这项工作提出了一种方案,用于产生原发性耳运动、耳蜗和脊柱运动神经元的同质细胞培养。这些培养物可用于对眼和脊柱运动神经元的形态、细胞、分子和电生理特征进行比较分析。
与脊柱运动神经元(SMNs)相比,Oculo运动神经元(CN3s)和血栓神经元(CN4)对退行性运动神经元疾病(如肌萎缩性侧索硬化症(ALS))表现出显著的抵抗力。分离和培养原小鼠CN3、CN4和SM的能力将提供一个研究这种选择性脆弱性背后的机制的方法。迄今为止,大多数协议使用异构细胞培养,这可能混淆实验结果的解释。为了尽量减少与混合细胞种群相关的问题,纯培养物是必不可少的。在这里,第一个协议详细介绍了如何有效地纯化和培养CN3s/CN4s与来自同一胚胎的SMN对应物使用胚胎日11.5(E11.5)Isl MN:GFP转基因小鼠胚胎。该协议提供了关于组织解剖和分离、基于FACS的细胞分离以及CN3/CN4和SMN核细胞体外培养的详细信息。该协议在现有协议中增加了一种新颖的体外CN3/CN4培养系统,同时提供纯物种和年龄匹配的SMN培养物进行比较。以运动神经元的形态、细胞、分子和电生理特性为重点的分析是本培养系统中可行的。该协议将支持研究定义运动神经元发育、选择性脆弱性和疾病的机制。
原发性运动神经元的培养是一个强大的工具,它有助于研究神经元发育、功能和对外源应激源的易感性。运动神经元培养对神经退行性疾病的研究特别有用,如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)1,2,其疾病机制尚未完全了解。有趣的是,尽管ALS患者和ALS模型小鼠的脊髓运动神经元(SMNs)的细胞死亡显著,但神经运动神经元(CN3s)和脑神经(CN4s)中的细胞死亡相对稀少,1、3、4、5、6、7、8、9。因此,对CN3s/CN4s和SMN的纯文化进行比较分析,可以为相对脆弱性背后的机制提供重要的线索。不幸的是,这种分析的一个主要障碍是无法生长这些运动神经元的纯化培养物。
许多协议已经描述从动物模型净化SBN。这些协议大多使用密度梯度离心10,11,12和/或p75NTR-抗体基细胞分选平移技术13,14,15,16。密度梯度离心利用相对于其他脊髓细胞更大的SMN,而p75NTR是脊髓中SMN专门表达的细胞外蛋白。近100%纯SMN文化是由这些协议11、12、14的一个或两个产生的。然而,这些协议在生成CN3/CN4培养物方面尚未成功,因为CN3s/CN4s没有表达p75NTR,其他特定的CN3/CN4标记尚未识别。它们也比 SMN 小,因此,根据大小更难隔离。相反,CN3s或CN4的体外研究依赖于分离的17,18,19,20,21,除植物17,22,23,24,25,26和切片27,28培养基,这些培养体由异质细胞类型组成,并且不存在任何协议。原发性CN3或CN4的隔离和培养。
在这里,描述了一个协议,用于从同一胚胎日11.5 (E11.5) IslMN:GFP转基因小鼠29(图1,图2A)对CN3、CN4s和SM的可视化、隔离、纯化和培养。IslMN:GFP特别标记运动神经元与远鼻化 GFP,本地化到细胞膜。该协议使多种运动神经元的物种和年龄匹配比较,以阐明运动神经元疾病的病理机制。
从历史上看,CN3和/或CN4运动神经元的体外研究依赖于异质培养物,如分离17、18、19、20、21、外植17、22、23、24、25、26和<sup …
The authors have nothing to disclose.
我们感谢布里吉特·佩特曼(生物根,剑桥,马萨诸塞州,美国)在SMN解剖技术的指导;达纳法伯癌症研究所流式细胞测定设施、哈佛医学院免疫学部门流式细胞测定设施、乔斯林糖尿病中心流式细胞测定中心、布里格姆和妇女医院流动细胞学核心,以及波士顿儿童医院流式细胞测定研究设施,用于FACS对原发性运动神经元进行FACS分离;A.A. Nugent、A.P.Tenney、A.S.Lee、E.H.Nguyen、M.F.Rose、其他恩格尔实验室成员和项目ALS联盟成员提供技术援助和深思熟虑的讨论。这项研究得到了ALS项目的支持。此外,R.F.还由日本心脏基金会/拜耳雅库因海外研究赠款和NIH遗传学T32 GM007748培训赠款资助;J.J.通过舍彭斯眼科研究所和开发神经学训练计划博士后奖学金(5T32NS0007473-19)通过波士顿儿童医院,获得美国国家卫生研究院/NEI眼病分子库(5T32EY00714-16)培训项目的支持;M.C.W得到了NEI(5K08EY027850)和儿童医院眼科基金会(教师发现奖)的支持;和E.C.E.是霍华德·休斯医学研究所的调查员
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
Hibernate E | BrainBits | HE | |
Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |