Summary
Este trabalho apresenta um protocolo para produzir culturas celulares homogêneas de neurônios motores oculomotores primários, trochlear e espinhais. Essas culturas podem ser usadas para análises comparativas das características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores oculares e espinhais.
Abstract
Neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) apresentam notável resistência a doenças degenerativas do neurônio motor, como esclerose lateral amiotrófica (ELA) quando comparados aos neurônios motores espinhais (SMNs). A capacidade de isolar e cultura cn3s rato primário, CN4s, e SMNs proporcionaria uma abordagem para estudar os mecanismos subjacentes a esta vulnerabilidade seletiva. Até o momento, a maioria dos protocolos utiliza culturas géterogêneas celulares, que podem confundir a interpretação dos resultados experimentais. Para minimizar os problemas associados às populações de células mistas, as culturas puras são indispensáveis. Aqui, o primeiro protocolo descreve em detalhes como purificar e cultivar eficientemente CN3s/CN4s ao lado de contrapartes de SMNs dos mesmos embriões usando o dia embrionário 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embriões transgênicos do rato. O protocolo fornece detalhes sobre a dissecção e dissociação de tecidos, isolamento celular baseado em FACS e cultivo in vitro de células dos núcleos CN3/CN4 e SMN. Este protocolo adiciona um novo sistema de cultura CN3/CN4 in vitro aos protocolos existentes e, simultaneamente, fornece uma cultura SMN pura e de espécies combinadas para comparação. Análises com foco nas características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores são viáveis neste sistema de cultura. Este protocolo permitirá a pesquisa nos mecanismos que definem o desenvolvimento do neurônio motor, a vulnerabilidade seletiva, e a doença.
Introduction
A cultura dos neurônios motores primários é uma ferramenta poderosa que permite o estudo do desenvolvimento neuronal, função e susceptibilidade a estressores exógenos. As culturas dos neurônios motores são particularmente úteis para o estudo de doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA)1,2,cujos mecanismos de doença são incompletamente compreendidos. Curiosamente, apesar da morte celular significativa de neurônios motores espinhais (SMNs) em pacientes com ELA e camundongos modelo ALS, morte celular em neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) são relativamente escassos1,3,4,5,6,7,8,9. Portanto, análises comparativas de culturas puras de CN3s/CN4s e SMNs poderiam fornecer pistas importantes sobre mecanismos subjacentes à vulnerabilidade relativa. Infelizmente, uma grande barreira para tais análises tem sido a incapacidade de crescer culturas purificadas desses neurônios motores.
Muitos protocolos foram descritos para a purificação de SMNs de modelos animais. A maioria desses protocolos utiliza centrifugação de gradiente de densidade10,11,12 e/ou p75NTR-técnicas de triagem de células baseadas em anticorpos13,14,15,16. A centrifugação do gradiente da densidade explora o tamanho maior de SMNs relativo a outras pilhas espinal, visto que o p75NTR é uma proteína extracellular expressada exclusivamente por SMNs na medula espinal. Quase 100% de culturas smn puras foram geradas por um ou ambos os protocolos11,12,14. No entanto, esses protocolos não têm sido bem-sucedidos na geração de culturas CN3/CN4 porque cn3s/CN4s não expressam p75NTR,e outros marcadores específicos do CN3/CN4 não foram identificados. Eles também são menores do que as SMNs e, portanto, mais difíceis de isolar com base no tamanho. Em vez disso, estudos in vitro de CN3s ou CN4s têm contado com a dissociada17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, e fatia27,28 culturas, que são compostas de tipos de células heterogêneas, e não existem protocolos para o isolamento e cultura dos CN3primários ou CN4s.
Aqui, um protocolo é descrito para a visualização, isolamento, purificação e cultivo de CN3s, CN4s e SMNs do mesmo dia embrionário 11,5 (E11,5) IslMN:GFP camundongos transgênicos29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP rotula especificamente os neurônios motores com um GFP farnesylated que localiza a membrana celular. Este protocolo permite a comparação de espécies e idade-combinados de vários tipos de neurônios motores, a fim de elucidar mecanismos patológicos na doença do neurônio motor.
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Protocol
Todos os experimentos que utilizam animais de laboratório foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório e com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso animal do Boston Children's Hospital.
1. Criação de acasalamentos cronometrados antes da dissecação
- Para gerar camundongos embrionários pré-natais para a colheita do neurônio motor, pesar cada rato fêmea e configurar acasalamento cronometrado entre adultos IslMN:GFP camundongos transgênicos 11,5 dias antes do dia de isolamento do neurônio. Com o objetivo de desenvolver este protocolo, foram utilizados 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP, com idades compreendidas entre os 2 e os 9 meses, e o acasalamento cronometrado foi criado à noite.
- Examine camundongos fêmeas para plugues vaginais na manhã seguinte. Considere a data em que a ficha é identificada como dia embrionário (E) 0,5.
- Pesar camundongos fêmeas e examinar para filhotes usando ultra-som (ver Tabela de Materiais)entre E8,5-11. Verifique se há sinais de acasalamento bem sucedido.
- Confirme o acasalamento bem sucedido detectando o ganho de peso em camundongos fêmeas (geralmente >1.5 g em E9.5 se houver mais de 5 a 6 embriões).
- Confirmar visualmente embriões ultra-som. Os embriões são facilmente detectáveis por ultra-som após e9,5. Os ultra-sons são conduzidos somente nas fêmeas que ganharam o peso porque são mais frequentemente grávidos do que aquelas que não fazem.
Nota: Os ratos fêmeas podem ganhar o peso para razões à excepção da gravidez, assim que o ganho de peso sozinho não é um indicador de confiança da gravidez. A confirmação do ultra-som impede o sacrifício desnecessário das fêmeas que não estão grávidas mas não é crucial se indisponível.
2. Condições de dissecação e preparação de instrumentos
- Realize todo o revestimento (exceto a limpeza ácida dos coverslips), preparação de mídia, dissociação de tecidos (exceto centrífuga e incubação) e trabalho cultural em uma capa de fluxo laminar para garantir a esterilidade dos neurônios motores embrionários e de mídia.
- Com atenção cuidadosa à técnica estéril, conduza a dissecção do tecido fora de uma capa de fluxo laminar com risco mínimo de contaminação.
- Esterilizar uma placa de dissecação, um par de tesouras microdissecting, um par de pinças de vestir o polegar, dois pares de pinças dumont #5, uma faca microdissecting, e uma colher perfurado moria mini imergindo em 70% de etanol antes de usar.
3. PDL/Revestimento de laminina de pratos/coverslips
Nota: A cultura dissociava os neurônios motores primários em 96 placas de poço, dependendo do número de células necessárias para a aplicação. As células podem ser imagemdas diretamente na placa de cultura do tecido sem o uso de coverslips se os poços são opticamente transparentes e as espessuras são compatíveis com imagens.
- Para aplicações que exigem coverslips, preparar acid-cleaned, esterilizado, e ar-secado coverslips pelo menos 2 dias antes do isolamento do neurônio como descrito anteriormente30. Lotes de coverslips podem ser preparados desta forma com bastante antecedência dos experimentos e podem ser armazenados até 6 meses sem impacto na qualidade experimental.
- Prepare uma solução de trabalho de 20 μg/mL poly D-lysine (PDL) em soline tamponado de fosfato (PBS) 2 dias antes do isolamento do neurônio.
- Aliquot PDL (1 mg/mL) com antecedência e armazenar a -20 °C como uma solução de estoque.
- Cubra a superfície de cada deslizamento de cobertura ou o poço da placa de cultura do tecido com solução de trabalho de solução PDL suficiente (por exemplo, 100 μL por poço em 96 placas de poço ou 500 μL por poço em 24 placas de poço com ou sem lábios). Incubar durante a noite em 37 °C.
- No dia seguinte, lave 3x com água esterilizada.
- Selar as placas com filme de parafina e armazenar as placas lavadas PDL revestido em 4 °C por até 1 mês, se eles são secos completamente após a lavagem final.
- Prepare uma solução de trabalho com 10 μL de lamina (1,1-1,2 mg/mL) em 1,2 mL da PBS.
- Estoques de laminina Aliquot (1,1-1,2 mg/mL) com antecedência e armazenam a -80 °C.
- Cubra a superfície de cada deslizamento de cobertura ou bem com solução de laminado suficiente para revestir uniformemente a superfície. Incubar por pelo menos 2 h a 37 °C antes do uso.
Nota: Placas e lábios revestidos de laminadopodem ser armazenados até 1 semana a 37 °C, mas a laminina revestida na ré é preferida. Retire a laminado diretamente antes de revestimento30. Laminin não deve ser autorizado a secar. Se as placas devem ser armazenadas por mais de várias horas, elas devem ser embrulhadas em filme de parafina.
4. Preparação de dissecação, mídia de cultura do neurônio motor e soluções de dissociação
Nota: Concentrações nos parênteses indicam as concentrações finais de cada reagente.
- Prepare o meio de dissecação.
- Descongele o soro de cavalo inativado de calor durante a noite a 4 °C, prepare 1 mL aliquots e guarde a -20 °C. Descongele alíquotas na RT diretamente antes de usar.
- Armazenar B27-suplemento (50x) em 1 mL adiantos a -20 °C. Descongele alíquotas na RT imediatamente antes do uso. Evite ciclos de congelamento/degelo.
- Armazenar suplemento de glutamina (100x) a 4 °C ou -20 °C. Divida em 0,5 mL aliquots se armazenar a -20 °C.
- Armazenar penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) em 1 mL adiantos a -20 °C. Descongele alíquotas na RT imediatamente antes do uso.
- Para tornar a dissecação média, misture 9,4 mL de Hibernate E com 200 μL de soro de cavalo (2%), 200 μL de suplemento 50x B27 (1x), 100 μL de suplemento de glutamina 100x (1x) (por exemplo, GlutaMAX) e 100 μL de 10.000 u/mL penicilina-streptomicia (100 U/mL). Use este meio para coletar tecidos dissecados e fazer a suspensão final de pilhas dissociadas.
- Adicione 500 μL do meio de dissecação a tubos individuais de microcentrífuga de 1,7 mL para a coleta de tecidos no dia anterior ao isolamento do neurônio. Prepare um tubo para cada tipo de tecido que será coletado (por exemplo, controle positivo, controle negativo, CN3/CN4, SMN) e guarde a 4 °C antes do uso.
- Combine 49 mL de hibernar e mídia de baixa fluorescência com 1 mL de suplemento B27 (1x) e preencher uma placa de 24 poços com este meio (2 mL / bem) um dia antes do isolamento do neurônio. Use este prato para coletar embriões de camundongos. Guarde a 4°C antes do uso.
- Prepare o meio da cultura do neurônio motor.
- Prepare 250 μL aliquots de 25 mM 2-mercaptoethanol no meio L15 de Leibovitz. Armazenar a -20 °C.
- Gerar 5 μL alíquotas de 100 μg/mL soluções de BDNF, CNTF e GDNF diluídos em água esterilizada. Armazenar a -80 °C e descongelar alíquos na RT imediatamente antes do uso.
- Prepare a solução de forskolin de 10 mM adicionando 64 μL de dimetil sulfoxida (DMSO) a 5 mg (1,0670 μM) de forskolin e vórtice bem para dissolver completamente. Em seguida, adicione a água esterilizada (1.003 mL) para a solução DMSO e vórtice bem. Armazenar 12 μL alíquotas de 10 mM forskolin a -20 °C e descongelar alíquos em RT imediatamente antes do uso.
- Prepare 12 μL aliquots de 100 mm isobutylmethylxanthine (IBMX) diluído em DMSO. Armazenar a -20 °C e descongelar alíquos na RT imediatamente antes do uso.
- Para tornar o meio da cultura do neurônio motor, misture 9,4 mL de médio neurobasal com 200 μL de soro de cavalo (2%), 200 μL de suplemento 50x B27 (1x), 100 μL de suplemento de glutamina 100x (1x), 100 μL de 10.000 U/m: penicilina-estreptomicina (100 U/mL) e 20 μL de 25 mM 2-mercaptoethanol (50 μM), de preferência diretamente antes do uso. Esta etapa pode ser realizada até 1 dia antes do isolamento do neurônio.
- Pouco antes do uso, adicione 1 μL cada um de 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) e GDNF (10 ng/mL) e 10 μL de 10 mM forskolin (10 μM) e 10 μL de 100 mMMIBMIbmX (100 μM) ao meio de cultura do neurônio motor. Pré-aqueça o meio a 37 °C.
- Prepare as soluções de dissociação.
- Prepare a solução de papaina (20 u/mL papain e 0,005% DNase) e uma solução inibidora albumina-ovomucoide (1 mg/mL inibidor ovomucoid, 1mg/mL albumina e 0,005% DNase) seguindo as instruções do fabricante.
- Prepare 500 μL aliquots de cada um dos inibidores ovomucoides e soluções de papain e armazenar a -80 °C. Descongele alíquos a 37 °C imediatamente antes do uso.
5. Discção do cérebro central e da medula espinhal
Nota: Realize todas as seguintes etapas, exceto para os passos 5.1.1-5.1.3 e 5.1.5-5.1.6 um estómicroscópio de dissecção de dessecção de fluorescência. O tempo total de dissecação por experimento é tipicamente de 3 a 5 h, dependendo da proficiência na técnica de dissecação e do número de neurônios motores necessários para cada experimento.
- Dissecção do midbrain ventral
- Eutanásia um rato grávido aproximadamente 11.5 dias postfertilization pelo gás do dióxido de carbono e pela deslocação cervical.
- Pulverizar o abdômen completamente com etanol e remover o útero usando tesoura de microdisseca estéril e fórceps de vestir o polegar. Lave o útero brevemente em PBS estéril, em seguida, transferir para a placa de dissecação cheia de PBS estéril pré-refrigerados.
- Retire o IslMN:GFP-embriões positivos cuidadosamente do útero usando tesoura supressão estéril, pinças de vestir o polegar e as pinças de #5 Dumont em PBS estéreis gelados a luz brilhante do microscópio. Usando uma colher estéril moria mini-perfurado, transferir cada embrião para um poço separado de uma placa de 24 poços cheio sem hibernação pré-refrigeradas-E médio de baixa fluorescência complementada com 1x B27. Mantenha a placa de 24 poços no gelo.
- Transfira um embrião para uma placa de dissecação estéril e cubra-o completamente com a solução de sal equilibrado de Hank (HBSS) estéril gelado.
- Certifique-se de que as etapas de dissecação sejam realizadas a iluminação do microscópio de isotiocianato (FITC) de fluorescenina (FITC). Usando uma pinça, retire a cauda e a face do embrião sem danificar o midbrain(Figura 2Ba). Coloque o embrião propenso com membros escarranchados por baixo e cauda apontando para a frente do microscópio, em direção ao dessetor (indicado por um asterisco, Figura 2Bb).
- Usando pinças, fenda abrir o telhado do ventrículo quarto, a fim de gerar uma pequena abertura. Use esta abertura para ligar pinças no espaço criado entre o quarto ventrículo e seu telhado. Dissecar ao longo da superfície dorsal do rostral embrião para o córtex e lateral para a placa do piso e coluna motora (Figura 2Ca,b). Abra o tecido dissecado de forma aberta para revelar os núcleos CN3 e CN4 positivos da GFP.
Nota: Um pequeno pedaço de tecido do midbrain ventral contendo mesenchyme, CN3 e CN4 agora será exposto. - Separe cuidadosamente o midbrain ventral do embrião e retire o tecido meningeal usando pinças e uma faca de microdissecting. Dissecar os núcleos bilaterais GFP-positivos CN3 e CN4 longe da placa de assoalho e do outro tecido circunvizinho GFP-negativo usando pinças e uma faca microdissecting(figura 2D). Maximizar o número de neurônios motores GFP-positivos no tecido extisizado, mas evite tocá-los ou danificá-los.
- Se for desejada uma coleção de núcleos CN3 e CN4 separados, corte ao longo da linha média desses dois núcleos (linha pontilhada amarela na Figura 2D). Usando uma pipeta P1000, recolher o tecido do cérebro médio ventral dissecado com HBSS mínimo e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga rotulado de 1,7 mL preenchido com disseção média (ver passo 4.1.5). Guarde no gelo até a dissociação.
- Continue reunindo midbrains ventral de embriões adicionais no mesmo tubo até que o número total atenda à exigência experimental (consulte o passo 8 para números de células ideais).
Nota: Uma coleção agrupada de pelo menos 10 midbrains ventral produzindo aproximadamente 1 x 104 neurônios motores CN3/CN4 é recomendada porque os tecidos estão sujeitos a estresse durante a dissociação e classificação.
- Dissecção da medula espinhal ventral
- Mantenha o embrião propenso com a cabeça voltada para a frente do microscópio, em direção ao dessetor. Segure o embrião com um par de pinças e insira a ponta do outro par de pinças na parte caudal fechada do quarto ventrículo.
- Abra o resto do cérebro traseiro e da medula espinhal dorsalmente sobre toda a extensão rostrocaudal do embrião. Aberto cortando o tecido dorsal, a partir do quarto ventrículo e trabalhando em direção ao canal central da medula espinhal caudal usando as fórceps como tesoura (Figura 2Ca,b). Tome cuidado para evitar tocar ou danificar a medula espinhal ventral durante este procedimento.
- Segure o embrião com um par de pinças e beliscar a aba do tecido dorsal de cada lado com o outro par de pinças (Figura 2Ea, b).
Nota: Os tecidos dorsais extirridos contêm pele dorsal, mesenchyme, gânglios de raiz dorsal (DRGs), cérebro dorsal e medula espinhal. Remova o máximo possível desses tecidos sem danificar os núcleos de SMN, porque eles são adesivos e podem prender SMNs durante a filtragem ou causar entupimento durante a classificação da FACS. - Retire a medula espinhal ventral usando a faca de microdissese para perfurar diretamente abaixo do GFP positivo SMN. Levante a medula espinhal ventral com movimentos de serra em ambos os lados (Figura 2Fa,b). Corte a medula espinhal ventral flutuante transversalmente acima do C1, onde os primeiros projetos anteriores positivos do CHIFRE GFP positivos(Figura 2G). Além disso, corte transversalmente no limite superior do membro inferior (Figura 2G). Retire a parte cervical (C1)-lombar (L2-L3) da medula espinhal ventral após este procedimento.
- Coloque a medula espinhal ventral lado dorsal para cima e segure pressionando o tecido GFP-negativo entre as colunas GFP-positivo SMN com um par de pinças. Retire o restante ligado mesenchyme, DRGs, e medula espinhal dorsal, aparando ambos os lados da coluna GFP-positivo SMN com a faca de microdissese (Figura 2H). Tome cuidado para maximizar os neurônios motores GFP-positivos sem danificá-los.
- Usando uma pipeta P1000, colete o tecido da medula espinhal ventral dissecado com HBSS mínimo e coloque no tubo de microcentrífuga de 1,7 mL rotulado por SMN preenchido com disseção média. Guarde no gelo até a dissociação. Continue reunindo medulas espinhais ventral de embriões adicionais no mesmo tubo até que o número total atenda aos requisitos experimentais.
Nota: A coleta de pelo menos três medulas espinhais ventrais que produzem aproximadamente 2,1 x 104 SMN é recomendada porque os tecidos estão sujeitos a estresse durante a dissociação e classificação. - Coletar neurônios motores faciais e extremidades do IslMN: embriões de camundongos GFP como controles GFP-positivos e GFP-negativos para triagem celular ativada por fluorescência (FACS), respectivamente. As extremidades são GFP-negativas porque os axônios GFP-positivos dos SMNs não estenderam ainda nas extremidades nesta idade embrionária.
6. Dissociação do tecido
Nota: O tempo total de dissociação é tipicamente de 1,5 h por experimento.
- Papain a quente e solução inibidora albumina-ovomucoide alíquotas a 37 °C 30 min antes da dissociação.
- Gire brevemente para baixo tecidos microdissecados em uma baixa velocidade.
- Usando uma pipeta P100, retire cuidadosamente o máximo de Hibernate E possível, sem aspirar tecidos.
Nota: Certifique-se de remover todos os resíduos Hibernate E após esta etapa para evitar reduzir a eficácia da dissociação papain na próxima etapa. - Adicione o volume apropriado de solução de papaina(Tabela 1)a cada um dos tubos de microcentrírífuga de 1,7 mL contendo as amostras de tecido microdissecado.
Nota: O volume apropriado de papain para a dissociação foi determinado a fim de maximizar a dissociação efetiva, minimizando o estresse nas células. - Triturar suavemente 8x com uma pipeta P200. Executar todos os passos de trituração suavemente para preservar a viabilidade do neurônio motor.
- Incubar os tubos que contêm os tecidos por 30 min a 37 °C, agitando por dedo flicking 10x cada 10 min. Gentilmente triturar cada suspensão 8x com uma pipeta P200 após a incubação. Desça as células a 300 x g por 5 min.
- Para garantir a eficácia da inibição ovomucoiid na próxima etapa, use uma pipeta P1000 para remover e descartar o máximo possível de supernatant sem aspirar os tecidos.
- Resuspenda as pelotas no volume apropriado de solução inibidora albumina-ovomucoide(Tabela 1)triturando suavemente 8x com uma pipeta P200.
- Espere por 2 min para permitir que todos os pedaços restantes de tecido não dissociado para resolver para o fundo do tubo.
- Colete o máximo possível de supernatant sem aspirar tecidos não dissociados usando uma pipeta P200. Transfira o supernatant para tubos de microcentrífuga de 1,7 mL frescos.
- Se alguns pedaços de tecido permanecem não dissociados após o passo 6.10, repita passos 6.8-6.10 para os tecidos não dissociados que permanecem nos tubos de microcentrífuga original de 1,7 mL para maximizar o rendimento final de células dissociadas, minimizando o estresse nas células dissociado anteriormente, contido no supernatant da etapa 6.10.
- Desça as células a 300 x g por 5 min. Retire e descarte cuidadosamente o supernatant usando uma pipeta P1000.
- Resuspenda a pelota no volume apropriado de meio de dissecação(Tabela 1)canalizando 8x usando uma pipeta P1000. O volume apropriado de suspensão final foi determinado para que a densidade celular não exceda 107 células/mL, o que pode bloquear o fluxo da máquina de citometria de fluxo, mas também para que as células não sejam excessivamente diluídas, o que resulta em uma velocidade de classificação retardada.
- Filtrar as suspensões através de filtros de células de 70 μm para eliminar quaisquer grandes grupos ou tecido não digerido. Transfira as suspensões para tubos de teste de poliestireno de fundo redondo de 5 mL e guarde no gelo até que seja necessário.
7. Triagem celular ativada por fluorescência (FACS)
Nota: Este protocolo foi otimizado usando um classificador FACS equipado com um laser violeta de 15 mw 405 nm, um laser azul de 100 mw 488 nm, um laser laranja de 75 mw 594 nm e um laser vermelho de 40 mw 640 nm. As células foram classificadas como fluido de bainha em PBS estéreis condições assépticas através de um bico de 100 μm. Para minimizar o estresse celular, a taxa de fluxo foi definida como uma pressão amostral de 1 a 3, de tal forma que foram adquiridos um máximo de 1.000 a 4.000 eventos por segundo. O tempo total da FACS é tipicamente de 1 a 2 h por experimento.
- Configurar tensões para a frente e para o lado dispersar para que a população celular pode ser visualizado corretamente. A configuração de tensões apropriadas para a classificação celular é complexa e requer um operador facs experiente.
- Para distinguir diferentes populações celulares, as células do lote com base no tamanho determinado pela Área de Dispersão Avançada (FSC-A) versus complexidade interna, conforme determinado pela Área de Dispersão Lateral (SSC-A). Desenhe um portão em torno das células vivas, como indicado na Figura 3Aa e Figura Ba para excluir detritos e células mortas. Agrupar as células dentro da região fechada como população 1 (P1).
- Para excluir grupos celulares e dobradas, as células P1 do lote em seguida com base na largura de dispersão lateral (SSC-W) versus o SSC-A. Portão da população de células individuais como população 2 (P2) (Figura 3Ab e Figura Bb).
- Células P2 do lote baseadas na largura dianteira da dispersão (FSC-W) contra o FSC-A e portam a população de únicas pilhas como a população 3 (P3) (figura 3Ac e figura Bc).
NOTA: O uso de dois portões consecutivos em 7,3 e 7,4 exclui grupos celulares e dobradas (FSC-W alto e fsc-a alta). - Células Gate P3 com base em GFP versus alofitacina (APC). O canal APC detecta a autofluorescência. Gating neste canal evita capturar células autofluorescentes. Use células GFP-negativas para ajustar a tensão para canais fluorescentes FITC/GFP. Idealmente, portões de posição para essas populações celulares em torno de 102. Selecione limites de portão para gfp-positivo população 4 (P4) individualmente para cada tipo de neurônio motor (Figura 3Anúncio e Figura Bd).
Nota: Defina o portão GFP muito maior para SMNs do que para CN3s/CN4s, a fim de obter uma cultura pura (Figura 3Anúncio e Figura Bd). Uma porta mais baixa do GFP para culturas de SMN conduz à contaminação das culturas por neurônios do glia e do non-motor. Isto é provável porque há expressão gfp de baixo nível em alguns neurônios glia e não-motor devido a um promotor com vazamento. A porcentagem de células GFP-positivas em comparação com o total de células é tipicamente de 0,5 a 1,5% para CN3s/CN4s e 1,5 a 2,5% para SMNs. Se a dissecação foi bem sucedida, esses números podem ser usados como referência para determinar a posição apropriada para o portão POSITIVO GFP (Figura 3Ae e Figura Seja). - Executar FACS de acordo com o protocolo do fabricante. Coletar células P4 em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL frescos preenchidos com 500 μL de meio de cultura do neurônio motor. Guarde no gelo até o revestimento.
Nota: Embora as células possam ser classificadas diretamente nos poços, isso resulta em um número desigual de células por poço. Classifique as células em tubos de microcentrífuga de 1,75 mL e, em seguida, placa manualmente, a fim de alcançar uma distribuição de revestimento mais uniforme.
8. Cultura dos Neurônios Motores Primários Purificados
- As suspensões cn3/CN4 e SMN isoladas pela FACS com o meio de cultura do neurônio motor pré-aqueçam a 37 °C a densidades de 5 x 103 e 1 x 104 células/mL, respectivamente.
Nota: Um embrião E11.5 produz aproximadamente 1 x 103 CN3/CN4 e 7 x 103 SMN. No entanto, esses rendimentos dependem fortemente da pureza dos tecidos dissecados, do rigor da dissociação celular e do limite adequado dos portões gfp durante a FACS. - Transfira 96 placas de poço pré-revestidas com PDL e laminina da incubadora de cultura de tecido de 37 °C para o capô de fluxo laminar e pirata de laminado laminado de cada poço. Use pratos e lábios covers imediatamente sem lavar.
- Adicione 200 μL de suspensões diluídas CN3/CN4 e SMN em cada poço de placas de poço sinie/96 revestidas de PDL/laminado. As densidades celulares finais devem ser de 1 x 103 e 2 x 103 células/poço para CN3/CN4 e SMN, respectivamente.
Nota: A densidade inicial de revestimento de SMNs em 96 placas de poço (2 x 103 células/poço) é o dobro da cn3s/CN4s (1 x 103 células/poço) para obter números e densidades de neurônios motores finais semelhantes em 2 e 9 dias in vitro (DIV) (4-6 x 102 e 2-4 x 102 células por poço, respectivamente). - Neurônios culturais em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2.
- Alimentar os neurônios a cada 5 dias, removendo metade da mídia antiga (100 μL) e substituindo com o mesmo volume de meio de cultura do neurônio motor fresco. Certifique-se de que os processos neuronais se tornem visíveis em 1 DIV e se tornem mais grossos e mais longos por 14 DIV(Figura 4). Corpos celulares neuronais tornam-se ampliados e tendem a se agregar em culturas de longo prazo, particularmente para SMNs (Figura 4).
Nota: Realize todas as mudanças de médio e solução, deixando metade do volume médio original, a fim de evitar a desapego de células cultivadas. Isso inclui fixação e imunocitoquímica (ICC) etapas. Se todos os meios são removidos, não obstante como delicadamente, a maioria das pilhas destacarão e serão lavadas afastado.
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Representative Results
O objetivo deste protocolo era purificar e cultura altamente tanto cn3s primários / CN4s e SMNs a longo prazo para permitir análises comparativas dos mecanismos subjacentes distúrbios do neurônio motor (ver Figura 1 e Figura 2 para visão geral).
Uma vez que os neurônios foram isolados com sucesso e crescidos na cultura, quase puro cn3 primário/cn4 e smn culturas foram obtidas (Figura 5A,B)e mantido por pelo menos 14 DIV (Figura 4 e Figura 6). As purezas das culturas CN3/CN4 e SMN em 2 DIV foram 93,5 ± 2,2% e 86,7 ± 4,7%, respectivamente, quando avaliadas pelo ICC usando o marcador do neurônio motor Islet1 e marcador neuronal TUJ1 (Figura 5B). No entanto, essas altas purezas dependiam fortemente da idade dos embriões e da fixação de limites adequados para portões gfp durante facs (figura 3). Dissecção de embriões em E10.5 é mais difícil do que a dissecação em E11.5 devido ao aumento da suavidade e adesividade dos tecidos, resultando na diminuição dos rendimentos dos neurônios motores. No entanto, as purezas dos E10,5 CN3s/CN4s e SMNs foram comparáveis às dos embriões E11,5 (92,8% e 82,2% em 2 DIV, respectivamente; dados obtidos a partir de um único experimento). As purezas das CN3s/CN4s e SMNs diminuíram drasticamente quando foram utilizados embriões E13,5, mesmo que apenas a maior população positiva do GFP tenha sido coletada (20,7% e 7,4% em 2 DIV, respectivamente; dados obtidos de um único experimento), provavelmente devido à expressão de GFP em neurônios não motores (Figura 7). Esta mesma tendência também se manteve fiel às culturas E12.5, embora tenha sido muito menos dramática. Portanto, embriões em E12.5 ou mais são inadequados para uso na purificação de neurônios motores usando este protocolo.
Culturas de neurônios motores puros são valiosas para a compreensão de padrões de crescimento isolados, comportamentos e vulnerabilidades dos neurônios motores. Este exemplo demonstra como essas culturas podem ser usadas para testar as respostas dos neurônios motores ao tratamento químico. Para determinar se cn3s primários/CN4s e SMNs mostram respostas diferenciais aos estressores endoplasmic reticulum (ER), as monoculturas primárias dos CN3s/CN4s e SMNs foram obtidas usando este protocolo e tratadas com diferentes concentrações de um estressor er, ácido cicopiazonic (CPA). Os neurônios foram tratados com CPA (5, 10, 15, 20, 25 ou 30 μM) ou controle do veículo (DMSO) em 2 DIV e fixados 3 dias depois para que o ICC avalie as proporções de sobrevivência (Figura 8A). O número de neurônios viáveis em cada amostra foi contado e as proporções de sobrevivência foram calculadas como o número de células viáveis em poços tratados com drogas divididos pelo número de células viáveis nos poços tratados com DMSO. As monoculturas CN3/CN4 foram significativamente mais resistentes ao tratamento do CPA (10 a 25 μM) em comparação com as monoculturas SMN (Figura 9 e Figura 8B)31.
Em conclusão, este protocolo permite a geração de culturas embrionárias altamente purificadas do rato primário CN3/CN4 e SMN que fornecem um sistema poderoso e confiável para a investigação do comportamento neuronal.
