Isolering och kultur av Oculomotor, trochlear, och spinal motoriska nervceller från prenatal ISLmn: GFP transgena möss
Summary
Detta arbete presenterar ett protokoll för att ge homogena cellkulturer av primära oculomotor, trochlear, och spinal motoriska nervceller. Dessa kulturer kan användas för jämförande analyser av morfologiska, cellulära, molekylära och elektrofysiologiska egenskaper hos ögon-och spinal motoriska nervceller.
Abstract
Oculomotor nervceller (CN3s) och trochlear neuroner (CN4s) uppvisar anmärkningsvärt motstånd mot degenerativa motoriska neuron sjukdomar såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS) jämfört med spinal motoriska neuroner (SMNs). Förmågan att isolera och odla primär mus CN3s, CN4s och SMNs skulle ge en metod för att studera mekanismerna bakom denna selektiva sårbarhet. Hittills har de flesta protokoll använder heterogena cellkulturer, som kan blanda ihop tolkningen av experimentella resultat. För att minimera problemen i samband med blandad cellpopulationer, är rena kulturer oumbärliga. Här, det första protokollet beskriver i detalj hur man effektivt rena och odla CN3s/CN4s tillsammans med SMNs motsvarigheter från samma embryon med hjälp av embryonala dag 11,5 (E 11.5) ISLmn: GFP transgena mus embryon. Protokollet innehåller information om vävnad dissektion och dissociation, FACS-baserad cell isolering, och in vitro-odling av celler från filen CN3/CN4 och SMN kärnor. Detta protokoll lägger till en roman in vitro filen CN3/CN4 kultur system till befintliga protokoll och samtidigt ger en ren art-och åldersmatchade SMN kultur för jämförelse. Analyser med fokus på morfologiska, cellulära, molekylära och elektrofysiologiska egenskaper hos motoriska neuroner är genomförbara i detta kultur system. Detta protokoll kommer att möjliggöra forskning om de mekanismer som definierar utvecklingen av motoriska neuron, selektiv sårbarhet och sjukdom.
Introduction
Kulturen i primära motoriska nervceller är ett kraftfullt verktyg som möjliggör studiet av neuronala utveckling, funktion, och känslighet för exogena stressorer. Motoriska neuron kulturer är särskilt användbara för studiet av neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS)1,2, varssjukdomsmekanismer är ofullständigt förstås. Intressant, trots den signifikanta celldöd av spinal motoriska neuroner (smns) i båda ALS patienter och ALS modell möss, celldöd i ögonmuskelförlamningar nervceller (CN3s) och trochlear neuroner (CN4s) är relativt knappa1,3,4,5,6,7,8,9. Därför kan jämförande analyser av rena kulturer av CN3s/CN4s och SMNs ge viktiga ledtrådar om mekanismerna bakom relativ sårbarhet. Tyvärr har ett stort hinder för sådana analyser varit oförmågan att odla renade kulturer av dessa motoriska nervceller.
Många protokoll har beskrivits för rening av SMNs från djurmodeller. De flesta av dessa protokoll använder densitet gradient centrifugering10,11,12 och/ellerp75 NTR-antikroppsbaserad cell-sortering panorering tekniker13,14,15,16. Densitetsgradientcentrifugering utnyttjar den större storleken av SMNs i förhållande till andra ryggrads celler, medan p75NTR är ett extracellulärt protein som uttrycks exklusivt av smns i ryggmärgen. Nästan 100% rena SMN kulturer har genererats av en eller båda av dessa protokoll11,12,14. Men dessa protokoll har inte lyckats generera filen CN3/CN4 kulturer eftersom CN3s/CN4s inte uttrycka p75NTRoch andra specifika filen CN3/CN4 markörer inte har identifierats. De är också mindre än SMNs och därför svårare att isolera baserat på storlek. I stället, in vitro-studier av CN3s eller CN4s har förlitat sig på dissocierade17,18,19,20,21, explantat17,22,23,24,25,26, och slice27,28 kulturer, som består av heterogena celltyper, och inga protokoll har funnits för isolering och kultur av primär CN3s eller CN4s.
Här beskrivs ett protokoll för visualisering, isolering, rening och odling av CN3s, CN4s och SMNs från samma embryonala dag 11,5 (E 11.5) ISLmn: GFP transgena möss29 (figur 1, figur 2a). ISLmn: GFP specifikt etiketter motoriska neuroner med en FARNESYLATED GFP som lokaliserar till cellmembranet. Detta protokoll möjliggör art-och åldersmatchad jämförelse av flera typer av motoriska nervceller för att belysa patologiska mekanismer i motorisk neuron sjukdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historiskt, in vitro-studier av filen CN3 och/eller CN4 motoriska nervceller har förlitat sig på heterogena kulturer som dissocierade17,18,19,20,21, explantat17,22,23,24,25,<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) för undervisning i SMN dissektion tekniker; Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, immunologi Division Flow Cytometry anläggning i Harvard Medical School, Joslin diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham och Women ‘ s Hospital Flow Cytometry kärna, och Boston Children ‘ s Hospital Flow Cytometry forskningsanläggning för FACS isolering av primära motoriska nervceller; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, ytterligare Engle laboratorie medlemmar, och projekt ALS Consortium medlemmar för tekniskt bistånd och tankeväckande diskussion. Denna studie stöddes av Project ALS. Dessutom finansierades R.F. av Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhins forskningsstipendium utomlands och NIH Training Grant i Genetics T32 GM007748; J.J. stöddes av NIH/NEI Training program i de molekylära grunderna för ögonsjukdomar (5T32EY007145-16) genom Schepens Eye Research Institute och av Utvecklingsneurologin Training program postdoktor Fellowship (5T32NS007473-19) genom Boston Children ‘ s Hospital; M. C. W stöddes av NEI (5K08EY027850) och Children ‘ s Hospital oftalmologi Foundation (Faculty Discovery Award); och E.C.E. är en Howard Hughes Medical Institute utredare.
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G., Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
