A matriz extracelular descelularizada (dECM) pode fornecer pistas microambientais adequadas para recapitular as funções inerentes dos tecidos-alvo em uma construção projetada. Este artigo elucida os protocolos para a descelularização do tecido pancreático, avaliação do bioink dECM derivado do tecido pancreático e geração de construções de tecidopanpático 3D usando uma técnica de bioimpressão.
O transplante de ilhotas pancreáticas é um tratamento promissor para pacientes que sofrem de diabetes tipo 1 acompanhado sofrem de hipoglicemia e complicações secundárias. No entanto, o transplante de ilhotas ainda tem várias limitações, como a baixa viabilidade das ilhotas transplantadas devido ao mau enxenxerto de ilhotas e ambientes hostis. Além disso, as células produtoras de insulina diferenciadas das células-tronco pluripotentes humanas têm capacidade limitada de secretar hormônios suficientes que podem regular o nível de glicose no sangue; Portanto, melhorar a maturação, cultivando células com pistas microambientais adequadas é fortemente necessária. Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de um biotilétil de matriz extracelular descelular descelular (pdECM) derivado do tecido pancreático para fornecer um microambiente benéfico que pode aumentar a sensibilidade à glicose das ilhotas pancreáticas, seguida pela descrição os processos para a geração de tecidos pancreáticos 3D são construídos por meio de uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusão.
Recentemente, o transplante de ilhotas pancreáticas tem sido considerado um tratamento promissor para pacientes com diabetes tipo 1. A segurança relativa e a invasidão mínima do procedimento são grandes vantagens deste tratamento1. No entanto, tem várias limitações, como a baixa taxa de sucesso de ilhotas isolante e os efeitos colaterais das drogas imunossupressoras. Além disso, o número de ilhotas enxertadas diminui de forma constante após o transplante devido ao ambiente hostil2. Vários materiais biocompatíveis, como alginato, colágeno, poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA) ou polietilenoglicol (PEG) foram aplicados ao transplante de ilhotas pancreáticas para superar essas dificuldades.
A tecnologia de impressão de células 3D está surgindo em engenharia de tecidos devido ao seu grande potencial e alto desempenho. Escusado será dizer que os bioinks são conhecidos como componentes importantes para fornecer um microambiente adequado e permitir a melhoria dos processos celulares em construções de tecidos impressos. Um número substancial de hidrogéis de afinamento de tesoura, como fibrina, alginato e colágeno são amplamente utilizados como bioinks. No entanto, esses materiais mostram falta de complexidade estrutural, química, biológica e mecânica em comparação com a matriz extracelular (ECM) no tecido nativo3. Pistas microambientais, como as interações entre ilhotas e ECM são sinais importantes para melhorar a função das ilhotas. ECM descelularizado (dECM) pode recriar a composição específica do tecido de vários componentes de ECM, incluindo colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas. Por exemplo, ilhotas primárias que retêm seus ECMs periféricos (por exemplo, tipo I, III, IV, V e VI colágeno, laminina e fibronectina) exibem baixa apoptose e melhor sensibilidade à insulina, indicando assim que as interações de matriz celular específicas do tecido são importantes para melhorar sua capacidade de funcionar de forma semelhante ao tecido original4.
Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de biotilidade sacarcelulares descelularizadas (pdECM) derivadas de tecidos pancreáticos (pdECM) para fornecer sugestões microambientais benéficas para impulsionar a atividade e as funções das ilhotas pancreáticas, seguidas pelos processos de geração de construções de tecidos pancreáticos 3D usando uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusion (Figura 1).
Este protocolo descreveu o desenvolvimento de bioinks pdECM e a fabricação de construções de tecidopanpático 3D usando técnicas de impressão de células 3D. Para recapitular o microambiente do tecido alvo na construção de tecidos projetados em 3D, a escolha do bioink é fundamental. Em um estudo anterior, validamos que bioinks de dECM específicos do tecido são benéficos para promover a diferenciação de células-tronco e proliferação10. Em comparação com polímeros sintéticos, o …
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de Desenvolvimento de Biotecnologia e Tecnologia Médica da National Research Foundation (NRF) financiado pelo governo coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) e “ICT Consilience Creative Program” (IITP-2019-2011-1-00783) e “ICT Consilience Creative Program” (IITP-2019-2011-1-00783) supervisionado pelo IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).
Biological Safety Cabinets | CRYSTE | PURICUBE 1200 | |
Deep Freezer | Thermo Scientific Forma | 957 | |
Digital orbital shaker | DAIHAN Scientific | DH.WSO04010 | |
Dry oven | DAIHAN Scientific | WON-155 | |
Freeze dryer | LABCONCO | 7670540 | |
Fridge | SANSUNG | CRFD-1141 | |
Grater | ABM | 1415605793 | |
Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
Microcentrifuge | CRYSTE | PURISPIN 17R | |
Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | Multiskan GO | |
Mini centrifuge | DAIHAN Scientific | CF-5 | |
Multi-Hotplate Stirrers | DAIHAN Scientific | SMHS-6 | |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE-PR | |
pH benchtop meter | Thermo Fisher Scientific | STARA2110 | |
Rheometer | TA Instrument | Discovery HR-2 | |
Vortex Mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
Cirurgical Instruments | |||
Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
Materials | |||
1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
10 ml glass vial | Scilab | SL.VI1243 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
5 L beaker | Dong Sung Science | SDS 2400 | |
50 mL cornical tube | Falcon | 352070 | |
500 mL beaker | Korea Ace Scientific | KA.23-08 | |
500 mL bottle-top vacuum filter | Corning | 431118 | |
500 mL plastic container | LOCK&LOCK | INL301 | |
96well plate | Falcon | 353072 | |
Aluminum foil | DAEKYO | ||
Kimwipe | Kimtech | ||
Magnetic bar | Korea Ace Scientific | BA.37110-0003 | |
Mortar and pestle | DAIHAN Scientific | SC.MG100 | |
Multi-channel pipettor | Eppendorf | 4982000314 | |
Petri Dish | SPL | 10100 | |
pH indicator strips | Sigma-Aldrich | 1095350001 | |
Sieve filter mesh | DAIHAN Scientific | ||
Decellularization | |||
10x pbs | Hyclone | SH30258.01 | |
4.7% Peracetic acid | Omegafarm | ||
70% ethanol | SAMCHUN CHEMICALS | E0220 SAM | |
Distilled water | |||
IPA | SAMCHUN CHEMICALS | samchun I0348 | |
Triton-X 100 | Biosesang | T1020 | |
Biochemical assay | |||
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
10 N NaOH | Biosesang | S2018 | |
Chloramine T | Sigma-Aldrich | 857319 | |
Chondroitin sulfate A | Sigma-Aldrich | C4384 | |
Citric acid | Supelco | 46933 | |
Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
Glacial acetic acid | Merok | 100063 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Na2-EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
NaCl | SAMCHUN CHEMICALS | S2097 | |
Papain | Sigma-Aldrich | p4762 | |
P-DAB | Sigma-Aldrich | D2004 | |
Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S5636 | |
Sodium hydroxide | Supelco | SX0607N | |
Sodium phosphate(monobasic) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | |
Bioink | |||
Charicterized FBS | Hyclone | SH30084.03 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P7215 | |
Rose bengal | Sigma-Aldrich | 198250 | |
RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |