Summary

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici

Published: November 12, 2019
doi:

Summary

Questo lavoro presenta un protocollo per produrre colture cellulari omogenee dei motoneuroni primari oculomotori, trocleari e spinali. Queste colture possono essere utilizzate per analisi comparative delle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni oculari e spinali.

Abstract

I neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) mostrano una notevole resistenza alle malattie dei motoneuroni degenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) rispetto ai motoneuroni spinali (SMN). La capacità di isolare e coltura mouse primario CN3s, CN4s, e SMN fornirebbe un approccio allo studio dei meccanismi alla base di questa vulnerabilità selettiva. Ad oggi, la maggior parte dei protocolli utilizza colture cellulari eterogenee, che possono confondere l’interpretazione dei risultati sperimentali. Per ridurre al minimo i problemi associati alle popolazioni di cellule miste, le colture pure sono indispensabili. Qui, il primo protocollo descrive in dettaglio come purificare e coltivare in modo efficiente i CN3/CN4 insieme alle controparti SMN dagli stessi embrionali usando embrioni del giorno 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embrionali di topo transgenici. Il protocollo fornisce dettagli sulla dissezione e dissociazione dei tessuti, l’isolamento cellulare basato su FACS e la coltivazione in vitro di cellule dai nuclei CN3/CN4 e SMN. Questo protocollo aggiunge un nuovo sistema di coltura in vitro CN3/CN4 ai protocolli esistenti e fornisce contemporaneamente una cultura SMN pura e abbinata all’età per il confronto. Le analisi incentrate sulle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni sono realizzabili in questo sistema di coltura. Questo protocollo consentirà la ricerca sui meccanismi che definiscono lo sviluppo del motoneurone, la vulnerabilità selettiva e la malattia.

Introduction

La coltura dei motoneuroni primari è un potente strumento che consente lo studio dello sviluppo neuronale, funzione, e suscettibilità a fattori di stress esogeni. Le colture di motoneuroni sono particolarmente utili per lo studio di malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)1,2, i cui meccanismi di malattia sono incompleti. È interessante notare che, nonostante la significativa morte cellulare dei motoneuroni spinali (SMN) sia nei pazienti affetti da SLA che nei topi modello di SLA, la morte cellulare nei neuroni oculomotori (CN3) e i neuroni trocleari (CN4) sono relativamente scarsi1,3,4,5,6,7,8,9. Pertanto, analisi comparative delle colture pure di CN3/CN4 e SM potrebbero fornire importanti indizi sui meccanismi alla base della vulnerabilità relativa. Sfortunatamente, un ostacolo importante a tali analisi è stata l’incapacità di coltivare colture purificate di questi motoneuroni.

Molti protocolli sono stati descritti per la purificazione delle sinistenzioni da modelli animali. La maggior parte di questi protocolli utilizza tecniche di panning di smistamento delle cellule basate su media di densità10,11,12 e/o p75NTR-anticorpi -anticorpi- base alle tecniche di panning13,14,15,16. La centrifugazione del gradiente di densità sfrutta le dimensioni maggiori delle snn rispetto ad altre cellule spinali, mentre p75NTR è una proteina extracellulare espressa esclusivamente dalle sren nel midollo spinale. Quasi 100% culture SMN pure sono state generate da uno o entrambi questi protocolli11,12,14. Tuttavia, questi protocolli non sono riusciti a generare impostazioni cultura CN3/CN4 perché i CN3/CN4 non esprimono p75NTRe non sono stati identificati altri marcatori CN3/CN4 specifici. Sono anche più piccole delle smin e, pertanto, più difficili da isolare in base alle dimensioni. Invece, studi in vitro di CN3 o CN4 si sono affidati a dissociati17,18 ,19,20,21, espianto17,22,23,24,25,26, e fetta27,28 culture, che sono composti da tipi di cellule eterogenee, e nessun protocollo sono esistiti per il isolamento e cultura dei CN3 primari o CN4.

In questo caso, viene descritto un protocollo per la visualizzazione, l’isolamento, la purificazione e la coltivazione di CN3, CN4 e SMN dello stesso giorno embrionale 11.5 (E11.5) IslMN:GFP topi transgenici29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etichetta specificamente i motoneuroni con un GFP farnesillato che si localizza nella membrana cellulare. Questo protocollo consente il confronto di diversi tipi di motoneuroni per chiarire i meccanismi patologici nella malattia dei motoneuroni.

