Summary
Detta arbete presenterar ett protokoll för att ge homogena cellkulturer av primära oculomotor, trochlear, och spinal motoriska nervceller. Dessa kulturer kan användas för jämförande analyser av morfologiska, cellulära, molekylära och elektrofysiologiska egenskaper hos ögon-och spinal motoriska nervceller.
Abstract
Oculomotor nervceller (CN3s) och trochlear neuroner (CN4s) uppvisar anmärkningsvärt motstånd mot degenerativa motoriska neuron sjukdomar såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS) jämfört med spinal motoriska neuroner (SMNs). Förmågan att isolera och odla primär mus CN3s, CN4s och SMNs skulle ge en metod för att studera mekanismerna bakom denna selektiva sårbarhet. Hittills har de flesta protokoll använder heterogena cellkulturer, som kan blanda ihop tolkningen av experimentella resultat. För att minimera problemen i samband med blandad cellpopulationer, är rena kulturer oumbärliga. Här, det första protokollet beskriver i detalj hur man effektivt rena och odla CN3s/CN4s tillsammans med SMNs motsvarigheter från samma embryon med hjälp av embryonala dag 11,5 (E 11.5) ISLmn: GFP transgena mus embryon. Protokollet innehåller information om vävnad dissektion och dissociation, FACS-baserad cell isolering, och in vitro-odling av celler från filen CN3/CN4 och SMN kärnor. Detta protokoll lägger till en roman in vitro filen CN3/CN4 kultur system till befintliga protokoll och samtidigt ger en ren art-och åldersmatchade SMN kultur för jämförelse. Analyser med fokus på morfologiska, cellulära, molekylära och elektrofysiologiska egenskaper hos motoriska neuroner är genomförbara i detta kultur system. Detta protokoll kommer att möjliggöra forskning om de mekanismer som definierar utvecklingen av motoriska neuron, selektiv sårbarhet och sjukdom.
Introduction
Kulturen i primära motoriska nervceller är ett kraftfullt verktyg som möjliggör studiet av neuronala utveckling, funktion, och känslighet för exogena stressorer. Motoriska neuron kulturer är särskilt användbara för studiet av neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS)1,2, varssjukdomsmekanismer är ofullständigt förstås. Intressant, trots den signifikanta celldöd av spinal motoriska neuroner (smns) i båda ALS patienter och ALS modell möss, celldöd i ögonmuskelförlamningar nervceller (CN3s) och trochlear neuroner (CN4s) är relativt knappa1,3,4,5,6,7,8,9. Därför kan jämförande analyser av rena kulturer av CN3s/CN4s och SMNs ge viktiga ledtrådar om mekanismerna bakom relativ sårbarhet. Tyvärr har ett stort hinder för sådana analyser varit oförmågan att odla renade kulturer av dessa motoriska nervceller.
Många protokoll har beskrivits för rening av SMNs från djurmodeller. De flesta av dessa protokoll använder densitet gradient centrifugering10,11,12 och/ellerp75 NTR-antikroppsbaserad cell-sortering panorering tekniker13,14,15,16. Densitetsgradientcentrifugering utnyttjar den större storleken av SMNs i förhållande till andra ryggrads celler, medan p75NTR är ett extracellulärt protein som uttrycks exklusivt av smns i ryggmärgen. Nästan 100% rena SMN kulturer har genererats av en eller båda av dessa protokoll11,12,14. Men dessa protokoll har inte lyckats generera filen CN3/CN4 kulturer eftersom CN3s/CN4s inte uttrycka p75NTRoch andra specifika filen CN3/CN4 markörer inte har identifierats. De är också mindre än SMNs och därför svårare att isolera baserat på storlek. I stället, in vitro-studier av CN3s eller CN4s har förlitat sig på dissocierade17,18,19,20,21, explantat17,22,23,24,25,26, och slice27,28 kulturer, som består av heterogena celltyper, och inga protokoll har funnits för isolering och kultur av primär CN3s eller CN4s.
Här beskrivs ett protokoll för visualisering, isolering, rening och odling av CN3s, CN4s och SMNs från samma embryonala dag 11,5 (E 11.5) ISLmn: GFP transgena möss29 (figur 1, figur 2a). ISLmn: GFP specifikt etiketter motoriska neuroner med en FARNESYLATED GFP som lokaliserar till cellmembranet. Detta protokoll möjliggör art-och åldersmatchad jämförelse av flera typer av motoriska nervceller för att belysa patologiska mekanismer i motorisk neuron sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som utnyttjar försöksdjur utfördes i enlighet med NIH riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och med godkännande av djuromsorg och användning kommittén för Boston Children ' s Hospital.
1. ställa in tidsinställda matningar före dissektion
- För att generera prenatal embryonala möss för motor neuron skörd, väga varje kvinnlig mus och ställa in tidsinställda parning mellan vuxna ISLmn: GFP transgena möss 11,5 dagar före dagen för neuron isolering. I syfte att utveckla detta protokoll, 129S1/C57BL/6J ISLmn: GFP -möss, i åldern 2 − 9 månader, användes och tidsinställd parning sattes upp på kvällen.
- Undersök kvinnliga möss för vaginala pluggar följande morgon. Beakta det datum då pluggen identifieras som embryonal dag (E) 0,5.
- Väga honmöss och undersöka för valpar med ultraljud (se tabell över material) mellan e 8.5 − 11. Kontrollera om tecknen på lyckad parning.
- Bekräfta den lyckade parningen genom att detektera viktökning hos honmöss (vanligtvis > 1,5 g på E 9.5 om det finns fler än 5 − 6 embryon).
- Visuellt bekräfta embryon under ultraljud. Embryon är lätt att upptäcka med ultraljud efter E 9.5. Ultraljud utförs endast på kvinnor som har vunnit vikt eftersom de är oftare gravida än de som inte gör det.
Anmärkning: Kvinnliga möss kan få vikt av andra skäl än graviditet, så viktökning ensam är inte en tillförlitlig indikator på graviditeten. Ultraljud bekräftelse förhindrar onödiga uppoffringar av kvinnor som inte är gravida men är inte avgörande om de inte är tillgängliga.
2. dissekeringsförhållanden och beredning av instrument
- Utför all beläggning (utom syra-rengöring av täckblad), media beredning, vävnads dissociation (utom centrifugering och inkubering), och kulturarbete i en laminär Flow Hood för att säkerställa sterilitet i media och embryonala motoriska nervceller.
- Med noggrann uppmärksamhet på steril teknik, utföra vävnad dissektion utanför en laminär Flow Hood med minimal risk för kontaminering.
- Sterilisera en dissektion tallrik, ett par microdissecting sax, ett par tumme dressing pincett, två par Dumont #5 Tweezers, en microdissecting kniv, och en Moria mini perforerad sked genom att doppa i 70% etanol före användning.
3. PDL/laminin beläggning av disk/täckglas
Anmärkning: Kultur dissocierade primära motoriska nervceller i 96 bra eller 24 bra tallrikar, beroende på antalet celler som krävs för ansökan. Celler kan avbildas direkt i vävnads odlingsplattan utan användning av täckglas om brunnarna är optiskt transparenta och tjockleken är kompatibel med avbildning.
- För applikationer som kräver täckglas, Förbered syra-rengjorda, steriliserade och lufttorkad täckglas minst 2 dagar före neuron isoleringen som tidigare beskrivits30. Partier av täckglas kan förberedas på detta sätt i god tid före experiment och kan lagras upp till 6 månader utan inverkan på experimentell kvalitet.
- Bered en fungerande lösning på 20 μg/mL Poly D-lysin (PDL) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 2 dagar före neuron isoleringen.
- Ali quot PDL (1 mg/mL) i förväg och förvara vid-20 ° c som en stamlösning.
- Täck ytan på varje täckglas eller brunnen av vävnads odlingsplattan med tillräckligt med PDL lösning arbetslösning (t. ex. 100 μL per brunn på 96 bra tallrikar eller 500 μL per brunn på 24 väl plattor med eller utan täckglas). Inkubera över natten vid 37 ° c.
- Följande dag tvätta 3x med steriliserat vatten.
- Försegla plattorna med paraffin film och förvara de tvättade PDL-belagda plattorna vid 4 ° c i upp till 1 månad om de torkas helt efter den sista tvätten.
- Bered en fungerande lösning med 10 μL laminin (1,1 − 1,2 mg/mL) i 1,2 mL PBS.
- Med alikvot (1,1 − 1,2 mg/mL) i förväg och förvara vid-80 ° c.
- Täck ytan på varje täckslip eller väl med tillräckligt laminin lösning för att jämnt belägga ytan. Inkubera i minst 2 timmar vid 37 ° c före användning.
Anmärkning: PDL/laminin-belagda plattor och täckglas kan förvaras upp till 1 vecka vid 37 ° c, men nybelagd laminin är att föredra. Ta bort laminin direkt före plätering30. Laminin ska inte tillåtas torka ut. Om plattorna ska lagras i mer än flera timmar, bör de förpackas i paraffin film.
4. beredning av dissektion, motor neuron kultur media, och dissociation Solutions
Anmärkning: Koncentrationer inom parentes indikerar de slutliga koncentrationerna av varje reagens.
- Förbered dissekera mediet.
- Tina det Värmeinaktiverade häst serumet över natten vid 4 ° c, Förbered 1 mL-aliquots och förvara vid-20 ° c. Tina alikvoter vid RT direkt före användning.
- Förvara B27-supplement (50x) i 1 mL alikvoter vid-20 ° c. Tina alikvoter vid RT omedelbart före användning. Undvik frysning/Tina cykler.
- Förvara glutamintillägg (100x) vid 4 ° c eller-20 ° c. Dela upp i 0,5 mL-portioner om de förvaras vid-20 ° c.
- Förvara penicillin-streptomycin (10 000 U/mL) i 1 mL-aliquoter vid-20 ° c. Tina alikvoter vid RT omedelbart före användning.
- För att göra dissektion medium, blanda 9,4 mL av övervintra E med 200 μL av häst serum (2%), 200 μL av 50x B27 tillägg (1x), 100 μL 100x glutamin tillägg (1x) (t. ex., GlutaMAX), och 100 μL av 10 000 U/mL penicillin-streptomycin (100 U/mL). Använd detta medium för att samla dissekerade vävnader och göra den slutliga suspensionen av separerade celler.
- Tillsätt 500 μL av dissekeringsmedlet till enskilda 1,7 mL mikrocentrifugrör för vävnads samlingen dagen före neuronisoleringen. Förbered ett rör för varje vävnadstyp som kommer att samlas in (t. ex. positiv kontroll, negativ kontroll, filen CN3/CN4, SMN) och förvara vid 4 ° c före användning.
- Kombinera 49 mL av viloläge E lågfluorescensmedia med 1 mL B27 tillägg (1x) och fyll en 24 väl tallrik med detta medium (2 mL/brunn) dagen före neuron isolering. Använd denna maträtt för att samla mus embryon. Förvaras vid 4 ° c före användning.
- Förbered motor neuron odlingssubstrat.
- Bered 250 μL alikvoter på 25 mM 2-merkaptoetanol i Leibovitz ' s L15 medium. Förvaras vid-20 ° c.
- Generera 5 μL alikvoter på 100 μg/mL lösningar av BDNF, CNTF och GDNF utspädd i steriliserat vatten. Förvara vid-80 ° c och Tina alikvoter vid RT omedelbart före användning.
- Förbered 10 mM Forskolin lösning genom att lägga till 64 μL av dimetylsulfoxid (DMSO) till 5 mg (1,0670 μM) av forskolin och Vortex väl att upplösa helt. Tillsätt sedan steriliserat vatten (1,003 mL) till DMSO lösning och Vortex väl. Förvara 12 μl alikvoter på 10 mm Forskolin vid-20 ° c och Tina-alikvoter vid RT omedelbart före användning.
- Bered 12 μL alikvoter på 100 mM isobutylmetylxinin (IBMX) utspädd i DMSO. Förvara vid-20 ° c och Tina alikvoter vid RT omedelbart före användning.
- För att göra motor neuron odlingssubstrat, blanda 9,4 mL neurobasal medium med 200 μL av häst serum (2%), 200 μL 50x B27-tillägg (1x), 100 μL 100x glutamintillägg (1x), 100 μL av 10 000 U/m: penicillin-streptomycin (100 U/mL) och 20 μL 25 mM 2-merkaptoetanol (50 μM), företrädesvis direkt före användning. Detta steg kan utföras upp till 1 dag före neuron isolering.
- Strax före användning, tillsätt 1 μL vardera av 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL), och GDNF (10 ng/mL) och 10 μL av 10 mM Forskolin (10 μM), och 10 μL av 100 mM IBMX (100 μM) till motor neuron odlingssubstrat. Värm mediet till 37 ° c.
- Bered dissociationslösningar.
- Bered den papain lösningen (20 U/mL papain och 0,005% DNase) och en albumin-ovomucoid hämmare lösning (1 mg/mL ovomucoid inhibitor, 1mg/mL albumin, och 0,005% DNase) enligt tillverkarens anvisningar.
