليه من الوبر بدلا من الغطاء والإصلاح مع الشريط المطاطي لتحقيق التجميد الفعال.
- التجفيف بالتجميد الانسجه المكررة في-50 درجه مئوية ل 4 د.
ملاحظه: بالنسبة للخطوة 1.3 ، 1 غرام من الانسجه غير المكررة يجب أيضا ان يكون تجميد المجففة في ظل نفس الظروف.
2. تقييم الانسجه المكررة
ملاحظه: لتقييم الكمية المتبقية من dsDNA ، الغليكوسامينوجليكانز (الكمامات) ، والكولاجين في الانسجه المكررة مقارنه بالانسجه الاصليه ، لا يقل عن 1 غرام من كل من الانسجه غير المكررة (الانسجه الاصليه) والانسجه المكررة مطلوبه لأحد دفعه من التقييم. يمكن حساب كميه dsDNA ، الكمامات ، والكولاجين علي أساس الوزن الجاف للانسجه.
- اعداد حلول لاختبارات الكيمياء الحيوية.
- اعداد الحل بابين لهضم العينة.
ملاحظه: يمكن تعديل مقدار المخزن المؤقت الذي سيتم وفقا لعدد العينات.- حل 119 ملغ من 0.1 فوسفات الصوديوم M (أحادي) ، 18.6 ملغ من 0.5 mM Na2 ، و 8.8 ملغ من 5 مم السيستين-HCl في 10 مل من المياه المعقمة.
- ضبط درجه الحموضة من الحل إلى 6.5 عن طريق أضافه 10 M NaOH الحل.
- أضافه 125 μl من 10 mg/mL الحل الأسهم بابين إلى الحل أعلاه ودوامه ، والسماح لكل عنصر لخلط بالتساوي.
- اعداد حلول لفحص ثنائي ميثيل الميثيلين الأزرق (DMMB).
- لجعل صبغ DMMB ، تذوب 8 ملغ من 1 ، 9-ثنائي ميثيل ميثيلين الأزرق الزنك كلوريد الملح المزدوج ، 1.52 غرام من الجليسين ، و 1.185 غرام من كلوريد الصوديوم في 500 mL من المياه المعقمة. ضبط درجه الحموضة إلى 3 عن طريق أضافه 0.5 M HCl الحل في حين قياس التغير في درجه الحموضة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني اعلي مقاعد البدلاء. ثم ، تصفيه هذا من خلال فلتر فراغ زجاجه 500 mL الأعلى.
- جعل 15 μL من 10 ملغ/مل كبريتات الكوندرويتين A حل للمعيار.
- اعداد الحلول لفحص هيدروكسي برولين.
- لحل الكلورامين العمل ، حل 2.4 غرام من خلات الصوديوم ، 1 غرام من حامض الستريك ، و 0.68 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في 24 مل من الماء المقطر وأضافه 240 μL من حمض الخليك الجليدية ، 10 μL من تولوين ، و 6 مل من IPA.
ملاحظه: حل جميع مساحيق في الحل باستخدام خلاط دوامه. ويمكن تخزين محلول الكلورامين العمل في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى ثلاثه أشهر. - لمحلول الكلورامين T ، حل 0.35 غرام من الكلورامين T في 20 مل من محلول الكلورامين العمل وأضافه 2.5 مل من IPA. دوامه لخلط جميع المكونات.
ملاحظه: تحضير مباشره قبل الاستخدام. - ل P-داب الحل ، ووضع 3.75 غرام من ف-داب في 6.5 مل من حمض البيروكلوريك و 15 مل من IPA ؛ التفاف عليه في رقائق ألومنيوم.
ملاحظه: تحضير مباشره قبل الاستخدام.
- لحل الكلورامين العمل ، حل 2.4 غرام من خلات الصوديوم ، 1 غرام من حامض الستريك ، و 0.68 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في 24 مل من الماء المقطر وأضافه 240 μL من حمض الخليك الجليدية ، 10 μL من تولوين ، و 6 مل من IPA.
- اعداد الحل بابين لهضم العينة.
- أضافه 1 مل من محلول بابين إلى 10 ملغ من الانسجه المجففة في أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL ودوامه أنبوب لهضم أفضل العينة.
- وضع 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي في رف المطاط وهضم العينات في الكاس 500 mL الذي يحتوي علي 300 mL من الماء في 60 درجه مئوية لمده 16 ساعة.
- جهاز الطرد المركزي في 9,500 x g لمده 20 دقيقه ، وجمع supernatant ، ونقله إلى أنبوب جديد.
- تحديد كميه الحمض النووي المتبقي والبروتينات الرئيسية في الانسجه المكررة.
- تحميل 1 μL من عينه هضمها في مطياف وقياس كميه dsDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظه: يجب علي المجرب ربط شعرهم مره أخرى وارتداء قناع لتجنب تلويث العينة.
- تحميل 1 μL من عينه هضمها في مطياف وقياس كميه dsDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- اجراء فحص DMMB لقياس كميه الكمامات التي لا تزال في الانسجه المكررة.
- مزيج 1 μL من كبريتات الكوندرويتين A حل و 499 μL من 1x تلفزيوني لجعل المعايير. تمييع كبريتات الكوندرويتين A حل مع الماء المقطر في تركيزات من 0, 4, 8, 12, 16, و 20 ميكروغرام/مل.
- تحميل تريبليكاتيس من 50 μl من كل تركيز من العينات القياسية وهضمها في لوحه 96-حسنا.
- أضافه 200 μL من صبغ DMMB لكل بئر باستخدام ماصه متعددة القناات.
- قراءه علي الفور الامتصاص في 525 nm علي قارئ اللوحة الدقيقة.
- اجراء فحص هيدروكسيبرولاين لقياس كميه الكولاجين.
- لاجراء فحص هيدروكسيبرولين ، احتضان 250 μL من عينه هضمها مع كميات متساوية من HCl في 120 درجه مئوية ل 16 ساعة.
- تجفيف بقايا في درجه حرارة الغرفة لمده 3 ساعات لتبريد العينات ومن ثم أعاده حل العينات في 1 مل من 1x تلفزيوني.
- جهاز الطرد المركزي في 2,400 x g ل 10 دقيقه في 4 °c.
- اعداد 100 ميكروغرام/مل محلول هيدروكسيبرولين كمعيار.
- تمييع محلول هيدروكسيبرولين مع الماء المقطر بتركيز 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 ميكروغرام/مل للحل القياسي.
- تحميل تريبليكاتيس من 50 μl من العينات والحل القياسي في لوحه 96-حسنا.
- أضافه 50 μL من محلول الكلورامين T ثم احتضان لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- أضافه 50 μL من الحل ف-داب واحتضان لمده 30 دقيقه في 60 درجه مئوية.
ملاحظه: Aliquot في غرفه مظلمة. بعد الاضافه ، التفاف لوحه مع رقائق ألومنيوم. - احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه.
- بعد التبريد ، وقياس الامتصاص في 540 نانومتر علي قارئ ميكروبلايت.
3-اعداد الحبر الحيوي
ملاحظه: يمكن تخزين مسحوق pdecm ثابت في-80 درجه مئوية لمده سنه واحده علي الأقل. قبل تعديل الأس الهيدروجيني ، يمكن تخزين محلول pdECM المهضوم عند-20 درجه مئوية لمده شهر واحد. قبل الاستخدام ، تذويب العينة من محلول pdECM المجمدة في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها. يمكن تخزين محلول pdECM المعدل بدرجه الحموضة عند 4 درجات مئوية لمده تصل إلى أسبوع واحد. يمكن تخزين محلول pdECM المهضوم عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لبضعة أيام علي الأقل ولكن يجب الا يتجاوز أسبوعا واحدا.
- هضم التجميد المجفف pdECM مع البيبسين.
- للهضم الفعال للحبر الحيوي ، يطحن pdECM المجفف بالتجميد مع النيتروجين السائل باستخدام مدفع هاون ومدقه.