Protocol

Tutti gli esperimenti che utilizzano animali da laboratorio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida NIH per la cura e l’uso di animali da laboratorio e con l’approvazione dell’Animal Care and Use Committee dell’Ospedale pediatrico di Boston. 1. Impostazione degli accoppiamenti a tempo prima della dissezione Per generare topi embrionali prenatali per il raccolto del motoneurone, pesare ogni topo femmina e impostare l’accoppiamento a tempo tra topi transgenici adulti …

Representative Results

L’obiettivo di questo protocollo era quello di purificare e coltura sia i CN3/CN4 primari a lungo termine che le SMN a lungo termine per consentire analisi comparative dei meccanismi alla base dei disturbi del motoneurone (vedere Figura 1 e Figura 2 per una panoramica). Una volta che i neuroni sono stati isolati con successo e cresciuti in coltura, quasi puro primario C…

Discussion

Storicamente, gli studi in vitro dei motoneuroni CN3 e/o CN4 si sono affidati a culture eterogenee come dissociate17,18,19,20,21, espiantare17,22,23,24,25,26e tagl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) per l’istruzione nelle tecniche di dissezione SMN; il Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, il Centro di Citometry di flusso della divisione immunologia della Harvard Medical School, il Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women’s Hospital Flow Cytometry Core e il Boston Children’s Hospital Flow Cytometry Research Facility per l’isolamento FACS dei motovini primari; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, membri del laboratorio Engle aggiuntivi e membri del consorzio Project ALS per assistenza tecnica e discussione ponderata. Questo studio è stato sostenuto dal Progetto SLA. Inoltre, R.F. è stato finanziato dalla Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad e dalla NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. è stato supportato dal programma di formazione NIH/NEI nelle basi molecolari delle malattie oculari (5T32EY007145-16) attraverso lo Schepens Eye Research Institute e lo Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) attraverso il Boston Children’s Hospital; M.C.W è stato supportato da NEI (5K08EY027850) e Children’s Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); e E.C.E. è un investigatore dell’Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001 1:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11072 1:400
B27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer BD Bioscience This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers.
BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers CORNING 352350 For filtering the dissociating cells before FACS.
BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap CORNING 352054
BDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-207
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) Greiner Bio-One International 655090 We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC
Circular Cover Glasses for microscopy Karl Hecht & Assistent 1001/14 We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm).
CNTF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-272
Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium Sigma-Aldrich C1530 CPA. One of ER stressors.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips Roboz Surgical Instrument RS-5015
Forskolin Thermo Fisher Scientific BP25205
GDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-305
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050-061
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Hibernate E BrainBits HE
Hibernate E low fluorescence BrainBits HELF Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low.
Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin Thermo Fisher Scientific 26050-070
IBMX Tocris Cookson 2845 Isobutylmethylxanthine
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
Leibovitz’s L15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade Roboz Surgical Instrument RS-6272
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) BioLegend 801202 1:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software Nikon Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) Fisher Scientific A202-212 For rinsing coverslips
Olympus 1.7ml Microtubes, Clear Genesee Scientific 22-281 These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corp LK003150 Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit.
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Poly D-lysin (PDL) MilliporeSigma A-003-E
rabbit monoclonal antibody to Islet1 Abcam ab109517 1:200
SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera Nikon Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit Dow Corning 1696157 We make dissection dishes using this kit.
TC treated Dishes, 100 x 20 mm Genesee Scientific 25-202 We make dissection dishes using this dish.
Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-8100
Transducer for LOGOQ e VET GE Healthcare L8-18i-RS For ultrasound on female mice
Veterinary ultrasound machine GE Healthcare LOGOQ e VET For ultrasound on female mice
Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software Carl Zeiss Confocal image of the embryo was captured with these equipments

References

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
  3. Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
  5. Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
  6. Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
  7. Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
  8. Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
  9. Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
  10. Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
  11. Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
  12. Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
  13. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  14. Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  17. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
  18. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
  19. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
  20. Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
  21. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
  22. Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
  23. Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  24. Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
  25. Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
  26. Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
  27. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
  28. Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , e59911 (2019).
  29. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
  30. Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
  31. An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
  32. Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
  33. Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
  34. Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
  35. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
  36. Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  37. Hanson, M. G., Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
  38. Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
  39. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).

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Fujiki, R., Lee, J. Y., Jurgens, J. A., Whitman, M. C., Engle, E. C. Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (153), e60440, doi:10.3791/60440 (2019).

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