- Bered 500 μL alikvoter av var och en av ovomucoid-hämmaren och papain-lösningarna och förvara vid-80 ° c. Tina alikvoter vid 37 ° c omedelbart före användning.
5. ventrala mellanhjärnan och ryggmärg dissektion
Anmärkning: Utför alla följande steg utom steg 5.1.1 − 5.1.3 och 5.1.5 − 5.1.6 under en fluorescensdissektion stereomikroskop. Total dissektionstid per experiment är typiskt 3 − 5 h, beroende på kompetensen vid dissektionsteknik och antalet motoriska neuroner som krävs för varje experiment.
- Ventrala mellanhjärnan dissektion
- Euthanize en gravid mus cirka 11,5 dagar postfertilisering av koldioxidgas och livmoderhalscancer dislokation.
- Spraya buken grundligt med etanol och ta bort livmodern med steril microdissecting sax och tumme dressing pinps. Tvätta livmodern en kort stund i steril PBS och överför sedan till dissektion plattan fylld med förkyld steril PBS.
- Ta bort ISLmn: GFP-positiva embryon försiktigt från livmodern med hjälp av sterila microdissecting sax, tummen dressing pincett, och Dumont #5 pincett i Ice-Cold steril PBS under starkt ljus av mikroskopet. Använd en steril Moria mini-perforerad sked, överför varje embryo till en separat brunn av en 24 väl tallrik fylld med prekyld Hibernate-E låg fluorescens medium kompletteras med 1x B27. Håll 24 väl plattan på isen.
- Överför ett embryo till en steril dissekering platta och täck det helt med iskalla sterila Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS).
- Se till att dissektion stegen utförs under fluorescein isotiocyanat (FITC) belysning av mikroskopet. Med hjälp av pincett, ta bort svansen och ansiktet av embryot utan att skada mellanhjärnan (figur 2BA). Placera embryot benägna med lemmar skrevade under och svans pekar mot framsidan av mikroskopet, mot semisharp (indikeras med en asterisk, figur 2BB).
- Använda pincett, slits öppna taket på den fjärde ventrikeln för att generera en liten öppning. Använd denna öppning för att haka pincett i utrymmet som skapas mellan den fjärde ventrikeln och dess tak. Dissekera längs dorsala ytan av embryot rostralt till cortex och sidled till golvplattan och motoriska kolonnen (figur 2ca, b). Öppna dissekerade vävnad i en öppen bok sätt att avslöja GFP-positiva filen CN3 och CN4 kärnor.
Anmärkning: En liten bit vävnad från den ventrala mellanhjärnan innehållande Mesenchyme, filen CN3, och CN4 kommer nu att exponeras. - Noggrant separera ventrala mellanhjärnan från embryot och ta bort meningeal vävnad med hjälp av pincett och en microdissecting kniv. Dissekera den bilaterala GFP-positiva filen CN3 och CN4 kärnor bort från golvplattan och andra GFP-negativ omgivande vävnad med hjälp av pincett och en microdissekting kniv (figur 2D). Maximera antalet GFP-positiva motoriska nervceller i den exciserade vävnaden men Undvik att röra eller skada dem.
- Om en samling av separata filen CN3 och CN4 kärnor önskas, skära längs mittlinjen av dessa två kärnor (gula prickig linje i figur 2D). Använd en P1000 pipett och samla den dissekerade ventrala mellanhjärnan vävnaden med minimal Hbss och placera den i ett märkt 1,7 ml microcentrifugetub fyllt med dissekera medium (se steg 4.1.5). Förvara på is tills dissociation.
- Fortsätt att sammanföra ventrala midbrains från ytterligare embryon i samma tub tills det totala antalet uppfyller det experimentella kravet (se steg 8 för ideala cell nummer).
Anmärkning: En poolad samling av minst 10 ventrala midbrains ger cirka 1 x 104 filen CN3/CN4 motoriska nervceller rekommenderas eftersom vävnader är föremål för stress under dissociation och sortering.
- Ventral ryggmärg dissektion
- Håll embryot benägen med huvudet vänd mot framsidan av mikroskopet, mot dissector. Håll embryot med ett par pincett och sätt spetsen på andra pincetten i den oöppnade caudal del av den fjärde ventrikeln.
- Öppna resten av bakhjärnan och ryggmärgen dorsalt över hela rostrocaudal omfattningen av embryot. Öppna genom att skära rygg vävnad, med början från den fjärde ventrikeln och arbetar mot Central kanalen i kaudala ryggmärgen med hjälp av tång som sax (figur 2ca, b). Var noga med att undvika att röra eller skada den ventrala ryggmärgen under detta förfarande.
- Håll embryot med ett par pincett och nypa bort luckan i rygg vävnaden på vardera sidan med de andra pincetten (figur 2EA, b).
Anmärkning: Excised rygg vävnad innehåller dorsala hud, Mesenchyme, dorsala root ganglier (DRGs), dorsala hindbrain, och ryggmärgen. Ta bort så mycket av dessa vävnader som möjligt utan att skada SMN kärnor, eftersom de är lim och kan fälla SMNs under filtrering eller orsaka igensättning under FACS sortering. - Ta bort den ventrala ryggmärgen med hjälp av microdissektion kniven för att tränga in direkt under GFP-positiva SMN. Lyft den ventrala ryggmärgen med SAW-liknande rörelser på båda sidor (figur 2FA, b). Skär den flytande ventrala ryggmärgen på tvären direkt över C1, där de första GFP-positiva främre horn projekt (figur 2G). Också, skära tvären på den övre gränsen av nedre extremiteterna (figur 2G). Ta bort den cervikala (C1)-ländryggen (L2-L3) delen av den ventrala ryggmärgen efter detta förfarande.
- Placera den ventrala ryggmärgen dorsala Sidan upp och håll genom att trycka på GFP-negativ vävnad mellan GFP-positiva SMN kolumner med ett par pincett. Ta bort de kvarvarande bifogade Mesenchyme, DRGs och rygg ryggmärgen genom att trimma båda sidor av GFP-positiv SMN kolumn med microdissektion kniv (figur 2H). Var noga med att maximera GFP-positiva motoriska nervceller utan att skada dem.
- Med hjälp av en P1000 pipett, samla dissekerade ventrala ryggmärgen vävnad med minimal HBSS och placera i SMN-märkt 1,7 mL microcentrifug röret fylld med dissektion medium. Förvara på is tills dissociation. Fortsätt att sammanföra ventrala ryggmärgen från ytterligare embryon i samma tub tills det totala antalet uppfyller de experimentella kraven.
