Summary
Dette arbejde præsenterer en protokol til at give homogene cellekulturer af primære oculomotor, trochlear, og spinal motoriske neuroner. Disse kulturer kan anvendes til komparative analyser af de morfologiske, cellulære, molekylære og elektrofysiologiske egenskaber af okulære og spinal motoriske neuroner.
Abstract
Oculomotor neuroner (CN3s) og trochlear neuroner (CN4s) udviser bemærkelsesværdig resistens over for degenerative motoriske neuron sygdomme som Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) sammenlignet med spinal motoriske neuroner (SMNs). Evnen til at isolere og kultur primære mus CN3s, CN4s og SMNs ville give en tilgang til at studere mekanismer underliggende denne selektive sårbarhed. Til dato, de fleste protokoller bruger heterogene cellekulturer, som kan tolerere fortolkningen af eksperimentelle resultater. For at minimere problemerne i forbindelse med blandet cellepopulationer er rene kulturer uundværlige. Her beskriver den første protokol i detaljer, hvordan man effektivt renser og dyrker CN3s/CN4s sammen med SMNs-modparter fra de samme embryoner ved hjælp af embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: gfp -transgene muse embryoner. Protokollen indeholder oplysninger om vævs dissektion og dissociation, FACS-baserede celle isolering og in vitro dyrkning af celler fra CN3/CN4 og SMN kerner. Denne protokol tilføjer en roman in vitro CN3/CN4 kultur system til eksisterende protokoller og samtidig giver en ren art-og alders matchede SMN kultur til sammenligning. Analyser, der fokuserer på motoriske neuras morfologiske, cellulære, molekylære og elektrofysiologiske egenskaber, er gennemførlige i dette kultur system. Denne protokol vil gøre det muligt at forske i de mekanismer, der definerer motorisk neuron udvikling, selektiv sårbarhed, og sygdom.
Introduction
Kulturen i primære motoriske neuroner er et kraftfuldt værktøj, der gør det muligt at studere neuronal udvikling, funktion og modtagelighed over for eksogene stressorer. Motoriske neuron kulturer er særligt nyttige for studiet af neurodegenerative sygdomme som Amyotrofisk lateral sklerose (ALS)1,2, hvissygdomsmekanismer er ufuldstændigt forstået. Interessant, på trods af den betydelige celledød af spinal motoriske neuroner (smns) i både Als patienter og Als model mus, celledød i oculomotoriske neuroner (CN3s) og trochlear neuroner (CN4s) er relativt knappe1,3,4,5,6,7,8,9. Derfor kan komparative analyser af rene kulturer af CN3s/CN4s og SMNs give vigtige fingerpeg om mekanismer, som underliggende relativ sårbarhed. Desværre, en stor barriere for sådanne analyser har været den manglende evne til at dyrke renset kulturer af disse motoriske neuroner.
Mange protokoller er blevet beskrevet for rensning af SMNs fra dyremodeller. De fleste af disse protokoller bruger tæthed gradient centrifugering10,11,12 og/eller p75NTR-antistof-baserede celle sortering panoreringteknikker 13,14,15,16. Tæthed gradient centrifugering udnytter den større størrelse af SMNs i forhold til andre rygmarvs celler, mens p75NTR er et ekstracellulært protein, der udelukkende udtrykkes af smns i rygmarven. Næsten 100% ren SMN kulturer er blevet genereret af en eller begge af disse protokoller11,12,14. Disse protokoller har dog ikke haft succes med at generere CN3/CN4-kulturer, fordi CN3s/CN4s ikke udtrykker p75NTR, og andre specifikke CN3/CN4 markører ikke er blevet identificeret. De er også mindre end SMNs og derfor vanskeligere at isolere baseret på størrelse. I stedet har in vitro-studier af CN3s eller CN4s påberåbt sig dissocieret17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26og Slice27,28 kulturer, som er sammensat af heterogene celletyper, og ingen protokoller har eksisteret for isolation og kultur af primær CN3s eller CN4s.
Her beskrives en protokol til visualisering, isolering, rensning og dyrkning af CN3s, CN4s og SMNs fra samme embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: gfp Transgene mus29 (figur 1, figur 2a). ISLMN: gfp mærker specifikt motor neuroner med en farnesyleret gfp, der lokaliserer til cellemembranen. Denne protokol muliggør Arts-og alders matchede sammenligning af flere typer af motoriske neuroner for at belyse patologiske mekanismer i motorisk neuron sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter, der udnytter forsøgsdyr blev udført i overensstemmelse med NIH retningslinjer for pleje og brug af forsøgsdyr og med godkendelse af Animal Care og brug Udvalget af Boston children's Hospital.
