العزلة والثقافة من محرك للعين ، تروشلير ، والخلايا العصبية موتور الشوكي من السابق للولادة Islmn: Gfp الفئران المحورة وراثيا
Summary
يقدم هذا العمل بروتوكولا لإنتاج ثقافات الخلايا المتجانسة لمحرك للعين الاوليه ، والخلية العصبية الحركية الشوكية. يمكن استخدام هذه الثقافات للتحليلات المقارنة للخصائص المورفولوجية والخلوية والجزيئية والكهربية للخلايا العصبية الحركية في العين والعمود الفقري.
Abstract
الخلايا العصبية محرك للعين (CN3s) والخلايا العصبية تروتشلير (CN4s) يحمل مقاومه ملحوظة للامراض العصبية التنكسية الحركية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) بالمقارنة مع الخلايا العصبية الحركية الشوكي (SMNs). القدرة علي عزل وثقافة الماوس الأساسي CN3s ، CN4s ، و SMNs من شانه ان يوفر نهجا لدراسة أليات الكامنة وراء هذه الثغرة الانتقائية. وحتى الآن ، تستخدم معظم البروتوكولات ثقافات الخلايا غير المتجانسة ، التي يمكن ان تجد تفسيرا للنتائج التجريبية. وللتقليل إلى ادني حد من المشاكل المرتبطة بمجموعات الخلايا المختلطة ، لا غني عن الثقافات البحتة. هنا ، يصف البروتوكول الأول بالتفصيل كيفيه تنقيه وزراعه CN3s/CN4s بالاضافه إلى نظراء SMNs من نفس الاجنه باستخدام اليوم الجنيني 11.5 (E 11.5) IslMN: أجنه الفئران المحورة وراثيا gfp. ويوفر البروتوكول تفاصيل عن تشريح الانسجه والتفكك ، وعزل الخلايا القائم علي FACS ، وزراعه الخلايا في المختبر من CN3/CN4 ونوى SMN. يضيف هذا البروتوكول رواية في المختبر CN3/CN4 نظام الثقافة إلى البروتوكولات القائمة ويوفر في وقت واحد ثقافة SMN الأنواع النقية والمطابقة للعمر للمقارنة. التحليلات التي تركز علي الخصائص المورفولوجية والخلوية والجزيئية والكهربية للخلايا العصبية الحركية ممكنة في هذا النظام الثقافي. هذا البروتوكول سوف تمكن البحوث في أليات التي تحدد تطوير الخلايا العصبية الحركية ، والضعف الانتقائي ، والمرض.
Introduction
ثقافة الخلايا العصبية الحركية الاوليه هي أداه قويه تمكن من دراسة تطور الخلايا العصبية ، وظيفة ، والقابلية للإجهادات الخارجية. الثقافات العصبية الحركية مفيده بشكل خاص لدراسة الامراض العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS)1,2, الذي أليات المرض غير مفهومه تماما. ومن المثير للاهتمام ، علي الرغم من وفاه خليه كبيره من الخلايا العصبية الحركية الشوكية (smns) في كل من المرضي als والفئران نموذج als ، وفاه الخلية في الخلايا العصبية محرك للعين (CN3s) والخلايا العصبية تروتشلير (CN4s) نادرهنسبيا1،3،4،5،6 ولذلك ، فان التحليلات المقارنة للثقافات المحضة CN3s/CN4s و SMNs يمكن ان توفر أدله هامه حول أليات الكامنة وراء الضعف النسبي. ولسوء الحظ ، كان العائق الرئيسي لهذه التحاليل هو عدم القدرة علي زراعه الثقافات المنقية لهذه الخلايا العصبية الحركية.
وقد تم وصف العديد من البروتوكولات لتنقيه SMNs من النماذج الحيوانية. معظم هذه البروتوكولات استخدام التدرج الكثافة طرد10،11،12 و/أو p75ntr-الأجسام المضادة القائمة علي الخلية فرز تقنيات بالغسل13،14،15،16. طرد التدرج الكثافة يستغل حجم أكبر من SMNs نسبه إلى الخلايا الشوكية الأخرى ، في حين p75Ntr هو بروتين خارج الخلية التي أعرب عنها حصرا smns في الحبل الشوكي. وقد تم توليد ما يقرب من 100 ٪ من الثقافات smn نقيه من قبل واحد أو كل من هذين البروتوكولين11،12،14. ومع ذلك ، لم تنجح هذه البروتوكولات في توليد ثقافات CN3/CN4 لان CN3s/CN4s لا تعبر عن p75Ntr، ولم يتم تحديد علامات CN3/CN4 محدده أخرى. كما انها أصغر من SMNs ، التالي ، أكثر صعوبة لعزل استنادا إلى حجم. وبدلا من ذلك ، اعتمدت الدراسات المختبرية لCN3s أو الCN4s علي الفصل17، و18، و19، و20، و21، و17، و22،و 23، و24، و25، و26، والشريحة27،و28 ثقافة ، والتي تتكون من أنواع خلايا غير متجانسة ، ولم توجد بروتوكولات العزلة والثقافة الاوليه CN3s أو CN4s.
هنا ، يوصف بروتوكول لتصور ، والعزلة ، وتنقيه ، وزراعه CN3s ، CN4s ، وsmns من نفس اليوم الجنيني 11.5 (E 11.5) IslMN: gfp الفئران المحورةوراثيا29 (الشكل 1، الشكل 2ا). IslMN: gfp تسمي علي وجه التحديد الخلايا العصبية الحركية مع gfp farnesylated التي تقوم بالتمركز إلى غشاء الخلية. هذا البروتوكول يمكن مقارنه الأنواع والعمر مطابقه لأنواع متعددة من الخلايا العصبية الحركية من أجل توضيح أليات المرضية في مرض الخلايا العصبية الحركية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تاريخيا, في المختبر الدراسات من الخلايا العصبية CN3 و/أو CN4 الحركية قد اعتمدت علي ثقافات غير متجانسة مثل الفصل17,18,19,20,21, شرح17,22,23,24<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بريجيت Pettmann (Biogen ، كامبريدج ، MA ، الولايات الامريكيه) للتعليم في تقنيات تشريح SMN ؛ A.A. Nugent, A.P. Tenney, ع لي, E.H. نغوين, م فاروقي روز, أعضاء مختبر Engle اضافيه, والمشروع ALS أعضاء الاتحاد للمساعدة التقنية ومناقشه مدروس. تم دعم هذه الدراسة من قبل المشروع ALS. الاضافه إلى ذلك ، تم تمويل R.F. من قبل مؤسسه القلب اليابان/باير ياكوهين منحه البحوث في الخارج ومنحه التدريب المعاهد القومية للصحة في علم الوراثة T32 GM007748 ؛ تم دعم جي جاي من قبل برنامج التدريب المعاهد القومية للصحة/NEI في القواعد الجزيئية للامراض العين (5T32EY007145-16) من خلال Schepens معهد بحوث العين والتنمية العصبية برنامج التدريب دكتوراه زمالة (5T32EY007145-19) من خلال مستشفي الأطفال بوسطن; وكانت الشركة مدعومة من قبل NEI (5K08EY027850) ومؤسسه طب العيون في مستشفي الأطفال (جائزه كليه ديسكفري) ؛ و E.C.E. هو باحث في معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G., Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