Anmärkning: Insamling av minst tre ventrala ryggmärgen som ger cirka 2,1 x 104 SMN rekommenderas eftersom vävnader är föremål för stress under dissociation och sortering. - Samla in ansikts motoriska nervceller och extremiteter i ISLmn: GFP -mus embryon som GFP-positiva och GFP-negativa kontroller för fluorescensaktiverad cell sortering (FACS). Extremiteter är GFP-negativa eftersom GFP-positiva axoner av SMNs ännu inte har utvidgats till extremiteter vid denna embryonala ålder.
6. vävnads dissociation
Anmärkning: Total dissociation tid är typiskt 1,5 h per experiment.
- Varm papain och albumin-ovomucoid hämmare lösning alikvoter till 37 ° c 30 min före dissociation.
- Snurra snabbt ner mikrodissekerade vävnader med låg hastighet.
- Med hjälp av en P100 pipett, försiktigt ta bort så mycket övervintra E som möjligt utan aspirera vävnader.
Anmärkning: Var noga med att ta bort alla kvarvarande viloläge E efter detta steg för att undvika att minska effekten av papain dissociation i nästa steg. - Tillsätt lämplig volym papain-lösning (tabell 1) till var och en av 1,7 ml-mikrocentrifugrör som innehåller de mikrodissekerade vävnadsproverna.
Anmärkning: Den passande volymen av papain för dissociationen var beslutsam för att maximera den effektiva dissociationen stunder som minimerar spänning på cellerna. - Försiktigt hackad 8x med en P200 pipett. Utför alla sönderdelning steg försiktigt för att bevara motoriska neuron lönsamhet.
- Inkubera rören som innehåller vävnaderna i 30 min vid 37 ° c, agitera med fingret snärta 10X varje 10 min. försiktigt hackad varje suspension 8x med en P200 pipett efter inkubering. Snurra ner cellerna vid 300 x g i 5 min.
- För att säkerställa effekten av ovomukoidhämning i nästa steg, Använd en P1000-pipett för att ta bort och kassera så mycket supernatanten som möjligt utan att aspirera vävnaderna.
- Omsuspendera pellets i lämplig volym av albumin-ovomukoidhämmare (tabell 1) genom att försiktigt triturera 8x med en P200-pipett.
- Vänta 2 min att tillåta eventuella kvarvarande delar av oseparerade vävnad att bosätta sig på botten av röret.
- Samla så mycket supernatanten som möjligt utan aspirera undissociated vävnader med hjälp av en P200 pipett. Överför supernatanten till färska 1,7 mL microcentrifug rör.
- Om några bitar av vävnad förblir undissociated efter steg 6,10, upprepa steg 6.8 − 6.10 för de oseparerade vävnader som finns kvar i den ursprungliga 1,7 mL microcentrifug rör för att maximera den slutliga avkastningen av separerade celler samtidigt minimera stress på cellerna dissocierade tidigare, som ingår i supernatanten i steg 6,10.
- Snurra ner cellerna vid 300 x g i 5 min. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten med en P1000 pipett.
- Omsuspendera pelleten i lämplig volym av dissekera medium (tabell 1) genom att Pipettera 8x med en P1000 pipett. Den lämpliga volymen av den slutliga suspensionen fastställdes så att CELLTÄTHETEN inte överstiger 107 celler/ml, vilket kan blockera flödet av flödescytometri maskinen, men också så att cellerna inte är överdrivet utspädd, vilket resulterar i en långsammare sorterings hastighet.
- Filtrera suspensioner genom 70 μm cell silar för att eliminera alla stora klumpar eller osmält vävnad. Överför suspensionerna till 5 mL runda botten polystyrenprovrör och förvara på isen tills det behövs.
7. fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS)
Anmärkning: Detta protokoll var optimerad med hjälp av en FACS sorterare utrustad med en 15 MW 405 nm violett Laser, en 100 MW 488 nm blå laser, en 75 MW 594 nm orange laser, och en 40 MW 640 Nm röd laser. Cellerna sorterades som slida vätska i steril PBS under aseptiska förhållanden genom ett munstycke på 100 μm. För att minimera cellspänningen sattes flödeshastigheten till ett provtryck på 1 − 3, så att maximalt 1000 − 4000 händelser per sekund förvärvades. Total FACS tid är typiskt 1 − 2 h per experiment.
- Ställ in spänningar för framåt-och sido scatter så att cellpopulationen kan visualiseras på rätt sätt. Att ställa in lämpliga spänningar för cell sortering är komplext och kräver en erfaren FACS-operatör.
- För att särskilja olika cellpopulationer, rita celler baserat på storlek som bestäms av det främre spridningsområdet (FSC-A) kontra intern komplexitet som bestäms av sido spridningsområdet (SSC-A). Rita en grind runt levande celler som anges i figur 3AA och figur BA att utesluta skräp och döda celler. Gruppera cellerna inom den gated regionen som population 1 (P1).
- För att utesluta cell klumpar och dubbletter, rita P1-celler nästa baserat på sido spridningsbredden (SSC-W) kontra SSC-A. Av enskilda celler som population 2 (P2) (figur 3AB och figur BB).
- Plot P2 celler baserade på den främre scatter-bredden (FSC-W) kontra FSC-A och grind populationen av enskilda celler som population 3 (P3) (figur 3AC och figur BC).
Anmärkning: användning av två på varandra följande grindar i 7,3 och 7,4 utesluter cell klumpar och dubletter (hög FSC-W och hög FSC-A). - Gate P3-celler baserade på GFP kontra allophycocyanin (APC). APC-kanalen detekterar autofluorescence. Gating på denna kanal undviker att fånga autofluorescent celler. Använd GFP-negativa celler för att justera spänningen för FITC/GFP Lysrörs kanaler. Helst placera grindar för dessa cellpopulationer runt 102. Välj grind trösklar för GFP-positiv population 4 (P4) individuellt för varje typ av motorneuron (figur 3AD och figur BD).
Anmärkning: Ställ GFP-porten mycket högre för SMNs än för CN3s/CN4s för att få en renkultur (figur 3AD och figur BD). En lägre GFP-grind för SMN-kulturer leder till kontaminering av kulturerna genom glia och icke-motoriska neuroner. Detta är sannolikt eftersom det finns en låg nivå GFP uttryck i vissa glia och icke-motoriska neuroner på grund av en läckande promotor. Andelen GFP-positiva celler jämfört med totala celler är typiskt 0,5 − 1,5% för CN3s/CN4s och 1,5 − 2,5% för SMNs. Om Dissekeringen lyckades, kan dessa siffror användas som riktmärke för att bestämma lämplig position för GFP-positiv grind (figur 3AE och figur be). - Utför FACS enligt tillverkarens protokoll. Samla P4-celler i färska 1,7 mL microcentrifug rör fyllda med 500 μL av motor neuron odlingssubstrat. Förvara på is tills plätering.