Figura 1: Esquema para a preparação de neurônios motores embrionários do rato. O esquema ilustra os passos envolvidos no isolamento e cultura dos neurônios motores embrionários de camundongos e o tempo aproximado em horas ou dias para cada etapa. A ordem do procedimento de dissecação para CN3/CN4 e para SMN são cada um rotulado sequencialmente 1 a 4. Abreviaturas: CN3/CN4 = neurônio oculomotor/neurônio trochlear; SMN = neurônio motor espinhal; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; h = hora; d = dia. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Dissecação do cérebro central ventral e da porção cervical (C1)-lombar (L2-L3) da medula espinhal ventral. (A) Vistas laterais(a)e dorsal(b)dos neurônios motores POSITIVOs gfp em um e11.5 IslMN:GFP embrião de camundongo transgênico iluminação de isotiocianato fluoresceina (FITC). Um embrião e11.5 de montagem inteira foi preparado como descrito previamente32 a fim fazer o embrião transparente. Posteriormente, o embrião foi analisado por rotulagem de imunofluorescência com coloração anti-GFP (verde). As imagens foram capturadas um microscópio confocal. Barras de escala = 200 μm (vista lateral) e 400 μm (vista dorsal). Abreviaturas: S = superior; Eu = inferior; V = ventral; D = dorsal. (B-H) Passos de dissecção destacados em imagens de tecidos de medula espinhal estereotipada e ventral e encadernais e encadernais e de saciparados e 11,5 com uma câmera equipada luz brilhante (Bb) ou fitc usando um estóscópio de dissecção de dissecção de fluorescência. Barras de escala = 200 μm (D) e 1 mm (A-C, E-H). (B) (a)Remoção do rosto e cauda do embrião, cortando ao longo das linhas vermelhas. (b)Embrião posicionado para dissecação. O posicionamento da frente do microscópio é indicado por um asterisco. Corteao longo da linha vermelha sólida para abrir o telhado do quarto ventrículo(a)visão lateral e(b)vista dorsal. Uso desta abertura para cortar ao longo da superfície do embrião dorsal para o cérebro (trajetória indicada pela seta vermelha tracejada). Isso expõe o tecido contendo mesenchyme, CN3 e CN4, que podem ser retirados do crânio. Para a dissecação de SMN, a inserção de fórceps na mesma abertura entre o quarto ventrículo e seu telhado, em seguida, cortando em direção ao lado caudal do embrião (trajetória indicada pela seta amarela frustrada). (D)Visão final do midbrain ventral contendo núcleos bilaterais GFP-positivos CN3 e CN4. As bordas do tecido são destacadas por um retângulo vermelho. Cortando a linha pontilhada amarela para coletar núcleos CN3 e CN4 separadamente, se desejar. (E)Depois de abrir o resto do cérebro e da medula espinhal, agitando tecidos dorsais beliscado fora acima das linhas vermelhas de ambos os lados com pinças (a) antes, e (b) depois. (F)Remoção bilateral do excesso de tecido ventral para a medula espinhal ao longo da linha vermelha(a)antes, e (b) depois. Corteda medula espinhal ventral nos dois locais indicados pelas linhas vermelhas. No lado rostral, o corte da medula espinhal ventral flutuante transversalmente acima c1 onde o primeiro GFP-positivo projetos anteriores chifre. Corte da extremidade caudal da medula espinhal transversalmente no limite superior do membro inferior. Uma vez que estes cortes são feitos, o cervical (C1) através da parcela lombar (L2-L3) da medula espinal ventral pode ser dissecado afastado. (H)Visão final da medula espinhal ventral contendo colunas SMN positivas gfp. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Parcelas representativas da sorte de midbrains ventral (A) e de cordas espinal ventral (B). (Aa e Ba) Forward Scatter Area (FSC-A) versus Side Scatter Area (SSC-A) classificou o lote antes da exclusão de detritos e células mortas. (Ab, Bb, Ac, Bc) Parcelas classificadas para exclusão de grupos celulares(b)e duplas(c)com base na largura (SSC-W) versus SSC-A e Forward Scatter Width (FSC-W) versus FSC-A, respectivamente. (Anúncio e Bd) Parcelas classificadas para isolar IslMN:GFP -neurônios motores positivos. Para obter uma cultura pura, o portão GFP deve ser definido mais alto para SMNs(Bd)do que para CN3s/CN4s(anúncio). (Ae e Be) Porcentagens de células fechadas para coleta pela classificação facs. %Parent representa a porcentagem de células na população atual fechada em relação ao número de células na população de células fechadas anteriores, enquanto o %Total representa a porcentagem de células fechadas em relação ao total de células. As percentagens esperadas de células GFP-positivas em comparação com o total de células (encaixotadas em vermelho) são de 0,5 a 1,5% para CN3/CN4 e 1,5 a 2,5% para a SMN. Se a dissecação foi realizada com sucesso, essas porcentagens podem ser usadas como referência para configurar o portão POSITIVO GFP em (Anúncio e Bd). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Imagens de contraste de fase das monoculturas CN3/CN4 e SMN primárias em 2, 7 e 14 DIV. As imagens representativas de contraste de interferência diferencial das culturas CN3/CN4 e SMN primárias foram capturadas em 2, 7 e 14 DIV com microscópio de fluorescência invertida usando software de aquisição e processamento de imagem correspondente e objetivos 40x. Os processos neuronais tornaram-se mais grossos e mais longos por 14 DIV. Os tamanhos do corpo da pilha neuronal tornaram-se ampliados e tenderam a agregar em culturas a longo prazo, especial para SMNs. Ambas as culturas podem ser mantidas pelo menos 14 DIV. Barra de escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Caracterizações de culturas isoladas do rato CN3/CN4 e SMN do rato E11.5. (A)Imagens representativas de imunocitoquímica de E11.5 mouse CN3s/CN4s (superior) e SMNs (inferior) cultivados para 2 DIV. Imunofluorescência rotulando com o marcador neuronal TUJ1 (verde) e o marcador do neurônio motor Islet1 (vermelho) realizado para analisar neurônios e núcleos foram contra-identificados com DAPI (azul). Quase todas as células cultivadas eram neurônios motores (TUJ1+, Ilhota+ ). As imagens foram capturadas com um microscópio invertido da fluorescência usando o software correspondente da aquisição e do processamento da imagem e os objetivos 20x. As amostras foram imagemdas e processadas para atingir a intensidade máxima do sinal sem pixels saturados. Todo o trabalho microscópico e processamento de imagem nos seguintes números foram realizados nessas condições, a menos que especificado de outra forma. Barra de escala = 100 μm. (B) As purezas das culturas E11.5 mouse CN3/CN4 e SMN em 2 DIV. As purezas das culturas CN3/CN4 e SMN foram de 93,5 ± 2,2% e 86,7 ± 4,7%, respectivamente. Os corpos de células neuronais mortas foram avaliados pelo rastreamento de morfologia nuclear pyknotic e inchaço da membrana. Os processos neuronais foram classificados como processos de degeneração quando foram observados sinais de beading e inchaço. Células sem morte corporal celular nem