Summary

Aislamiento y cultivo de las neuronas motoras oculomotoras, trocleas y espinales de Islmnprenatal :GFP Ratones transgénicos

Published: November 12, 2019
doi:

Summary

Este trabajo presenta un protocolo para producir cultivos celulares homogéneos de neuronas motoras primarias oculomotoras, trocleas y espinales. Estos cultivos se pueden utilizar para análisis comparativos de las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras oculares y espinales.

Abstract

Las neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4) exhiben una notable resistencia a enfermedades degenerativas de las neuronas motoras como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en comparación con las neuronas motoras espinales (SMN). La capacidad de aislar y cultivar CN3 de ratón primario, CN4 y SMN proporcionaría un enfoque para estudiar los mecanismos subyacentes a esta vulnerabilidad selectiva. Hasta la fecha, la mayoría de los protocolos utilizan cultivos celulares heterogéneos, que pueden confundir la interpretación de los resultados experimentales. Para minimizar los problemas asociados con las poblaciones de células mixtas, los cultivos puros son indispensables. Aquí, el primer protocolo describe en detalle cómo purificar y cultivar eficientemente CN3s/CN4s junto con contrapartes SMN de los mismos embriones utilizando embrionarios día 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgénicos embriones de ratón. El protocolo proporciona detalles sobre la disección y disociación tisular, el aislamiento celular basado en FACS y el cultivo in vitro de células de núcleos CN3/CN4 y SMN. Este protocolo añade un novedoso sistema de cultivo CN3/CN4 in vitro a los protocolos existentes y proporciona simultáneamente un cultivo SMN puro para la comparación de especies y edades. Los análisis centrados en las características morfológicas, celulares, moleculares y electrofisiológicas de las neuronas motoras son factibles en este sistema de cultivo. Este protocolo permitirá investigar los mecanismos que definen el desarrollo de neuronas motoras, la vulnerabilidad selectiva y las enfermedades.

Introduction

El cultivo de las neuronas motoras primarias es una poderosa herramienta que permite el estudio del desarrollo neuronal, función, y la susceptibilidad a los estresores exógenos. Los cultivos de neuronas motoras son particularmente útiles para el estudio de enfermedades neurodegenerativas como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)1,2, cuyos mecanismos de enfermedad se entienden incompletamente. Curiosamente, a pesar de la muerte celular significativa de las neuronas motoras espinales (SMN) tanto en pacientes con ELA como en ratones modelo DE ELA, la muerte celular en neuronas oculomotoras (CN3) y las neuronas trocleares (CN4s) son relativamente escasas1,3,4,5,6,7,8,9. Por lo tanto, los análisis comparativos de cultivos puros de CN3s/CN4s y SMN podrían proporcionar pistas importantes sobre los mecanismos subyacentes a la vulnerabilidad relativa. Desafortunadamente, una barrera importante a tales análisis ha sido la incapacidad para cultivar cultivos purificados de estas neuronas motoras.

Se han descrito muchos protocolos para la purificación de las SMN a partir de modelos animales. La mayoría de estos protocolos utilizan centrifugación de gradiente de densidad10,11,12 y/o p75NTR-técnicas de panoramización de clasificación celular basadas en anticuerpos13,14,15,16. La centrifugación de gradiente de densidad explota el mayor tamaño de las SMN en relación con otras células espinales, mientras que p75NTR es una proteína extracelular expresada exclusivamente por las SMN en la médula espinal. Casi 100% cultivos SMN puros han sido generados por uno o ambos de estos protocolos11,12,14. Sin embargo, estos protocolos no han tenido éxito en generar las culturas CN3/CN4 porque los CN3s/CN4 no expresan elNTRp75, y otros marcadores específicos CN3/CN4 no han sido identificados. También son más pequeños que los SMN y, por lo tanto, son más difíciles de aislar en función del tamaño. En cambio, los estudios in vitro de CN3s o CN4 se han basado endesvincular17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26, y la rebanada27,28 cultivos, que se componen de tipos de células heterogéneas, y no han existido protocolos para el aislamiento y cultura de los CN3 primarios o CN4.