Anmärkning: Även om cellerna kan sorteras direkt i brunnarna, detta resulterar i ett ojämnt antal celler per brunn. Sortera cellerna i 1,75 mL microcentrifug rör och sedan plattan manuellt för att uppnå en jämnare plätering distribution.
8. odling av renade primära motoriska nervceller
- Späd FACS-isolerade filen CN3/CN4 och SMN suspensioner med motor neuron kultur medium förvärmas till 37 ° c till densiteter av 5 x 103 och 1 x 104 celler/ml, respektive.
Anmärkning: Ett E 11.5 embryo ger cirka 1 x 103 filen CN3/CN4 och 7 x 103 SMN. Men dessa avkastningar är starkt beroende av renhet dissekerade vävnader, grundlighet cell dissociation, och lämpligt tröskelvärde för GFP grindar under FACS. - Överför 96 väl plattor förbelagts med PDL och laminin från 37 ° c vävnad kulturen inkubator till laminärt Flow Hood och aspirera laminin från varje brunn. Använd plåtar och täckglas omedelbart utan tvättning.
- Tillsätt 200 μL utspädd filen CN3/CN4 och SMN suspensioner i varje brunn av PDL/laminin-belagda 96 väl plattor. Slutliga cell tätheter bör vara 1 x 103 och 2 x 103 celler/väl för filen CN3/CN4 respektive SMN.
Anmärkning: Inledande plätering densitet av SMNs i 96 väl tallrikar (2 x 103 celler/brunn) är dubbelt så mycket som CN3s/CN4s (1 x 103 celler/brunn) för att få liknande sista motoriska neuron nummer och densiteter vid 2 och 9 dagar in vitro (div) (4 − 6 x 102 och 2 − 4 x 102 celler per brunn, respektive) - Kultur nervceller i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
- Feed nervceller var 5 dagar genom att ta bort hälften av de gamla medierna (100 μL) och ersätta med samma volym av färska motor neuron odlingssubstrat. Se till att neuronala processer blir synliga på 1 DIV och blir tjockare och längre med 14 DIV (figur 4). Neuronala cell kroppar blir förstorade och tenderar att aggregera i långvariga kulturer, särskilt för SMNs (figur 4).
Anmärkning: Utför alla medel-och lösnings förändringar genom att lämna hälften av den ursprungliga Medelvolymen för att undvika att ta loss odlade celler. Detta inkluderar fixering och vävnad (ICC) steg. Om alla medier tas bort, oavsett hur försiktigt, kommer de flesta av cellerna lossna och tvättas bort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med detta protokoll var att mycket rena och odla både primär CN3s/CN4s och SMNs på lång sikt för att möjliggöra jämförande analyser av mekanismerna bakom motoriska neuron störningar (se figur 1 och figur 2 för översikt).
När nervceller framgångsrikt isolerades och odlas i kulturen, nästan ren primärfilen CN3/CN4 och SMN kulturer erhölls (figur 5a,B) och upprätthålls för minst 14 div (figur 4 och figur 6). Den renhet av filen CN3/CN4 och SMN kulturer på 2 div var 93,5 ± 2,2% och 86,7 ± 4,7%, respektive, när bedömas av ICC med hjälp av motor neuron markör Islet1 och neuronala markör TUJ1 (figur 5B). Dessa höga renheter förlitade sig dock kraftigt på embryona och på att fastställa lämpliga tröskelvärden för GFP-grindar under FACS (figur 3). Dissektion av embryon vid E 10.5 är svårare än dissektion på E 11.5 på grund av ökad mjukhet och adhesivitet av vävnader, vilket resulterar i minskade motoriska neuron avkastning. Renbanden av E 10.5 CN3s/CN4s och SMNs var dock jämförbara med dem för E 11.5 embryon (92,8% respektive 82,2% vid 2 DIV; data som erhållits från ett enda experiment). Renhet av CN3s/CN4s och smns minskade dramatiskt när e 13,5 embryon användes, även om endast den högsta GFP-positiva populationen samlades in (20,7% och 7,4% vid 2 div, respektive; data som erhållits från ett enda experiment), troligen på grund av uttrycket av GFP i icke-motoriska neuroner (figur 7). Samma tendens höll också sann för E 12.5 kulturer, även om det var mycket mindre dramatisk. Därför är embryon på E 12.5 eller äldre olämpliga för användning vid rening av motoriska nervceller med hjälp av detta protokoll.
Pure motor neuron kulturer är värdefulla för att förstå isolerade tillväxtmönster, beteenden, och sårbarheter i motoriska nervceller. Detta exempel visar hur dessa kulturer kan användas för att testa motoriska neuron svar på kemisk behandling. För att avgöra om primär CN3s/CN4s och SMNs visar differentiella reaktioner på endoplasmatiska Retikulum (ER) stressorer, primära monokulturer av CN3s/CN4s och SMNs erhölls med hjälp av detta protokoll och behandlas med varierande koncentrationer av en ER stressfaktor, cyklopiazonsyra (CPA). Nervceller behandlades med CPA (5, 10, 15, 20, 25, eller 30 μM) eller fordonets kontroll (DMSO) vid 2 DIV och fast 3 dagar senare för ICC att utvärdera överlevnad nyckeltal (figur 8a). Antalet livskraftiga neuroner i varje prov räknades och överlevnads kvoterna beräknades som antalet livskraftiga celler i läkemedelsbehandlade brunnar dividerat med antalet livskraftiga celler i de brunnar som behandlades med DMSO. FILEN CN3/CN4 monokulturer var signifikant mer motståndskraftiga mot CPA behandling (10 − 25 μM) jämfört med SMN monokulturer (figur 9 och figur 8B)31.
Sammanfattningsvis tillåter detta protokoll för generering av högrenade primära mus embryonala filen CN3/CN4 och SMN kulturer som ger ett kraftfullt och tillförlitligt system för utredning av neuronala beteende.
