Summary
Decellularized ekstracellulær matrix (dECM) kan give passende mikromiljø signaler til at samle de iboende funktioner af målvæv i en konstrueret konstruktion. Denne artikel belyser protokollerne til decellularization af pancreas væv, evaluering af bugspytkirtlen væv-afledte decm bioink, og generation af 3D pancreas væv konstruktioner ved hjælp af en bioprinting teknik.
Abstract
Transplantation af bugspytkirtlen Holme er en lovende behandling for patienter, der lider af type 1 diabetes ledsaget af hypoglykæmi og sekundære komplikationer. Men, ø transplantation har stadig flere begrænsninger såsom den lave levedygtighed af transplanterede Holme på grund af dårlig ø engraftment og fjendtlige miljøer. Desuden har de insulin producerende celler, der er differentieret fra humane pluripotente stamceller, begrænset evne til at udskilte tilstrækkelige hormoner, som kan regulere blodsukkerniveauet; Derfor er det stærkt påkrævet at forbedre modning ved dyrkning af celler med passende mikromiljø signaler. I denne artikel, vi belyse protokoller for at forberede en bugspytkirtel væv-afledte decellularized ekstracellulære matrix (pdECM) bioink at give en gavnlig mikromiljø, der kan øge glukose følsomhed af pancreas Holme, efterfulgt af at beskrive processerne til generering 3D pancreas væv konstruktioner ved hjælp af en microextrusion-baserede bioprinting teknik.
Introduction
For nylig, bugspytkirtel ø transplantation er blevet betragtet som en lovende behandling for patienter med type 1 diabetes. Den relative sikkerhed og minimal invasivitet af proceduren er store fordele ved denne behandling1. Men, det har flere begrænsninger såsom den lave succesrate af isolerende Holme og bivirkninger af immunosuppressive lægemidler. Desuden falder antallet af indpodede Holme støt efter transplantation på grund af det fjendtlige miljø2. Forskellige biokompatible materialer såsom alginat, kollagen, poly (mælke-Co-glycolsyre) (PLGA) eller polyethylenglycol (PEG) er blevet anvendt til pancreas-ø-transplantation for at overvinde disse vanskeligheder.
3D celle trykning teknologi er ved at dukke op i vævsteknik på grund af sit store potentiale og høj ydeevne. Det er overflødigt at sige, bioinks er kendt som vigtige komponenter til at give et egnet mikromiljø og gør det muligt at forbedre cellulære processer i trykte væv konstruktioner. Et betydeligt antal forskydningsfortyndende silicagelrogeler såsom fibrin, alginat og kollagen er almindeligt anvendt som bioinks. Men disse materialer viser en mangel på strukturel, kemisk, biologisk, og mekanisk kompleksitet i forhold til den ekstracellulære matrix (ECM) i native tissue3. Mikromiljømæssige signaler såsom samspillet mellem Holme og ECM er vigtige signaler for at forbedre funktionen af Holme. Decellularized ECM (decm) kan genskabe den vævsspecifikke sammensætning af forskellige ECM komponenter herunder kollagen, glycosaminoglycaner (gags), og glykoproteiner. For eksempel, primære Holme, der bevarer deres perifere ECMs (f. eks. type I, III, IV, V og VI kollagen, Laminin, og fibronectin) udviser lav apoptose og bedre insulinfølsomhed, hvilket indikerer, at vævsspecifikke celle-matrix interaktioner er vigtige for at øge deres evne til at fungere på samme måde som oprindelige væv4.
I dette dokument vi belyse protokoller til fremstilling af pancreas væv-afledte decellularized ekstracellulær matrix (pdecm) bioink at give gavnlige mikromiljømæssige stikord til at øge aktiviteten og funktioner af bugspytkirtlen Holme, efterfulgt af processerne til generering 3D pancreas væv konstruktioner ved hjælp af en microekstrudering-baseret bioprinting teknik (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev indsamlet svin i pancreas-væv fra et lokalt slagteri. Dyreforsøg blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Asan Medical Center, Seoul, Korea.
1. væv decellularization
- Forbered løsningerne til decellularization.
Bemærk: 1x fosfat-Buffered Saline (PBS), der anvendes i alle opløsning præparater fortyndes ved at tilføje destilleret vand til 10x PBS.- For 1% Triton-X 100 opløsning opløses 100 mL 100% Triton-X 100-opløsning i 900 mL 1x PBS ved hjælp af en magnetisk omrørings stang, der rører ved 150 rpm i 6 timer. gør 400 mL af 1% Triton-X 100 opløsning med 40 mL 10% Triton-X 100 opløsning og 360 mL 1x PBS forberedt lige før brug.
Bemærk: 10% Triton-X 100-opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur, indtil det er nødvendigt. - For 0,1% pereddikesyre opløsning fortyndes 8,5 mL 4,7% pereddikesyre til 22,8 mL 70% ethanol med 368,7 mL destilleret vand lige før brug.
- For 1% Triton-X 100 opløsning opløses 100 mL 100% Triton-X 100-opløsning i 900 mL 1x PBS ved hjælp af en magnetisk omrørings stang, der rører ved 150 rpm i 6 timer. gør 400 mL af 1% Triton-X 100 opløsning med 40 mL 10% Triton-X 100 opløsning og 360 mL 1x PBS forberedt lige før brug.
- Fjern de perifere væv i bugspytkirtlen og skær vævet før decellularization.
- Vask den generede Porcin bugspytkirtel med rindende ledningsvand og fjern de perifere væv ved hjælp af steriliseret saks.
- Overfør bugspytkirtlen til en plastikpose med tang og fryse ved-80 °C i 1 time for at hjælpe med at skære bugspytkirtlen effektivt til næste trin.
- Skær den frosne bugspytkirtel i 1 mm tykke stykker ved hjælp af en rivejern.
- Overfør 50 g af det snittede væv til en 500 mL plastikbeholder.
Bemærk: en plastikbeholder med låg anbefales her for at beskytte vævet mod kontaminering og forhindre fordampning af opløsningen.
- Behandling med reagenser.
Bemærk: hele decellulariserings processen skal udføres ved 4 °C på en digital orbital shaker ved 150 rpm. I alle decellularization trin, fysisk udstationering ved hjælp af pincet er nødvendig for at forhindre skiver af bugspytkirtlen i at holde sammen. Det er nødvendigt at vaske beholderen med destilleret vand for at fjerne de resterende reagenser helt i beholderen.- Før en reagens behandling vaskes 50 g skåret bugspytkirtel med 300 mL destilleret vand ved hjælp af en shaker.
- Omrør vævet kontinuerligt ved 150 rpm, indtil det overskyede vand forsvinder (efter ca. 12 timer). Udskift det destilleret vand hver 2 h.
Bemærk: det anbefales at ændre det destilleret vand hver time for at øge effektiviteten for at fjerne det overskyede vand hurtigere. - Kassér vandet og Behandl 50 g væv med 400 mL 1% Triton-X 100 i 1x PBS opløsning til 84 h. Opdater opløsningen hver 12 h.
Bemærk: på dette tidspunkt vil mængden af væv falde, fordi de cellulære komponenter begynder at blive fjernet. - Behandl med 400 mL isopropanol (IPA) i 2 timer for at fjerne det resterende fedt fra bugspytkirtlen.
Bemærk: det er normalt for vævet at blive hård på grund af fjernelsen af fedt i denne proces. - Efter 2 h, Fjern IPA og vask vævet med 400 mL 1x PBS for 24 h. Opdater 1x PBS hver 12 h.
- For at sterilisere det decellulariserede væv, kassere den tidligere opløsning og behandle med 400 mL 0,1% pereddikesyre i 4% ethanol for 2 h.
- For at fjerne rest vaskemiddel vaskes vævet med 400 mL 1x PBS i 6 timer. Genopfrisk opløsningen hver 2 h.
- Saml de decellularized væv i en 50 mL konisk slange med pincet.
- Prøven fastfryses ved-80 °C i 1 time. dæk det koniske rør med en fnugfri serviet i stedet for låget og Fastgør det med et gummibånd for effektiv lyofilisering.
- Lyophilize det decellulariserede væv ved-50 °C for 4 d.
Bemærk: for trin 1,3 skal 1 g ikke-decellulariseret væv også frysetørres under de samme betingelser.
2. vurdering af decellulariseret væv
Bemærk: for at evaluere restmængden af dsDNA, glykosaminoglycans (GAGs), og kollagen i den decellularized væv i forhold til indfødte væv, mindst 1 g af hver af de ikke-decellularized væv (indfødte væv) og decellularized væv er påkrævet for en batch af vurderingen. Mængden af dsDNA, GAGs og kollagen kan beregnes ud fra den tørre vægt af vævet.
- Forbered opløsninger til biokemiske analyser.
- Forbered papain opløsning til prøve fordøjelse.
Bemærk: mængden af buffer, der skal foretages, kan justeres i forhold til antallet af prøver.- 119 mg 0,1 M natriumphosphat (monobasic) opløses, 18,6 mg 0,5 mm Na2-EDTA og 8,8 mg 5 mm cystein-HCL i 10 ml autoklaveres vand.
- Juster pH-værdien af opløsningen til 6,5 ved at tilføje 10 M NaOH-opløsning.
- Tilsæt 125 μL 10 mg/mL papain stamopløsning til ovenstående opløsning og vortex, så hvert element blandes jævnt.
- Forbered opløsninger til dimethylmethylenblåt (DMMB) assay.
- For at gøre DMMB farvestof, opløses 8 mg af 1, 9-dimethyl-methylenblåt zink klorid dobbelt salt, 1,52 g glycin og 1,185 g NaCl i 500 mL autoklaveret vand. PH-værdien justeres til 3 ved at tilføje 0,5 M HCl-opløsning under måling af pH-værdien ved hjælp af en pH-måler med bænk foroven. Derefter filtreres dette gennem en 500 mL flaske-Top vakuum filter.
- Lav 15 μL 10 mg/mL Chondroitin sulfat en opløsning til standard.
- Forbered opløsninger til hydroxyprolin-assay.
- For Chloramin-arbejdsopløsningen opløses 2,4 g natriumacetat, 1 g citronsyre og 0,68 g natriumhydroxid i 24 mL destilleret vand og tilsættes 240 μL iseddike, 10 μL toluen og 6 mL IPA.
Bemærk: Opløs alle pulvere i opløsningen ved hjælp af en vortex mixer. Chloramin-arbejdsopløsning kan opbevares ved 4 °C i op til tre måneder. - For Chloramin T opløsning opløses 0,35 g Chloramin T i 20 mL Chloramin-arbejdsopløsning og tilsættes 2,5 mL IPA. Vortex til at blande alle komponenter.
Bemærk: Forbered umiddelbart før brug. - For p-DAB-opløsning sættes 3,75 g p-DAB i 6,5 ml perklorsyre og 15 ml IPA; Pak den i aluminiumsfolie.
Bemærk: Forbered umiddelbart før brug.
- For Chloramin-arbejdsopløsningen opløses 2,4 g natriumacetat, 1 g citronsyre og 0,68 g natriumhydroxid i 24 mL destilleret vand og tilsættes 240 μL iseddike, 10 μL toluen og 6 mL IPA.
- Forbered papain opløsning til prøve fordøjelse.
- Der tilsættes 1 mL papain-opløsning til 10 mg lyofiliseret væv i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, og røret hvirvlen for bedre at fordøje prøven.
- 1,5 mL mikrocentrifuge røret anbringes i et gummi stativ og fordøje prøverne i et 500 mL bægerglas, der indeholder 300 mL vand ved 60 °C i 16 timer.
- Centrifugeres ved 9.500 x g i 20 minutter, Saml supernatanten, og overfør den til et nyt rør.
- Kvantificere rest DNA og større proteiner i det decellulariserede væv.
- Læg 1 μL fordøjet prøve i spektrometer, og mål mængden af dsDNA i henhold til producentens anvisninger.
Bemærk: eksperimentatoren skal binde deres hår tilbage og bære en maske for at undgå at kontaminere prøven.
- Læg 1 μL fordøjet prøve i spektrometer, og mål mængden af dsDNA i henhold til producentens anvisninger.
- Udfør en DMMB-analyse for at kvantificere mængden af GAGs, der forbliver i den decellularized væv.
- Bland 1 μL Chondroitin sulfat en opløsning og 499 μL 1x PBS for at lave standarder. Chondroitin-sulfat fortyndes en opløsning med destilleret vand i koncentrationer på 0, 4, 8, 12, 16 og 20 μg/mL.
- Læg tre eksemplarer på 50 μL af hver koncentration af standard og fordøjet prøver i en 96-brønd plade.
- Tilsæt 200 μL af DMMB farvestof til hver brønd ved hjælp af en multi-kanal pipette.
- Absorbansen aflæses med det samme ved 525 nm på en mikropladen læser.
- Udfør en hydroxyprolin-analyse for at kvantificere mængden af kollagen.
- Til gennemførelse af en hydroxyprolin-analyse Inkuber 250 μL af den fordøjet prøve med lige store mængder HCl ved 120 °C i 16 timer.
- Rester tørres ved stuetemperatur i 3 timer for at afkøle prøverne og derefter opløse prøverne igen i 1 mL 1x PBS.
- Centrifugeres ved 2.400 x g i 10 minutter ved 4 °c.
- Forbered 100 μg/mL hydroxyprolin opløsning som standard.
- Fortyndet hydroxyprolin opløsning med destilleret vand i en koncentration på 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL for en standardopløsning.
- Læg tre eksemplarer af 50 μL af prøverne og standardopløsningen i en 96-brønd plade.
- Tilsæt 50 μL Chloramin T opløsning, og Inkuber derefter i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 50 μL p-DAB-opløsning og Inkuber i 30 min ved 60 °C.
Bemærk: aliquot i et mørkt rum. Efter tilsætning, wrap pladen med aluminiumsfolie. - Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
- Efter afkøling måles absorbansen ved 540 nm på en mikroplade læser.
3. tilberedning af bioink
Bemærk: pdECM pulver kan opbevares stabilt ved-80 °C i mindst et år. Før pH-justering kan den Ford øjede pdECM-opløsning opbevares ved-20 °C i en måned. Før brug tø prøven af frossen pdECM-opløsning ved 4 °C natten over. Den pH-justerede pdECM-opløsning kan opbevares ved 4 °C i op til en uge. Den fordøjet pdECM opløsning kan opbevares ved 4 °C i mindst et par dage, men bør ikke overstige 1 uge.
- Fordøje den frysetørret pdECM med pepsin.
- For effektiv fordøjelse af bioink, pulveriserer den lyofiliserede pdECM med flydende nitrogen ved hjælp af en mørtel og Pestle.
- 200 mg pdECM pulveret opsamles i det koniske rør 50 mL, og der tilsættes 20 mg pepsin og 8,4 mL af 0,5 M eddikesyre (den endelige koncentration er 2 w/v%).
- Anbring magnet omrørs stangen i 50 mL konisk rør og rør ved 300 RPM for 96 h.
- Justér pH i den Ford øjede pdECM-opløsning.
Bemærk: for at undgå gelering før pH-justering skal denne proces udføres på is.- Filtrer de uforforderede partikler ud i pdECM-opløsningen ved hjælp af en 40 μm-cellefilter ved hjælp af en positiv forskydnings pipette på isen for at opnå optimal fordøjelse af dele.
- Tilsæt 1 mL af 10x PBS og vortex, før du bruger NaOH.
- Juster pH til 7 med 10 M NaOH kontrol af ph med pH-indikator strimler.
Bemærk: vortex hver gang NaOH tilsættes, så bioblækket blandes grundigt med de andre reagenser.
4. rheologisk analyse
- Eksperimentel opsætning
- Forbered 1,5% (w/v) af pdECM bioink for at vurdere de rheologiske egenskaber.
- Opret en 20 mm kegle plade geometri (kegle diameter på 20 mm med en 2 ° vinkel) i hastigheds kontrolleret tilstand af et rheometer.
- Opret eksperimentelle sekvenser i den installerede software (Trios) til at måle viskositet, gelering kinetik, og dynamisk modulus af pdecm bioink.
- Viskositet: Placer pdECM bioink på pladen. Mål kompleks viskositet (PA · s) af pdECM bioink under en stigende forskydnings hastighed fra 1 til 1.000 s-1 ved en konstant temperatur på 15 °c.
- Gelationkinetik: Anbring pdECM bioink på pladen. Beregn den komplekse modulus (G *) ved at måle opbevarings-og tabs modulus af pdECM bioink ved 4-37 °C med en trinvis stigning på 5 °C/min (tids-fejetilstand).
- Dynamic modulus: Placer pdECM bioink på pladen ved 37 °C i 60 min før måling. Måle den frekvensafhængige Storage modulus (G ') og tab modulus (G ' ') af pdECM bioink i intervallet 0,1-100 rad/s ved 2% stamme.
5.3D celle trykning af pancreas væv konstruktioner ved hjælp af ø
- Fremstilling af isolerede Holme
- Isoler primære Holme fra en rotte i henhold til de protokoller, der er beskrevet i et tidligere arbejde5.
- For at adskille snavs og døde celler fra den isolerede ø, passere cellesuspensionen gennem en 70 μm celle sien. Holme med en diameter på mindre end 70 μm anses for at være døde eller unormale.
- Afbryd de isolerede Holme i RPMI-1640 medium og Placer dem på Petri skålen. Fjern Holme, der er større end 300 μm i diameter, ved hjælp af en P200-volumen pipette under mikroskopet (4X objektiv linse) i biosikkerheds kabinettet.
- Ø-indkapsling i pdECM bioink
- Forbered pH justeret pdECM bioink og isoleret ø.
Bemærk: for at undgå gelering før pH-justering skal denne proces udføres på is. - Bland forsigtigt pdECM bioink og medierne suspenderet med Holme (ratio 3:1) ved hjælp af en positiv fortrængnings pipette indtil ensartet blandet.
Bemærk: den endelige koncentration af pdECM bioink er 1,5% og celletætheden i pdECM bioink er 3.000 IEQ/mL.
- Forbered pH justeret pdECM bioink og isoleret ø.
- 3D celle trykning af pancreas væv konstruktioner
- Forbered en steriliseret sprøjte og 22 G dyse.
Bemærk: denne måler blev valgt til udskrivning af Holme med en diameter på 100-250 μm. - Ilæg den ø-ladede pdECM bioink ind i sprøjten.
- Udskriv bioink med den optimerede udskrivningstilstand (tilførselshastighed: 150 mm/min; pneumatisk tryk: 15 kPa) ved 18 °C i form af et gitter.
- For at kryds forbinde bioink, Placer den trykte konstruktion i inkubator i 30 min.
- Nedsænk den trykte konstruktion i den ø-kultur medier, som er RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 U/mL streptomycin.
- Forbered en steriliseret sprøjte og 22 G dyse.
6.3D celle trykning af bugspytkirtel konstruktion med mønstret struktur
- Tilberedning af to typer af bioink
- For at validere print alsidighed ved hjælp af flere bioinks, forberede to sæt pdECM bioinks og plette dem ved at tilføje 0,4% Trypan blå og rose bengal opløsning i hver pdECM bioink i et forhold på 1:20, hhv.
Bemærk: for at undgå gelering før pH-justering skal denne proces udføres på is. - Bland forsigtigt pdECM bioink og medierne suspenderet med Holme (ratio 3:1) ved hjælp af en positiv fortrængnings pipette indtil ensartet blandet.
Bemærk: den endelige koncentration af pdECM bioink er 1,5% og celletætheden i pdECM bioink er 3.000 IEQ/mL.
- For at validere print alsidighed ved hjælp af flere bioinks, forberede to sæt pdECM bioinks og plette dem ved at tilføje 0,4% Trypan blå og rose bengal opløsning i hver pdECM bioink i et forhold på 1:20, hhv.
- 3D celle trykning af multi materiale-baserede bugspytkirtel væv konstruktioner
- Forbered steriliserede sprøjter og en 25 G dyse.
- Læg hver bioink (blå og rød) i to forskellige sprøjter.
- Udskriv bioink med optimeret udskrivningstilstand (indføringshastighed: 150 mm/min; pneumatisk tryk: 15 kPa) ved 18 °C i form af et gitter med vekslende linjer med blåt og rødt.
- For at kryds forbinde bioink, Placer den trykte konstruktion i inkubator i 30 min.
- Nedsænk den trykte konstruktion i ø-kultur medier, som er RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 U/mL streptomycin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularisering af bugspytkirtel væv
Vi udviklede processen til at forberede pdECM bioink til at give bugspytkirtel vævsspecifikke mikromiljøer til forbedring af funktionaliteten af Holme i en 3D biopskyllede væv konstruktion (figur 2a). Efter decellularization processen, 97,3% af dsDNA blev fjernet og repræsentative ECM komponenter såsom kollagen og GAGs forblev på 1278,1% og 96,9% sammenlignet med den indfødte pancreas væv, henholdsvis (figur 2B).
Forberedelse af bioink
For at anvende pdECM i udskrivningsprocessen blev pdECM pulveret opløst i svag syre med pepsin og neutraliseret ved hjælp af 10 M NaOH opløsning. Den Ford øjede pdECM opløsning kunne derefter fortyndes ved blanding med et cellekulturmedium eller 1x PBS. I denne undersøgelse forberedte vi pdECM bioink i en endelig koncentration på 1,5% for yderligere undersøgelse. PdECM bioink opretholdt en opløsning fase, da det blev placeret under stuetemperatur og straks omdannes til en gel fase efter inkubation ved 37 °C i 30 min. For at undersøge virkningen af pdECM bioink på Holme, blev isolerede Holme indkapslet i pdECM, alginat og kollagen bioinks i en koncentration på 1,5%. Resultatet af den glukose-stimulerede insulin sekretions test viste Holme i pdecm bioink repræsenterede det højeste indeks (ca. 3,174) blandt de eksperimentelle grupper, hvilket indikerer højere funktionalitet over de udbredte silicagelrogeler til ø-indkapsling5.
Rheologisk analyse
Viskositet er en af de kritiske egenskaber, når man overvejer en printbar biomaterial. Vi målte viskositet af pdecm bioink med en frekvens, der spænder fra 1 til 1.000 Hz ved 15 °c til udskrivning af forskellige decm bioinks6,7,8. PdECM bioink viste forskydningsfortyndende adfærd, og værdien var ca. 10 PA · s ved forskydnings hastigheden på 1/s, hvilket indikerer, at pdECM bioink havde passende rheologiske egenskaber for ekstrudering gennem en dyse (figur 3a). Gelationskinetikken ved en temperatur på mellem 4 og 37 °C indikerede, at pdECM bioink var i fysiologisk relevante temperaturer. Den komplekse modulus begyndte at stige, når temperaturen nåede 15 °C, og den steg hurtigt, når temperaturen blev opretholdt ved 37 °C, hvilket indikerer sol-gel-overgangen af pdECM bioink (figur 3B). Den dynamiske G ' og G "af pdECM bioink blev undersøgt ved fysiologisk relevante temperaturer for at sikre stabiliteten efter trykningen, hvilket resulterede i en stabil modulus under frekvens feje betingelsen (figur 3C).
3D-celle udskrivning
3D celle-lastet pancreas væv konstruktioner blev fremstillet ved hjælp af en microekstruderingbaserede udskrivningsproces. For at bygge en konstruktion, der indeholder mindst 3.000 ø-ækvivalenter (IEQ), som svarer til vævs volumenet på en perfekt sfærisk ø med en diameter på 150 μm9, designede vi konstruktionen med en dimension på 10 mm x 10 mm x 3 mm (figur 4a). Procesparametrene og betingelserne for udskrivning af pancreas-Holme blev valgt til indkaptning af Holme, som er store cellulære klynger i størrelser, der spænder 100-250 μm i diameter (figur 4B). Ved hjælp af en multi-Head print system, forskellige typer af 3D-konstruktioner-såsom formen af gitter har alternative linjer af blå og rød-blev fabrikeret ved hjælp af den udviklede pdecm (figur 4C), hvilket indikerer alsidigheden af pdecm med henblik på 3D bioprinting at harmonisere to eller flere typer af levende celler i en vævs lignende arrangement.