- جمع 200 ملغ من مسحوق pdECM في أنبوب مخروطي 50 mL وأضافه 20 ملغ من البيبسين و 8.4 mL من حمض الخليك 0.5 M (التركيز النهائي هو 2 w/v ٪).
- وضع شريط تحريك المغناطيسي في أنبوب مخروطي 50 mL ويحرك في 300 دوره في الدقيقة ل 96 h.
- ضبط درجه الحموضة من محلول pdECM هضمها.
ملاحظه: من أجل تجنب دبق قبل تعديل درجه الحموضة ، وينبغي اجراء هذه العملية علي الجليد.- تصفيه الجزيئات غير مهضوم في محلول pdECM باستخدام مصفاه خليه 40 μm باستخدام ماصه الازاحه ايجابيه علي الجليد للحصول علي الهضم الأمثل للأجزاء.
- أضافه 1 مل من التلفزيونية 10x ودوامه قبل استخدام NaOH.
- ضبط درجه الحموضة إلى 7 مع NaOH 10 م التحقق من درجه الحموضة مع شرائط مؤشر الأس الهيدروجيني.
ملاحظه: دوامه في كل مره يتم أضافه NaOH بحيث يتم خلط تماما الحبر الحيوي مع الكواشف الأخرى.
4. تحليل الريولوجيكال
- الاعداد التجريبي
- اعداد 1.5% (w/v) من الحبر الحيوي pdECM لتقييم خصائص الريولوجيكال.
- إنشاء هندسه لوحه مخروط 20 مم (القطر المخروطي 20 ملم مع زاوية 2 °) في وضع التحكم في المعدل لمقياس الرطوبة.
- قم بإنشاء تسلسلات تجريبية في البرنامج المثبت (trios) لقياس اللزوجة ، وحركيه دبق ، والمعامل الديناميكي للحبر الحيوي pdecm.
- اللزوجة: ضع الحبر الحيوي pdECM علي اللوحة. قياس اللزوجة المعقدة (Pa · s) من pdECM بيونك تحت معدل القص المتزايد من 1 إلى 1,000 s-1 في درجه حرارة ثابته من 15 درجه مئوية.
- حركيه gelation: وضع الحبر الحيوي pdECM علي لوحه. احسب المعامل المعقد (G *) عن طريق قياس معامل التخزين والخسارة الخاص بالحبر الحيوي pdECM عند 4-37 درجه مئوية بمعدل زيادة تزايدي يبلغ 5 درجات مئوية/دقيقه (وضع الاجتياح الزمني).
- المعامل الديناميكي: ضع الحبر الحيوي pdECM علي لوحه في 37 درجه مئوية لمده 60 دقيقه قبل القياس. قياس معامل التخزين المعتمد علي التردد (G ') ومعامل الخسارة (G ') من الحبر الحيوي pdECM في نطاق 0.1-100 راد/ثانيه في سلاله 2 ٪.
5.3D الطباعة الخلية من انسجه البنكرياس يبني باستخدام جزيرة
- اعداد الجزر المنعزلة
- عزل الجزر الاساسيه من الفئران وفقا للبروتوكولات الموصوفة في العمل السابق5.
- لفصل الحطام والخلايا الميتة من جزيرة معزولة ، وتمرير تعليق الخلية من خلال مصفاه خليه 70 μm. تعتبر الجزر الصغيرة ذات القطر الأصغر من 70 ميكرومتر ميتة أو غير طبيعيه.
- تعليق الجزر المعزولة في RPMI-1640 المتوسطة ووضعها علي طبق بتري. أزاله الجزر أكبر من 300 μm في القطر باستخدام ماصه حجم P200 تحت المجهر (4x عدسه الهدف) في مجلس السلامة الاحيائيه.
- جزيرة التغليف في الحبر الحيوي pdECM
- اعداد الأس الهيدروجيني المعدلة pdECM الحبر الحيوي وجزيرة معزولة.
ملاحظه: لتجنب دبق قبل تعديل درجه الحموضة ، يجب ان يتم تنفيذ هذه العملية علي الجليد. - امزج برفق الحبر الحيوي pdECM والوسائط المعلقة مع الجزر (النسبة 3:1) باستخدام ماصه الازاحه الموجبة حتى تمتزج بشكل متجانس.