Figur 1: system för beredning av mus embryonala motoriska nervceller. Den schematiska illustrerar de steg som ingår i isolering och kultur av mus embryonala motoriska nervceller och den ungefärliga tiden i timmar eller dagar för varje steg. Ordningen för dissekera procedur för filen CN3/CN4 och för SMN är varje märkt sekventiellt 1 till 4. Förkortningar: filen CN3/CN4 = ögonmuskelförlamningar neuron/trochlear neuron; SMN = spinal motoriska neuron; FACS = fluorescens-aktiverad cell sortering; h = timme; d = dag. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: dissektion av ventrala mellanhjärnan och den cervikala (C1)-ländryggen (L2-L3) delen av den ventrala ryggmärgen. A) laterala(a) och dorsala (b) synpunkter på GFP-positiva motoriska nervceller i en e 11.5 ISLmn: GFP transgena mus embryo under FLUORESCEIN isotiocyanat (FITC) belysning. En hel Mount E 11.5 embryot utarbetades som tidigare beskrivits32 för att göra embryot transparent. Därefter analyserades embryot av immunofluorescensteknik med anti-GFP-färgning (grön). Bilder fångades under ett konfokala Mikroskop. Skala staplar = 200 μm (lateral visning) och 400 μm (dorsal View). Förkortningar: S = överlägsen; I = sämre; V = ventral; D = dorsala. (B-H) Dissekera steg markerade på bilder av e 11.5 ventrala mellanhjärnan och ventrala ryggmärg vävnader tagna med en utrustad kamera under starkt ljus (BB) eller FITC belysning med hjälp av en fluorescens dissektion stereomikroskop. Skalstreck = 200 μm (D) och 1 mm (A − C, E − H). B) a avlägsnandeav embryots ansikte och svans genom att skära längs de röda linjerna. b) embryo placerad för dissektion. Placeringen av framsidan av mikroskopet indikeras av en asterisk. (C) skära längs den fasta röda linjen för att skåran öppna taket på den fjärde ventrikeln (a) laterala vyn och (b) dorsala Visa. Användning av denna öppning för att skära längs ytan av embryo rygg till hjärnan (Trajectory indikeras av streckad röd pil). Detta exponerar vävnaden som innehåller Mesenchyme, filen CN3, och CN4, som kan lyftas ut ur kraniet. För SMN dissektion, införande av pincett i samma öppning mellan den fjärde ventrikeln och dess tak, sedan skära mot kaudala sidan av embryot (Trajectory indikeras av streckad gul pil). Dslutlig syn på den ventrala mellanhjärnan som innehåller bilaterala GFP-positiva filen CN3-och CN4-kärnor. Kanterna på vävnaden markeras med en röd rektangel. Skära längs gula prickig linje för att samla in filen CN3 och CN4 kärnor separat, om så önskas. (E) efter öppnandet av resten av bakhjärnan och ryggmärgen, flaxande rygg vävnad klämde bort ovanför de röda linjerna på båda sidor medpincett (a) före, och (b) efter. (F) bilateralt avlägsnande av överflödig vävnad ventrala till ryggmärgen längs den röda linjen (a) före, och (b) efter. G) kapning av den ventrala ryggmärgen på de två platser som indikeras av de röda linjerna. På den rostralt sidan, kapning av flytande ventrala ryggmärgen tvären över C1 där den första GFP-positiva främre horn projekt. Kapning av den kaudala änden av ryggmärgen på tvären vid den övre gränsen av nedre extremiteterna. När dessa nedskärningar är gjorda, den cervikala (C1) genom ländryggen (L2-L3) del av den ventrala ryggmärgen kan dissekeras bort. Hslutlig syn på den ventrala ryggmärgen som innehåller GFP-positiva SMN-kolonner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa sorterings områden av ventrala midbrains (a) och ventrala ryggmärgs strängar (B). (AA och BA) Framåt spridningsområde (FSC-A) kontra sido spridningsområde (SSC-A) sorterat tomt före uteslutning av skräp och döda celler. (AB, BB, AC, BC) Sorterade tomter för uteslutning av cell klumpar (b) och dubletter (c) baserat på bredd (SSC-w) kontra SSC-a och framåt scatter bredd (FSC-w) kontra FSC-a, respektive. (AD och BD) Sorterade tomter för att isolera ISLmn: GFP -positiva motoriska nervceller. För att få en renkultur måste GFP-porten ställas in högre för SMNs (BD) än för CN3s/CN4s (AD). (AE och be) Procentsatser av celler som är gated för insamling av FACS sortering. % Förälder representerar procentandelen celler i den aktuella gated populationen i förhållande till antalet celler i den tidigare gated cellpopulationen, medan % Total representerar procentandelen gated celler i förhållande till totala celler. Förväntade procentsatser av GFP-positiva celler jämfört med totala celler (boxed i rött) är 0,5 − 1,5% för filen CN3/CN4 och 1,5 − 2,5% för SMN. Om dissektion utfördes framgångsrikt, kan dessa procenttal användas som riktmärke för att ställa in GFP-positiv grind i (AD och BD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: faskontrast bilder av primära filen CN3/CN4 och SMN-monokulturer vid 2, 7 och 14 div. Representativ differential interferens kontrast bilder av primära filen CN3/CN4 och SMN kulturer fångades på 2, 7 och 14 DIV med inverterad fluorescens Mikroskop med motsvarande bild förvärv och bearbetning programvara och 40x mål. Neuronala processer blev tjockare och längre med 14 DIV. neuronala cell kroppsstorlekar blev förstorade och tenderade att aggregera i långsiktiga kulturer, särskilt för SMNs. Båda kulturerna kan bibehållas minst 14 DIV. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: karakteriseringar av isolerade e 11.5 mus filen CN3/CN4 och SMN kulturer. (A) representativa immunocytokemi bilder av e 11.5 mus CN3s/CN4s (överst) och smns (botten) odlade för 2 div Immunofluorescensmärkning med den NEURONALA markören TUJ1 (grön) och motor neuron markör Islet1 (röd) utförs för att analysera neuroner och kärnor var motstod med DAPI (blå). Nästan alla odlade celler var motoriska nervceller (TUJ1+, Islet1+). Bilder fångades med en inverterad fluorescens Mikroskop med hjälp av motsvarande bild förvärv och bearbetning programvara och 20x mål. Proverna avbildades och behandlades för att uppnå maximal signalintensitet utan mättade pixlar. Alla mikroskopiska arbete och bildbehandling i följande siffror utfördes under dessa förhållanden om inte annat anges. Skalstapel = 100 μm. (B) renhet av e 11.5 mus filen CN3/CN4 och SMN kulturer på 2 div. Renhet av filen CN3/CN4 och SMN kulturer var 93,5 ± 2,2% och 86,7 ± 4,7%, respectively. Döda neuronala cell kroppar bedömdes genom screening för pyknotisk nukleär morfologi och membran svullnad. Neuronala processer klassificerades som degenererande processer när tecken på beading och svullnad observerades. Celler med varken cellkroppen död eller degenerering processer ansågs livskraftiga icke-motoriska nervceller (TUJ1+, Islet1-) eller livskraftiga MOTORISKA nervceller (TUJ1+, Islet1+)33. Den renhet av motoriska neuron kulturer beräknades som antalet livskraftiga motoriska nervceller dividerat med det totala antalet livskraftiga icke-motoriska neuroner plus livskraftiga motoriska nervceller. Värden representerar medelvärdet ± SEM för tre separata experiment. Inte signifikant (p > 0,05) genom Students t -test. Cell inventering utfördes manuellt under 20x förstoring. Förkortningar: SEM = standardfel av medelvärdet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativ immunocytokemi för primärfilen CN3/CN4 och SMN-monokulturer vid 2, 7 och 14 div. Primärfilen CN3/CN4 och SMN kulturer analyserades vid 2, 7, 14 DIV av immunofluorescensmärkning med TUJ1 (grön), och kärnor motfärgas med DAPI (blå). Neuronala processer blir tjockare och längre med 14 DIV. neuronala cell kroppsstorlekar blev förstorade och tenderade att aggregera i långsiktiga kulturer, särskilt för SMNs. Både filen CN3/CN4 och SMN kulturer kan bibehållas minst 14 DIV. bilder fångades under 10X förstoring. Scale bar = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: karakterisering av e 13.5 mus filen CN3/CN4 och SMN isolerade kulturer. E 13,5 filen CN3/CN4 och SMN isolerades och odlade med hjälp av detta protokoll och analyseras vid 2 DIV av immunofluorescensmärkning med TUJ1 (grön) och Islet1 (röd), och kärnorna var motstod med DAPI (blå). Många icke-motoriska neuronala celler (TUJ1+, Islet1-) var närvarande (pilar) vilket resulterade i en drastisk minskning av både filen CN3/CN4 och SMN renhet, med minskningen mer uttalad i SMN kulturer. Bilder fångades under 20x förstoring. Scale bar = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: representativ tillämpning av primär motorisk neuron kultur som visar att CN3s/CN4s är selektivt resistenta mot er stress induceras av CPA. (A) experimentell kontur: primärfilen CN3/CN4 och SMN monokulturer behandlades med CPA eller kontroll av fordon (DMSO) vid 2 div och celler ekonomisk utvärderades genom immunocytokemi analys efter 3 dagars behandling. Den här dispositionen har ändrats från publicerat arbete31. (B) kvantifiering av överlevnads kvoterna för CN3s/CN4s och smns som behandlats med 5 − 30 μm CPA i 3 dagar från 2 div. neuroner analyserades av Immunofluorescerande märkning av celler med TUJ1, och kärnor motfärgas med DAPI. Överlevnads kvoterna beräknades som antalet livskraftiga celler (se figur 5B -Legend) i läkemedelsbehandlade brunnar dividerat med antalet livskraftiga celler i brunnar som innehåller enbart vehikel (DMSO). Cell inventering utfördes manuellt under 20x förstoring. Värden representerar medelvärdet ± SEM för fyra separata experiment. * p < 0,05; p < 0,005 av Students t -test. Denna siffra har modifierats från tidigare publicerat arbete31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: representativ immunocytokemi av primära filen CN3/CN4 och SMN monokulturer efter en 3 dagars exponering för ökande koncentrationer av CPA börjar vid 2 div. Neuroner analyserades av Immunofluorescerande märkning av celler med TUJ1 (grön) och kärnor var motmålat med DAPI (blå). Primär CN3s/CN4s var mer motståndskraftig mot CPA behandling än primära SMNs. bilder fångades under 10X förstoring. Scale bar = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antal midbrains (X) | Papain | Albumin-ovomucoid | Viloläge E | |||||||||
| 10 ≤ X ≤ 20 | 200 μL | 100 μL | 600 μL | |||||||||
| 20 < X ≤ 30 | 300 μL | 150 μL | 700 μL | |||||||||
| 30 < X ≤ 40 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| Antal ryggrads strängar (Y) | Papain | Albumin-ovomucoid | Viloläge E | |||||||||
| 3 ≤ Y ≤ 5 | 200 μL | 100 μL | 500 μL | |||||||||
| 5 < Y ≤ 10 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| 10 < Y ≤ 15 | 600 μL | 300 μL | 1200 μL | |||||||||
Tabell 1: lämpliga volymer papain, albumin-ovomucoid och slutlig suspension som används i dissociationsteg. De lämpliga volymerna av papain och albumin-ovomucoid som ska användas med olika antal ventrala mellanhjärnan-och ventrala ryggmärgs vävnader ändrades från tillverkarens anvisningar efter flera omgångar av optimeringen. Eftersom vävnader är föremål för stress under dissociation och sortering, en poolad samling av mer än 10 ventrala midbrains och mer än tre ventrala ryggmärgen rekommenderas. Volymen av papain bestämdes genom att betrakta balansen mellan effektiv dissociation och stressen i detta förfarande. Volymen av albumin-ovomukoidhämmare är hälften av papains. Den lämpliga volymen av viloläge E slutlig suspension bestämdes så att CELLTÄTHETEN inte överstiger 107 celler/ml, men cellerna blir inte alltför utspädd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historiskt, in vitro-studier av filen CN3 och/eller CN4 motoriska nervceller har förlitat sig på heterogena kulturer som dissocierade17,18,19,20,21, explantat17,22,23,24,25,26, och slice27,28 kulturer, eftersom dessa celler inte kan särskiljas från omgivande celler baserat på storlek, och specifika markörer för dessa celler har inte rapporterats. Det nuvarande protokollet är en heltäckande metod för isolering och kultur av primär e 11.5 murina CN3s/CN4s, och smns från samma embryon och bekräfta den höga renhet av kulturerna. Genom att generera rena SMN och filen CN3/CN4 kulturer från samma mus embryon, möjliggör protokollet kontrollerade jämförelser av in vitro beteenden av CN3s/CN4s kontra SMNs isolerade från vild typ samt muterade embryon.