Figur 1: skematisk udvikling af decellularized bugspytkirtel væv, evaluering af pdECM bioink og fabrikation af 3D pancreas væv konstruktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative billeder af decellularization proces og biokemiske karakterisering af pdECM. A) oversigt over decellulariseringen af Porcin i bugspytkirtlen. B) resultater af biokemiske analyser af indfødt væv og pdECM. Fejllinjer viser standardafvigelse. Ophavsret (2019) Royal Society of Chemistry5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Rheologisk analyse af pdECM bioink. (A) viskositet af pdECM og kollagen bioinks, der udviste forskydningsfortyndende opførsel. B) gelationkinetik af pdECM og kollagen bioinks under temperaturændring. C) den komplekse modulus af tværbundet pdECM og kollagen bioinks. Copyright (2019) af Royal Society of Chemistry5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:3D celle trykning af celle-laden pdECM bioink for 3D pancreas væv konstruktioner. (A) dimensionerne af 3D pancreas væv konstruktioner. (B) ø-laden i bugspytkirtlen og (C) multi materiale-baserede 3D pancreas væv konstruktioner. Copyright (2019) af Royal Society of Chemistry5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskrev udviklingen af pdECM bioinks og fabrikation af 3D pancreas væv konstruktioner ved hjælp af 3D celle trykning teknikker. For at rekapitulere mikromiljøet af målvævet i 3D manipuleret væv konstruere, valget af bioink er kritisk. I en tidligere undersøgelse, vi valideret, at vævs-specifikke dECM bioinks er gavnlige for at fremme stamcelle differentiering og spredning10. Sammenlignet med syntetiske polymerer, dECM kan tjene som en celle-gunstige miljø på grund af den vævsspecifikke sammensætning og arkitektur11. Derfor, den decellularization proces bør seriøst overvejes for den høje fastholdelse af store komponenter i dECM.
Udvælgelsen af forskellige rengøringsmidler til decellularization af pancreas væv varierer den resterende ECM konstituerende12. I processen med decellularization, bemærkede vi, at brugen af natriumdodecyl sulfat (SDS) kan påvirke tabet af ECM proteiner13. Således har vi ændret vores tidligere protokol ved at eliminere trin til behandling af SDS løsning, som er en ionisk overfladeaktivt stof, der anvendes i mange rengøring og decellularization processer med relativt barske egenskaber i forhold til de andre såsom Trion-X 100, eller 3-[(3-cholamidopropyl) dimethyl-lammonio] -1-propanesulfonat (CHAPS). I denne protokol, vi brugte 1% Triton-X 100 løsning til 84 h i stedet for SDS løsning, som var i stand til at fjerne de cellulære komponenter effektivt samtidig bevare GAGs og kollagenøse proteiner. Desuden bemærkede vi, at fjernelse af rest lipider ved behandling med IPA også er en meget afgørende proces for at inducere kryds bindingen af pdECM bioink, og det kan forstås i samme sammenhæng som en tidligere offentliggjort artikel4. Behandling med pereddikesyre opløsning blev også anvendt til sterilisering af decellularized væv. Hertil kommer, fjernelse af de resterende vaskemidler og kemikalier i decellularized væv er et afgørende skridt for at forhindre den inflammatoriske vært respons. Vi drøftede imidlertid ikke dette spørgsmål i denne protokol. Protokoller, der omfatter en desinficering proces i slutningen af decellularization vil forbedre biokompatibilitet af den decellularized materiale. Desuden bør standarderne for evalueringskriterier overvejes for at sikre, at vaske-og rengøringsmidler og kemikalier fjernes fuldstændigt.
Fordøjelsen af pdECM bioink med pepsin blev udført for at opnå den homogene blanding af pdECM pulver i den sure opløsning ved spaltning af telopeptid regionen i kollagenous protein. I pH-justeringsprocessen er det afgørende for bevarelsen af gelation at holde pdECM bioink på isen. Bagefter kan vi producere fysisk crosslink able pdECM præ-gel bioinks, der kan komme ind i en gel tilstand ved inkuberet ved 37 °C, hvilket er en af de vigtigste fordele ved dECM-baserede bioinks. Udvælgelse af den rette koncentration af pdECM bioink er også vigtigt10. En ideel bioink bør beskytte celler mod ydre skader, der opstår under udskrivningsprocessen, såsom pneumatisk tryk og temperaturændring. Det er kendt, at den anvendte forskydningskraft kan forårsage skader på cellerne og reducere cellens levedygtighed i de trykte konstruktioner10. Også, øge koncentrationer af bioink kunne inducere celledød5. I modsætning hertil, lave koncentrationer af bioink inducerer lav viskositet, hvilket betyder dårlig print barhed og form-pålidelighed under trykning. Det er nødvendigt at kontrollere viskositeten af bioink og optimere dens koncentration.