processos dedegeneração foram consideradas neurônios não motores viáveis (TUJ1+,Ilhota1-) ou neurônios motores viáveis (TUJ1+, Islet1+)33. As purezas das culturas de neurônios motores foram calculadas como o número de neurônios motores viáveis divididos pelo número total de neurônios não motores viáveis mais neurônios motores viáveis. Os valores representam a média ± SEM de três experimentos separados. Não é significativo (p > 0,05) pelo teste t do aluno. A contagem celular foi realizada manualmente ampliação de 20x. Abreviaturas: SEM = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Imunocitoquímica representativa das monoculturas cn3/CN4 e SMN primárias em 2, 7 e 14 DIV. As culturas primárias CN3/CN4 e SMN foram analisadas em 2, 7, 14 DIV por rotulagem de imunofluorescência com TUJ1 (verde), e os núcleos foram contatados com DAPI (azul). Os processos neuronais tornam-se mais grossos e mais longos por 14 DIV. Os tamanhos do corpo da pilha neuronal tornaram-se ampliados e tenderam a agregar em culturas a longo prazo, particular para SMNs. Ambas as culturas CN3/CN4 e SMN podem ser mantidas pelo menos 14 DIV. As imagens foram capturadas ampliação 10x. Barra de escala = 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 7: Caracterização das culturas isoladas e CN3/CN4 e SMN do rato E13.5. E13.5 CN3/CN4 e SMN foram isolados e cultivados por meio desse protocolo e analisados em 2 DIV por imunofluorescência com TUJ1 (verde) e Ilhota1 (vermelho), e os núcleos foram contados com DAPI (azul). Muitas células neuronais não motoras (TUJ1+, Ilhota1-) estavam presentes (setas), resultando em uma diminuição drástica na pureza CN3/CN4 e SMN, com a diminuição mais acentuada nas culturas de SMN. As imagens foram capturadas ampliação 20x. Barra de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 8: Aplicação representativa da cultura primária do neurônio motor demonstrando que cn3s/CN4s são seletivamente resistentes ao estresse do ER induzido pelo CPA. (A) Esboço experimental: as monoculturas CN3/CN4 e SMN primárias foram tratadas com CPA ou controle de veículos (DMSO) em 2 DIV e viabilities celulares foram avaliados por meio de análise imunocitoquímica após 3 dias de tratamento. Este esboço foi modificado do trabalho publicado31. (B) Quantificação das proporções de sobrevivência de CN3s/CN4s e SMNs tratados com CPA de 5 a 30 μM por 3 dias a partir de 2 DIV. Os neurônios foram analisados pela rotulagem imunofluorescente de células com TUJ1, e os núcleos foram contra-testados com DAPI. As proporções de sobrevivência foram calculadas como o número de células viáveis (ver Figura 5B legenda) em poços tratados com drogas divididos pelo número de células viáveis em poços contendo veículo sozinho (DMSO). A contagem celular foi realizada manualmente ampliação de 20x. Os valores representam a média ± SEM de quatro experimentos separados. *p< 0,05; p < 0,005 pelo teste do estudante t. Este número foi modificado a partir de trabalhos publicados anteriormente31. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 9: Imunocitoquímica representativa das monoculturas cn3/CN4 e SMN primárias após uma exposição de 3 dias ao aumento das concentrações de CPA a partir de 2 DIV. Os neurônios foram analisados por rotulagem imunofluorescente de células com TUJ1 (verde) e núcleos foram contados com DAPI (azul). Cn3s primários/CN4s foram mais resistentes ao tratamento de CPA do que as SMNs primárias. As imagens foram capturadas ampliação de 10x. Barra de escala = 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Número de midbrains (X) | Papaína | Albumin-ovomucoid Albumin-ovomucoid | Hibernate E | |||||||||
| 10 ≤X ≤20 | 200 μL 200 μL | 100 μL 100 μL | 600 μL | |||||||||
| 20 < X ≤30 | 300 μL | 150 μL 150 μL | 700 μL | |||||||||
| 30 < X ≤40 | 400 μL 400 μL | 200 μL 200 μL | 800 μL 800 μL | |||||||||
| Número de medulas espinhais (Y) | Papaína | Albumin-ovomucoid Albumin-ovomucoid | Hibernate E | |||||||||
| 3 ≤Y ≤5 | 200 μL 200 μL | 100 μL 100 μL | 500 μL 500 μL | |||||||||
| 5 < Y ≤10 | 400 μL 400 μL | 200 μL 200 μL | 800 μL 800 μL | |||||||||
| 10 < Y ≤15 | 600 μL | 300 μL | 1200 μL 1200 μL | |||||||||
Tabela 1: Volumes apropriados de papaina, albumina-ovomucoid e suspensão final usados em etapas de dissociação. Os volumes apropriados de papaina e albumina-ovomucoid para ser usado com vários números de midbrain ventral e tecidos ventral da medula espinhal foram modificados a partir das instruções do fabricante após várias rodadas de otimização. Como os tecidos estão sujeitos a estresse durante a dissociação e classificação, recomenda-se uma coleção agrupada de mais de 10 midbrains ventral e mais de três medulas espinhais ventrais. O volume de papain foi determinado considerando o equilíbrio entre dissociação efetiva e o estresse desse procedimento. O volume de solução inibidor albumina-ovomucoide é metade do do papain. O volume apropriado de suspensão final hibernate E foi determinado de tal forma que a densidade celular não excede 107 células /mL, mas as células não se tornam excessivamente diluídas.
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Discussion
Historicamente, estudos in vitro de neurônios motores CN3 e/ou CN4 têm contado com culturas heterogêneas como dissociada17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26,e fatia27,28 culturas, porque essas células não podem ser distinguidas células circundantes com base no tamanho, e marcadores específicos para essas células não foram relatados. O protocolo atual é um método abrangente para o isolamento e a cultura dos CN3s/CN4 primários e sminários dos mesmos embriões e confirmar a alta pureza das culturas. Ao gerar culturas puras de SMN e CN3/CN4 a partir dos mesmos embriões de camundongos, o protocolo permite comparações controladas dos comportamentos in vitro de CN3s/CN4s versus SMNs isolados do tipo selvagem, bem como embriões mutantes.
As culturas puras de CN3s/CN4s e SMNs geradas por este protocolo permitem estudos comparativos de características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas desses neurônios motores. Em teoria, como outras populações de neurônios motores cranianos podem ser visualizadas e dissecadas a partir desta linha de camundongo transgênico IslMN:GFP (incluindo abducens, motor trigeminal, facial e hipoglossal), esse protocolo poderia ser expandido por seu isolamento e cultura também, desde que os portões FACS GFP sejam ajustados adequadamente. Finalmente, os neurônios motores classificados pela FACS derivados deste protocolo podem ser submetidos a análises genômicas (por exemplo, de talo para a Cromatina acessível à Transposase usando sequenciamento, ou ATAC-seq) e/ou transcriptômica (por exemplo, sequência de RNA31) para estudar o desenvolvimento normal e a vulnerabilidade seletiva de subtipos específicos de neurônios motores em distúrbios neurodegenerativos31.
Existem vários passos neste protocolo que são fundamentais para maximizar o número de neurônios motores puros e saudáveis no sistema de cultura isolada. Durante a dissecação, os tecidos NEGATIVOS GFP (por exemplo, mesenchyme e DRGs) devem ser maximamente removidos sem danificar os neurônios motores, porque esses tecidos são adesivos e podem prender SMNs durante a filtragem ou causar entupimento durante a classificação facs. Durante a dissociação do tecido, o volume essencial mínimo de papaina deve ser usado, e as células devem ser tratadas suavemente com trituração mínima, mas suficiente. Papain foi usado para a etapa de dissociação de tecidos neste protocolo, pois os dados preliminares indicaram que é menos destrutivo do que a trippsina tanto para CN3/CN4 quanto para a SMN. Os índices de sobrevivência com base nos números banhados de CN3s/CN4s e SMNs em 2 DIV aumentaram de 39,5% para 52,7% e de 52,3% para 58,4%, respectivamente, quando a papaina foi utilizada em vez de trippsina (0,25%, 4 incubação de incubação de 4 min). Embora esses números sejam derivados de um único experimento realizado antes da otimização completa, relatórios adicionais também sugerem que a trippsina é subótima para extração celular de tecidos do sistema nervoso12,34,35,36. Durante a FACS, corantes vitais fluorescentes (propídio iodeto e calcein azul) e pequenos bicos de classificação (por exemplo, 70 μm) não devem ser usados, pois são deletérios para a sobrevivência do neurônio motor. O uso de grandes bicos de classificação (100 μm ou maior) é altamente recomendado, pois a morte celular de SMN aumenta significativamente quando um bico de 70 μm é usado. Definir os limites apropriados para células positivas para GFP na FACS é um passo crítico para obter culturas puras. As culturas de neurônios motores são complementadas com forskolin, IBMX e fatores de crescimento (BDNF, CNTF e GDNF). Forskolin e IBMX foram relatados para promover aditivosmn sobrevivência 37,38. Dados preliminares dos estudos atuais sugerem que forskolin e IBMX também aumentam avidade do CN3/CN4. A razão de sobrevivência com base no número de CN3s/CN4 sem 2 DIV aumentou de 17,5% para 26,9%, 31,9% e 37,0% quando ibmx, forskolin, e IBMX+forskolin foram adicionados, respectivamente (os números são baseados em um único experimento realizado antes da otimização completa das condições da cultura celular). É melhor realizar todas as mudanças e lavagens médias de células cultivadas, deixando metade do volume original para evitar o destacamento de células cultivadas. Finalmente, também é ideal reduzir o tempo gasto entre dissecação e revestimento de neurônios motores (por exemplo, encurtando o tempo de dissecação usando vários dissectors) para melhorar a viabilidade das culturas.
Há quatro grandes problemas potenciais que podem surgir ao seguir este protocolo. O primeiro é o baixo rendimento dos neurônios motores após facs. As causas potenciais para baixos rendimentos incluem o uso de embriões jovens (por exemplo, E10.5), que têm menos neurônios motores, remoção insuficiente de tecidos gfp-negativos adesivos durante a dissecação (por exemplo, mesenchyme e DRGs), que podem prender neurônios motores e levar à sua remoção durante a filtragem, a desisção insuficiente de papanação/trituração durante a disseção e/ou a configuração do portão GFP-positivo para alta durante a FACS. O segundo problema potencial é a baixa pureza das culturas de neurônios motores, que provavelmente surge a partir do uso de embriões mais antigos (por exemplo, E12,5) e/ou de definir o portão POSITIVO-GFP muito baixo durante a FACS. Em terceiro lugar, um baixo número de neurônios motores anexados na cultura pode ser observado devido à classificação facs inadequada e/ou revestimento inadequado de PDL/laminina de placas/coverslips. Em quarto lugar, os neurônios motores podem mostrar baixa viabilidade na cultura. As causas potenciais de baixa viabilidade incluem dissecção áspera e/ou prolongada, papainização/trituração excessiva durante dissociação, manuseio inadequado de células em todo o protocolo (por exemplo, tubulação áspera de células, falha em colocar células no gelo, falha em pré-chill PBS e HBSS), e/ou tempo excessivo entre a eutanásia de camundongos grávidas e o revestimento final das células. O uso de reagentes que não são concentrações frescas e/ou inadequadas também pode prejudicar os resultados experimentais.
Há três limitações principais deste protocolo. IslMN: Ratos transgênicos GFP e classificação FACS são bastante caros. Eles são, no entanto, cruciais para este protocolo, pois atualmente não há nenhum método alternativo capaz de gerar CN3s/CN4 altamente purificados de forma mais econômica. Há uma pequena janela etária E10.5-E12.5 para os camundongos embrionários, e é difícil confirmar que embriões devidamente envelhecidos estão presentes, especialmente se uma máquina de ultrassom não estiver disponível. Se apenas smns puros são necessários, eles podem ser derivados de e12.5-15.0 embriões de camundongos usando métodos como centofugação gradiente10,11,12, 12 e/ou p75NTR-anticorpo-based cell-sorting panning técnicas13,14,15,16. Finalmente, os ensaios à base de proteínas que exigem uma grande quantidade de material inicial não são viáveis a partir dessas culturas devido ao pequeno rendimento de neurônios motores (especialmente CN3s/CN4s). Os neurônios motores derivados de células-tronco31,39,que podem ser gerados sem limites, poderiam, em teoria, ser substituídos por esse propósito.
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Disclosures
Os autores declaram nenhum conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos a Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, EUA) por instrução em técnicas de dissecação da SMN; O Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, a Immunology Division Flow Cytometry Facility da Harvard Medical School, o Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core e Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, membros adicionais do laboratório de Engle e membros do consórcio do Projeto ALS para assistência técnica e discussão ponderada. Este estudo foi apoiado pelo Projeto ALS. Além disso, a R.F. foi financiada pela Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant No exterior e pela bolsa de treinamento do NIH Em Genetics T32 GM007748; J.J. foi apoiado pelo programa de treinamento NIH/NEI nas Bases Moleculares de Doenças Oculares (5T32EY007145-16) através do Schepens Eye Research Institute e pelo Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) através do Boston Children's Hospital; M.C.W foi apoiado pela NEI (5K08EY027850) e pela Children's Hospital Ofthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); e.C.E. é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
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