ملاحظه: التركيز النهائي للحبر الحيوي pdECM هو 1.5 ٪ وكثافة الخلايا في الحبر الحيوي pdECM هو 3,000 IEQ/mL.
- اعداد الأس الهيدروجيني المعدلة pdECM الحبر الحيوي وجزيرة معزولة.
- 3D الطباعة الخلية من يبني انسجه البنكرياس
- اعداد حقنه معقمه و 22 G فوهه.
ملاحظه: تم تحديد هذا المقياس لطباعه الجزر التي يبلغ قطرها 100-250 μm. - تحميل جزيرة لادن pdECM بيونك في الحقنه.
- اطبع الحبر الحيوي مع حاله الطباعة المحسنة (معدل التغذية: 150 مم/دقيقه ؛ الضغط الهوائي: 15 كيلو باسكال) عند 18 درجه مئوية في شكل شعريه.
- للربط بين الحبر الحيوي ، ضع البناء المطبوع في الحاضنة لمده 30 دقيقه.
- تزج بناء المطبوعة في وسائل الاعلام جزيرة الثقافة التي هي RPMI-1640 المتوسطة تستكمل مع 10 ٪ الجنين البقري المصل (ار بي) ، 100 U/mL البنسلين و 100 اليورانيوم/mL ستربتوميسين.
- اعداد حقنه معقمه و 22 G فوهه.
6.3D الطباعة الخلية من بناء البنكرياس مع هيكل منقوشة
- اعداد نوعين من الحبر الحيوي
- للتحقق من براعة الطباعة باستخدام الأحبار الحيوية متعددة ، واعداد مجموعتين من الأحبار الحيوية pdECM ووصمه عار لهم عن طريق أضافه 0.4 ٪ تريان الأزرق وارتفع البنغال الحل في كل pdECM bioinks بنسبه 1:20 ، علي التوالي.
ملاحظه: لتجنب دبق قبل تعديل درجه الحموضة ، وينبغي اجراء هذه العملية علي الجليد. - امزج برفق الحبر الحيوي pdECM والوسائط المعلقة مع الجزر (النسبة 3:1) باستخدام ماصه الازاحه الموجبة حتى تمتزج بشكل متجانس.
ملاحظه: التركيز النهائي للحبر الحيوي pdECM هو 1.5 ٪ وكثافة الخلايا في الحبر الحيوي pdECM هو 3,000 IEQ/mL.
- للتحقق من براعة الطباعة باستخدام الأحبار الحيوية متعددة ، واعداد مجموعتين من الأحبار الحيوية pdECM ووصمه عار لهم عن طريق أضافه 0.4 ٪ تريان الأزرق وارتفع البنغال الحل في كل pdECM bioinks بنسبه 1:20 ، علي التوالي.
- الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد لتركيبات انسجه البنكرياس المستندة إلى الأساس القضائي
- اعداد المحاقن المعقمة وفوهه 25 G.
- تحميل كل الحبر الحيوي (الأزرق والأحمر) في اثنين من المحاقن المختلفة ، علي التوالي.
- اطبع الحبر الحيوي مع حاله الطباعة المحسنة (معدل التغذية: 150 مم/دقيقه ؛ الضغط الهوائي: 15 كيلو باسكال) عند 18 درجه مئوية في شكل شعريه بخطوط متناوبه من اللونين الأزرق والأحمر.
- للربط بين الحبر الحيوي ، ضع البناء المطبوع في الحاضنة لمده 30 دقيقه.
- تزج بناء المطبوعة في وسائل الاعلام جزيرة الثقافة التي هي RPMI-1640 المتوسطة تستكمل مع 10 ٪ الجنين البقري المصل (ار بي) ، 100 U/mL البنسلين و 100 اليورانيوم/mL ستربتوميسين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التقطير من انسجه البنكرياس
طورنا عمليه اعداد الحبر الحيوي pdECM لتوفير بيئات مجهريه خاصه بانسجه البنكرياس لتعزيز وظائف الجزر الصغيرة في بناء الانسجه البيولوجية ثلاثية الابعاد (الشكل 2ا). بعد عمليه التقطير ، تمت أزاله 97.3% من dsDNA وبقيت مكونات ECM التمثيلية مثل الكولاجين والكمامات عند 1278.1% و 96.9% مقارنه بانسجه البنكرياس الاصليه ، علي التوالي (الشكل 2ب).
اعداد الحبر الحيوي
لتطبيق pdECM في عمليه الطباعة ، تم أذابه مسحوق pdECM في حمض ضعيف مع البيبسين وتحييدها باستخدام الحل NaOH 10 M. ويمكن بعد ذلك تخفيف الحل pdECM هضمها من خلال الاختلاط مع ثقافة الخلية المتوسطة أو 1x تلفزيوني. في هذه الدراسة ، أعددنا pdECM بيونك في تركيز النهائي من 1.5 ٪ لمزيد من الدراسة. الحبر الحيوي pdECM الحفاظ علي مرحله الحل عندما وضعت تحت درجه حرارة الغرفة وتحويلها علي الفور إلى مرحله هلام بعد الحضانة في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. للتحقيق في تاثير الحبر الحيوي pdECM علي الجزر ، تم تغليف الجزر المعزولة في pdECM ، الجينات والكولاجين الحيوي بتركيز 1.5 ٪. وأظهرت نتيجة اختبار إفراز الانسولين الذي يحفز الجلوكوز الجزر الكبيرة في الحبر الحيوي pdECM تمثل اعلي مؤشر (حوالي 3.174) بين المجموعات التجريبية ، مما يدل علي وظائف اعلي علي الهلام المائي تطبيقها علي نطاق واسع لتغليف جزيرة5.
تحليل الريولوجيه
اللزوجة هي واحده من الخصائص الحاسمة عند النظر في الكيمياء الحيوية للطباعة. نقيس اللزوجة من الحبر الحيوي pdecm في تردد تتراوح بين 1 إلى 1,000 هرتز في 15 درجه مئوية للطباعة المختلفة decm الأحبار الحيوية6،7،8. وأظهرت الحبر الحيوي pdECM القص-ترقق السلوك وكانت القيمة ما يقرب من 10 باسكال · s في معدل القص من 1/ثانيه ، مما يدل علي الحبر الحيوي pdECM كان الخصائص الريولوجيه المناسبة لقذف من خلال فوهه (الشكل 3ا). وأشارت حركيه دبق في درجه حرارة تتراوح بين 4 إلى 37 درجه مئوية سلوك دبق من الحبر الحيوي pdecm في درجات الحرارة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. وبدات المعامل المعقدة في الزيادة عندما وصلت درجه الحرارة إلى 15 درجه مئوية ، وزادت بسرعة عندما تم الحفاظ علي درجه الحرارة عند 37 درجه مئوية ، مما يشير إلى انتقال سول-جل من الحبر الحيوي pdECM (الشكل 3ب). تم التحقيق في ديناميات G ' و G "من pdECM bioink في درجات الحرارة ذات الصلة فسيولوجيا لضمان استقرارها بعد عمليه الطباعة ، مما ادي إلى وجود معامل مستقره تحت حاله اكتساح التردد (الشكل 3ج).
الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد
تم تصنيع تراكيب انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام عمليه الطباعة المستندة إلى النتوء المجهري. لبناء البناء الذي يحتوي علي ما لا يقل عن 3,000 جزيرة مكافئه (IEQ) ، الذي يتوافق مع حجم الانسجه من جزيرة كرويه تماما مع قطرها 150 μm9، ونحن تصميم بناء مع بعد من 10 ملم × 10 ملم × 3 ملم (الشكل 4ا). تم اختيار معلمات العملية والشروط الخاصة بطباعه الجزر البنكرياس لتغليف الجزر الكبيرة ، والتي هي مجموعات خلوية كبيره في احجام تتراوح بين 100-250 ميكرومتر في القطر (الشكل 4ب). باستخدام نظام الطباعة متعدد الرؤوس ، وأنواع مختلفه من ثوابت 3d-مثل شكل شعريه وجود خطوط بديله من الأزرق والأحمر-ملفقه باستخدام pdecm المتقدمة (الشكل 4ج) ، مما يدل علي براعة pdecm لغرض القرصنة البيولوجية 3d لمواءمه نوعين أو أكثر من الخلايا الحية في ترتيب مثل الانسجه.
الشكل 1: تخطيطي لتطوير انسجه البنكرياس المكررة ، وتقييم الحبر الحيوي pdECM وتصنيع النسيج البنكرياس 3d يبني. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الصور التمثيلية لعمليه التقطير والتوصيف البيوكيميائي لل pdECM. (ا) نظره عامه علي التقطير من انسجه البنكرياس الخنازير. (ب) نتائج الفحوصات البيوكيميائية للانسجه الاصليه والانسجه المحلية. تظهر أشرطه الخطا الانحراف المعياري. حقوق التاليف والنشر (2019) الجمعية الملكية للكيمياء5. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل الريولوجيكال للحبر الحيوي pdECM. (ا) لزوجه pdECM والأحبار الحيوية الكولاجين التي أظهرت سلوك ترقق القص. (ب) حركيه gelation من pdECM والأحبار الحيوية الكولاجين اثناء تغير درجه الحرارة. (ج) المعامل المعقد لل pdECM المتداخلة والأحبار الحيوية للكولاجين. حقوق التاليف والنشر (2019) من الجمعية الملكية للكيمياء5. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد من الحبر الحيوي pdECM الخلوي لتركيبات انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد. (ا) ابعاد نسيج البنكرياس 3d. (ب) البنكرياس الذي لادن و (ج) يبني انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد. حقوق التاليف والنشر (2019) من الجمعية الملكية للكيمياء5. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصف هذا البروتوكول تطور الأحبار الحيوية pdECM وتصنيع انسجه البنكرياس ثلاثية الابعاد باستخدام تقنيات الطباعة الخلوية ثلاثية الابعاد. لتلخيص البيئة المجهرية للانسجه المستهدفة في بناء الانسجه المهندسة ثلاثية الابعاد ، يعتبر اختيار الحبر الحيوي أمرا حاسما. في دراسة سابقه ، قمنا بالتحقق من ان الأحبار الحيوية dECM الخاصة بالانسجه مفيده لتعزيز تمايز الخلايا الجذعية والانتشار10. بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية ، dECM يمكن ان تكون بمثابه بيئة الخلية مواتيه بسبب تكوين الانسجه الخاصة والهندسة المعمارية11. ولذلك ، ينبغي النظر بجديه في عمليه التقطير من أجل الاحتفاظ العالي بالمكونات الرئيسية في المستوي العشري.
اختيار المنظفات المختلفة للحصول علي التقطير من انسجه البنكرياس يختلف المكونة المتبقية من ECM12. في عمليه التقطير ، لاحظنا ان استخدام كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) يمكن ان تؤثر علي فقدان البروتينات ECM13. التالي ، قمنا بتعديل بروتوكولنا السابق عن طريق أزاله الخطوة لعلاج الحل SDS ، وهو السطحي الايونيه المستخدمة في العديد من عمليات التنظيف والتقطير تتميز خصائص قاسيه نسبيا مقارنه مع الآخرين مثل Trion-X 100 ، أو 3-[(3-تشولاميدو بروبيل) dimethyl-لاممونو] -1 في هذا البروتوكول ، استخدمنا 1 ٪ تريتون-X 100 حل لل 84 h بدلا من حل SDS ، والتي كانت قادره علي أزاله المكونات الخلوية بشكل فعال مع الحفاظ علي الكمامات والبروتينات كولاجينيوس. الاضافه إلى ذلك ، لاحظنا ان أزاله الدهون المتبقية عن طريق التعامل مع وكاله تشجيع الاستثمار هي أيضا عمليه بالغه الاهميه للحث علي الربط بين الحبر الإحيائي pdECM ويمكن فهمها في نفس السياق مثل المادة4المنشورة سابقا. وتم أيضا تطبيق العلاج بمحلول حمض الخل لتعقيم الانسجه المنزوعة الحموضة. الاضافه إلى ذلك ، أزاله المنظفات المتبقية والمواد الكيميائية في الانسجه المكررة هو خطوه حاسمه لمنع استجابه المضيف التهابيه. ومع ذلك ، لم نناقش هذه المسالة في هذا البروتوكول. البروتوكولات التي تشمل عمليه التعقيم في نهاية التقطير ستحسن التوافق الحيوي للمادة المكررة. وعلاوة علي ذلك ، ينبغي النظر في معايير معايير التقييم لضمان أزاله المنظفات والمواد الكيميائية بالبالكامل.
تم اجراء عمليه هضم pdECM بيونك مع البيبسين لتحقيق خلط متجانسة من مسحوق pdECM في الحل الحمضية عن طريق انشقاق من منطقه المد والجزر في البروتين كولاجينيوس. في عمليه تعديل درجه الحموضة ، والحفاظ علي الحبر الحيوي pdECM علي الجليد أمر بالغ الاهميه للحفاظ علي gelation. بعد ذلك ، يمكننا ان ننتج فعليا pdECM الأحبار الحيوية قبل هلام التي يمكن ان تدخل الدولة هلام من خلال احتضان في 37 درجه مئوية ، والتي هي واحده من المزايا الرئيسية للأحبار الحيوية القائمة علي dECM. اختيار التركيز السليم من الحبر الحيوي pdECM هو أيضا مهم10. يجب ان يحمي الحبر الحيوي المثالي الخلايا من التلف الخارجي الذي يحدث اثناء عمليه الطباعة مثل الضغط الهوائي وتغيير درجه الحرارة. ومن المعروف ان قوه القص التطبيقية قد تسبب ضررا للخلايا وتقلل من قابليه الخلية للبقاء في التركيبات المطبوعة10. أيضا ، وتعزيز تركيزات الحبر الحيوي يمكن ان تحفز موت الخلايا5. وعلي النقيض من ذلك ، فان تركيزات منخفضه من الحبر الحيوي يؤدي إلى انخفاض اللزوجة مما يعني سوء الطباعة والدقة في الشكل اثناء طباعتها. فمن الضروري للتحقق من لزوجه الحبر الحيوي وتحسين تركيزها.
حاليا ، يدرس الباحثون بنشاط تطوير أنواع مختلفه من الأحبار الحيوية المشتقة من الانسجه للطباعة الانسجه 3d يبني14،15،16. وتشير نتائج هذه الدراسات إلى ان الحبر الحيوي يمكن ان يوفر بيئات مجهريه خاصه بالانسجه للخلايا. هذه الظروف الفريدة يمكن ان تعزز التمايز أو نضوج الخلايا الجذعية وتكاثر الخلايا. وعلاوة علي ذلك ، باستخدام متعددة الراس مجهزه 3D نظام الطباعة الخلوية يجعل من الممكن لطباعه أنواع متعددة من الأحبار الحيوية مع دقه عاليه في وقت واحد. باستخدام هذه التقنية ، يمكن إنتاج هيكل مع نمط معين ، التالي إظهار براعة التصميم. الاضافه إلى ذلك ، فانه من الممكن تغليف أنواع مختلفه من الخلايا في كل الحبر الحيوي لتقليد ترتيب الخلايا الاصليه17. ويمكن استخدام هذه الهياكل منقوشة في تحريض الاوعيه الدموية أو تاثير الثقافة المشتركة من خلال تحسين التفاعلات بين الخلايا ، والتي يمكن ان تكون العوامل الرئيسية في البقاء علي المدى الطويل من خلايا محدده18،19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
وقد حظي هذا البحث بدعم برنامج تطوير التكنولوجيا الطبية & البيولوجية التابع للمؤسسة الوطنية للبحوث التي تمولها الحكومة الكورية (2017M3A9C6032067) و "برنامج تكنولوجيا المعلومات والاتصال كونسيلينسي الإبداعي" (2019-2011-1-00783 IITP). تشرف عليها الرابطة (معهد المعلومات & تخطيط تكنولوجيا الاتصالات & التقييم).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