I øjeblikket, forskere er aktivt studere udviklingen af forskellige typer af væv-afledte bioinks til trykning 3D væv konstruktioner14,15,16. Resultaterne af disse undersøgelser indikerer, at bioink kan give vævsspecifikke mikromiljøer til celler. Disse unikke betingelser kan fremme differentiering eller modning af stamceller og spredning af celler. Desuden gør det muligt at udskrive flere typer af bioinks med høj præcision samtidigt ved at udnytte multi-Head udstyret 3D-celle udskrivningssystem. Ved hjælp af denne teknik, en struktur med et bestemt mønster kan produceres, og dermed viser design alsidighed. Desuden er det muligt at indkapme forskellige typer af celler i hver bioink at efterligne indfødte celle arrangement17. Disse mønstrede strukturer kan udnyttes i induktion af vaskularisering eller co-Culture effekt ved at forbedre celle-til-celle interaktioner, som kan være nøglefaktorer i den langsigtede overlevelse af specifikke celler18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af bio & Medical Technology Development program af National Research Foundation (NRF) finansieret af den koreanske regering (MSIT) (2017M3A9C6032067) og "ICT consilience Creative program" (IITP-2019-2011-1-00783) under tilsyn af IITP (Institut for informations & kommunikationsteknologi, planlægning & evaluering).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
| Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
| Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
| Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
| Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
| Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
| Grater | ABM | 1415605793 | |
| Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
| Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
| Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
| Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
| pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
| Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
| Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Cirurgical Instruments | |||
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Materials | |||
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
| 50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
| 500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
| 500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
| 500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
| 96well plate | Falcon | 353072 | |
| Aluminum foil | DAEKYO | ||
| Kimwipe | Kimtech | ||
| Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
| Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
| Petri Dish | SPL | 10100 | |
| pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
| Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
| Decellularization | |||
| 10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
| 4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
| 70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
| Distilled water | |||
| IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
| Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
| Biochemical assay | |||
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| 10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
| Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
| Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Citric acid | Supelco | 46933 | |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
| P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
| Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
| Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
| Bioink | |||
| Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
| Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268 (2017).
- Venturini, M., et al. Technique, complications, and therapeutic efficacy of percutaneous transplantation of human pancreatic islet cells in type 1 diabetes: the role of US. Radiology. 234 (2), 617-624 (2005).
- Xie, D., et al. Cytoprotection of PEG-modified adult porcine pancreatic islets for improved xenotransplantation. Biomaterials. 26 (4), 403-412 (2005).
- Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Scientific Reports. 8 (1), 10452 (2018).
- Kim, J., et al. 3D cell printing of islet-laden pancreatic tissue-derived extracellular matrix bioink constructs for enhancing pancreatic functions. Journal of Materials Chemistry B. 7 (10), 1773-1781 (2019).
- Yi, H. G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 1, (2019).
- Das, S., et al. Decellularized extracellular matrix bioinks and the external stimuli to enhance cardiac tissue development in vitro. Acta Biomaterialia. , (2019).
- Kim, H., et al. Shear-induced alignment of collagen fibrils using 3D cell printing for corneal stroma tissue engineering. Biofabrication. 11 (3), 035017 (2019).
- Huang, H. H., Ramachandran, K., Stehno-Bittel, L. A replacement for islet equivalents with improved reliability and validity. Acta Diabetologica. 50 (5), 687-696 (2013).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1, (2018).
- Kim, B. S., Kim, H., Gao, G., Jang, J., Cho, D. W. Decellularized extracellular matrix: a step towards the next generation source for bioink manufacturing. Biofabrication. 9 (3), 034104 (2017).
- Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization protocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (12), 697-708 (2018).
- Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).
- La, W. G., et al. Systemically replicated organic and inorganic bony microenvironment for new bone formation generated by a 3D printing technology. RSC Advances. 6 (14), 11546-11553 (2016).
- Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
- Choudhury, D., Tun, H. W., Wang, T., Naing, M. W. Organ-derived decellularized extracellular matrix: a game changer for bioink manufacturing? Trends in Biotechnology. 36 (8), 787-805 (2018).
- Kurpios, N. A., et al. The direction of gut looping is established by changes in the extracellular matrix and in cell: cell adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (25), 8499-8506 (2008).
- Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. Fibronectin requirement in branching morphogenesis. Nature. 423 (6942), 876 (2003).