Aquí, se describe un protocolo para la visualización, aislamiento, purificación y cultivo de CN3, CN4 y SMN del mismo día embrionario 11.5 (E11.5) IslMN:GFP ratones transgénicos29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP etiqueta específicamente las neuronas motoras con un GFP farnesylated que se localiza en la membrana celular. Este protocolo permite la comparación de múltiples tipos de neuronas motoras con el fin de dilucidar los mecanismos patológicos en la enfermedad de las neuronas motoras.

Protocol

Todos los experimentos que utilizaron animales de laboratorio se realizaron de acuerdo con las directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil de Boston. 1. Configuración de apareamientos cronometrados antes de la disección Para generar ratones embrionarios prenatales para la cosecha de neuronas motoras, sopesar cada ratón hembra y establecer un apareamiento cronometrado ent…

Representative Results

El objetivo de este protocolo era purificar y cultivar altamente tanto los CN3/CN4 primarios como los SMN a largo plazo para permitir análisis comparativos de los mecanismos subyacentes a los trastornos de las neuronas motoras (ver Figura 1 y Figura 2 para una visión general). Una vez que las neuronas se aislaron y cultivaron con éxito, se obtuvieron cultivos primari…

Discussion

Históricamente, los estudios in vitro de neuronas motoras CN3 y/o CN4 han recurrido a cultivos heterogéneos como disociados17,18,19,20,21, explantar17,22,23,24,25,26</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, EE. UU.) la instrucción en técnicas de disección SMN; el Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, el Immunology Division Flow Cytometry Facility of Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women’s Hospital Flow Cytometry Core, y Boston Children’s Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neuron; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, miembros adicionales del laboratorio engle y miembros del consorcio Project ALS para asistencia técnica y discusión reflexiva. Este estudio fue apoyado por el Proyecto ELA. Además, R.F. fue financiado por la Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad y NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748; J.J. contó con el apoyo del programa de capacitación NIH/NEI en las Bases Moleculares de Enfermedades Oculares (5T32EY007145-16) a través del Instituto de Investigación Ocular schepens y el Programa de Capacitación en Neurología del Desarrollo (5T32NS007473-19) a través del Hospital Infantil de Boston; M.C.W contó con el apoyo de NEI (5K08EY027850) y Children’s Hospital Ofthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); y E.C.E. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001 1:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11072 1:400
B27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer BD Bioscience This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers.
BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers CORNING 352350 For filtering the dissociating cells before FACS.
BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap CORNING 352054
BDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-207
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) Greiner Bio-One International 655090 We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC
Circular Cover Glasses for microscopy Karl Hecht & Assistent 1001/14 We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm).
CNTF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-272
Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium Sigma-Aldrich C1530 CPA. One of ER stressors.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips Roboz Surgical Instrument RS-5015
Forskolin Thermo Fisher Scientific BP25205
GDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-305
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050-061
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Hibernate E BrainBits HE
Hibernate E low fluorescence BrainBits HELF Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low.
Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin Thermo Fisher Scientific 26050-070
IBMX Tocris Cookson 2845 Isobutylmethylxanthine
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
Leibovitz’s L15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade Roboz Surgical Instrument RS-6272
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) BioLegend 801202 1:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software Nikon Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) Fisher Scientific A202-212 For rinsing coverslips
Olympus 1.7ml Microtubes, Clear Genesee Scientific 22-281 These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corp LK003150 Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit.
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Poly D-lysin (PDL) MilliporeSigma A-003-E
rabbit monoclonal antibody to Islet1 Abcam ab109517 1:200
SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera Nikon Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit Dow Corning 1696157 We make dissection dishes using this kit.
TC treated Dishes, 100 x 20 mm Genesee Scientific 25-202 We make dissection dishes using this dish.
Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-8100
Transducer for LOGOQ e VET GE Healthcare L8-18i-RS For ultrasound on female mice
Veterinary ultrasound machine GE Healthcare LOGOQ e VET For ultrasound on female mice
Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software Carl Zeiss Confocal image of the embryo was captured with these equipments

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Fujiki, R., Lee, J. Y., Jurgens, J. A., Whitman, M. C., Engle, E. C. Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (153), e60440, doi:10.3791/60440 (2019).

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