Den rena kulturer CN3s/CN4s och SMNs genereras av detta protokoll tillåter jämförande studier av morfologiska, cellulära, molekylära och elektrofysiologiska egenskaper hos dessa motoriska nervceller. I teorin, eftersom andra kraniala motoriska neuron populationer kan visualiseras och dissekeras från denna ISLmn: GFP transgena mus linjen (inklusive abducens, motor trigeminala, ansiktsbehandling, och hypoglob), detta protokoll kan utökas för sin isolering och kultur samt, förutsatt att FACS GFP Gates justeras på lämpligt sätt. Slutligen, FACS-sorterade motoriska neuroner som härrör från detta protokoll kan utsättas för genomisk (t. ex., test för transposase-tillgänglig kromatin med sekvensering, eller ATAC-SEQ) och/eller transcriptomic (t. ex., RNA-sekvens31) analyser för att studera normal utveckling och den selektiva sårbarheten hosspecifika motorneuron subtyper
Det finns flera steg i detta protokoll som är avgörande för att maximera antalet rena, friska motoriska nervceller i det isolerade kultur systemet. Under dissektion, den GFP-negativa vävnader (t. ex., Mesenchyme och DRGs) bör maximalt avlägsnas utan att skada motoriska nervceller, eftersom dessa vävnader är lim och kan fälla SMNs under filtrering eller orsaka igensättning under FACS sortering. Vid vävnads dissociation bör den minimala essentiella volymen papain användas, och cellerna måste behandlas varsamt med minimal men tillräcklig triturering. Papain användes för vävnads dissociation steg i detta protokoll, eftersom preliminära uppgifter anges att det är mindre destruktiv än trypsin till både filen CN3/CN4 och SMN. Överlevnad nyckeltal baserade på pläterade nummer av CN3s/CN4s och SMNs på 2 DIV ökade från 39,5% till 52,7% och från 52,3% till 58,4%, respektive, när papain användes i stället för trypsin (0,25%, 4 min inkubation). Även om dessa siffror härleds från ett enda experiment som utförs före full optimering, ytterligare rapporter tyder också på att trypsin är suboptimala för cell utvinning från vävnader i nervsystemet12,34,35,36. Under FACS, fluorescerande vitala färgämnen (propidium jodid och calcein blå) och små sorterings munstycken (t. ex., 70 μm) bör inte användas, eftersom de är skadliga för motoriska neuron överlevnad. Användning av stora sorterings munstycken (100 μm eller större) rekommenderas starkt, eftersom SMN celldöd ökar markant när ett 70 μm munstycke används. Fastställandet av lämpliga gating tröskelvärden för GFP-positiva celler i FACS är ett kritiskt steg för att få rena kulturer. Motoriska neuron kulturer kompletteras med Forskolin, IBMX, och tillväxtfaktorer (BDNF, CNTF, och GDNF). Forskolin och ibmx har rapporterats att additivt främja SMN Survival37,38. Preliminära uppgifter från de nuvarande studierna tyder på att Forskolin och ibmx också additivt öka filen CN3/CN4 överlevnad. Överlevnad baserat på pläterade nummer av CN3s/CN4s vid 2 DIV ökade från 17,5% till 26,9%, 31,9%, och 37,0% när IBMX, Forskolin, och IBMX + Forskolin lades, respektive (siffrorna är baserade på ett enda experiment utförs före full optimering av cell odlingsförhållanden). Det är bäst att utföra alla medel förändringar och tvättar av odlade celler genom att lämna hälften av den ursprungliga volymen för att undvika lossnar odlade celler. Slutligen är det också perfekt att minska den tid som tillbringas mellan dissektion och plätering av motoriska nervceller (t. ex. genom att förkorta dissekera tid med hjälp av flera dissektorer) för att förbättra livskraften i kulturerna.
Det finns fyra stora potentiella problem som kan uppstå när du följer detta protokoll. Den första är låg avkastning av motoriska nervceller efter FACS. Potentiella orsaker till låg avkastning omfattar användning av unga embryon (t. ex. E 10.5), som har färre motoriska nervceller, otillräcklig avlägsnande av lim GFP-negativa vävnader under dissektion (t. ex., Mesenchyme och DRGs), som kan fälla motoriska nervceller och leda till att de avlägsnas under filtrering, otillräcklig papainization/trituration under dissociation, och/eller inställning av GFP-positiv grind för hög Det andra potentiella problemet är låg renhet av motor neuron kulturer, som sannolikt uppstår vid användning av äldre embryon (t. ex., E 12.5) och/eller från att sätta GFP-positiv grind för låg under FACS. För det tredje kan ett lågt antal anslutna motoriska nervceller i kulturen observeras på grund av olämpliga FACS sortering och/eller otillräcklig PDL/laminin beläggning av plattor/täckglas. För det fjärde kan motoriska nervceller Visa låg lönsamhet i kulturen. Potentiella orsaker till låg lönsamhet är grov och/eller långvarig dissektion, överdriven papainization/trituration under dissociation, olämplig hantering av celler i hela protokollet (t. ex., grov pipettering av celler, underlåtenhet att placera celler på is, underlåtenhet att pre-Chill PBS och Hbss), och/eller överdriven tid mellan djur av gravida möss och avslutande plätering av cellerna. Användning av reagenser som inte är färska och/eller olämpliga koncentrationer kan också försämra experimentella resultat.
Det finns tre viktiga begränsningar i detta protokoll. ISLmn: GFP TRANSGENA möss och FACS sortering är båda ganska dyra. De är dock avgörande för detta protokoll eftersom det för närvarande inte finns någon alternativ metod som kan generera höggradigt renat CN3s/CN4s på ett mer ekonomiskt sätt. Det finns en liten E 10.5-E 12.5 ålder fönster för embryonala möss, och det är svårt att bekräfta att lämpligt äldre embryon är närvarande, särskilt om en ultraljudsmaskin är inte tillgänglig. Om endast rena smns krävs, kan de härledas från e 12.5-15,0 mus embryon med metoder såsom gradient centrifugering10,11,12 och/eller p75NTR-antikroppsbaserad cell sortering panorering tekniker13,14,15,16. Slutligen, proteinbaserade analyser som kräver en stor mängd utgångsmaterial är inte möjligt från dessa kulturer på grund av den lilla avkastningen av motoriska nervceller (särskilt CN3s/CN4s). Stem cell-härledda motoriska nervceller31,39, som kan genereras obegränsat, kan i teorin ersättas för detta ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) för undervisning i SMN dissektion tekniker; Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, immunologi Division Flow Cytometry anläggning i Harvard Medical School, Joslin diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham och Women ' s Hospital Flow Cytometry kärna, och Boston Children ' s Hospital Flow Cytometry forskningsanläggning för FACS isolering av primära motoriska nervceller; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, ytterligare Engle laboratorie medlemmar, och projekt ALS Consortium medlemmar för tekniskt bistånd och tankeväckande diskussion. Denna studie stöddes av Project ALS. Dessutom finansierades R.F. av Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhins forskningsstipendium utomlands och NIH Training Grant i Genetics T32 GM007748; J.J. stöddes av NIH/NEI Training program i de molekylära grunderna för ögonsjukdomar (5T32EY007145-16) genom Schepens Eye Research Institute och av Utvecklingsneurologin Training program postdoktor Fellowship (5T32NS007473-19) genom Boston Children ' s Hospital; M. C. W stöddes av NEI (5K08EY027850) och Children ' s Hospital oftalmologi Foundation (Faculty Discovery Award); och E.C.E. är en Howard Hughes Medical Institute utredare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al.
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T.
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