1. opsætning af tidsindstillede parringer før dissektion
- At generere prænatal embryonale mus til motor neuron høst, afveje hver kvindelig mus og oprette timet parring mellem voksen ISLMN: gfp Transgene mus 11,5 dage før dagen for neuron isolation. Med henblik på at udvikle denne protokol, 129S1/C57BL/6J ISLMN: gfp mus, i alderen 2 − 9 måneder, blev brugt og timet parring blev sat op om aftenen.
- Undersøg hunmus for vaginal propper den følgende morgen. Overvej den dato, hvor stikket identificeres som embryon dag (E) 0,5.
- Vejer hunmus og undersøger for pup ved hjælp af ultralyd (Se tabel over materialer) mellem e 8.5 − 11. Tjek for tegn på vellykket parring.
- Bekræft den vellykkede parring ved at detektere vægtøgning i hunmus (normalt > 1.5 g på E 9.5, hvis der er mere end 5 − 6 embryoner).
- Visuelt bekræfte embryoner under ultralyd. Embryoner er let detekterbare ved ultralyd efter E 9.5. Ultrasounds udføres kun på kvinder, der har vundet vægt, fordi de er oftere gravide end dem, der ikke.
Bemærk: Hunmus kan få vægt af andre årsager end graviditet, så vægtøgning alene er ikke en pålidelig indikator for graviditet. Ultralyds bekræftelse forhindrer unødvendig ofring af kvinder, der ikke er gravide, men er ikke afgørende, hvis utilgængelige.
2. dissektions betingelser og forberedelse af instrumenter
- Udfør al belægning (undtagen syre-rensning af dæksedler), medie forberedelse, vævs dissociation (undtagen centrifugering og inkubation), og kultur arbejde i en laminar flow hætte for at sikre steriliteten af medierne og embryonale motoriske neuroner.
- Med omhyggelig opmærksomhed på steril teknik, udføre væv dissektion uden for en laminar flow hætte med minimal risiko for kontaminering.
- Steriliser en dissektions plade, et par microdissecting saks, et par tommelfinger dressing pincet, to par Dumont #5 pincet, en microdissecting kniv og en Moria mini perforeret ske ved at fordybe i 70% ethanol før brug.
3. PDL/Laminin belægning af fade/Dæksedler
Bemærk: Kultur dissocierede primære motoriske neuroner i 96 brønd eller 24 brønd plader, afhængigt af antallet af celler, der kræves til ansøgningen. Celler kan afbildes direkte i vævskultur pladen uden brug af dæksedler, hvis brøndene er optisk gennemsigtige, og tykkelserne er kompatible med billeddannelse.
- For applikationer, der kræver dæksedler, skal du tilberede syre rengjorte, steriliserede og luft tørrede dæksedler mindst 2 dage før neuron isolationen som tidligere beskrevet30. Partier af dæksedler kan tilberedes på denne måde i god tid inden eksperimenter og kan opbevares i op til 6 måneder uden påvirkning af eksperimentel kvalitet.
- Forbered en arbejdsopløsning på 20 μg/mL poly D-lysin (PDL) i fosfat bufferet saltvand (PBS) 2 dage før neuron isolation.
- Aliquot PDL (1 mg/mL) på forhånd og opbevares ved-20 °C som stamopløsning.
- Dæk overfladen af hver dækseddel eller brønden af vævskultur pladen med tilstrækkelig PDL-opløsning (f. eks. 100 μL pr. brønd på 96 brønd plader eller 500 μL pr. brønd på 24 brøndplader med eller uden dæksedler). Inkuber natten over ved 37 °C.
- Den følgende dag vaskes 3x med steriliseret vand.
- Forsegl pladerne med paraffin folie og opbevar de vaskede PDL-belagte plader ved 4 °C i op til 1 måned, hvis de tørres helt efter den sidste vask.
- Der forberedes en arbejdsopløsning med 10 μL Laminin (1,1 − 1,2 mg/mL) i 1,2 mL PBS.
- (1,1 − 1,2 mg/mL) på forhånd og opbevares ved-80 °C.
- Dæk overfladen af hver dækseddel eller godt med nok Laminin opløsning til jævnt at belægge overfladen. Inkuber i mindst 2 timer ved 37 °C før brug.
Bemærk: PDL/Laminin-belagte plader og dæksedler kan opbevares i op til 1 uge ved 37 °C, men frisk belagt Laminin foretrækkes. Fjern Laminin direkte før plating30. Laminin bør ikke have lov til at tørre ud. Hvis pladerne skal opbevares i mere end flere timer, skal de pakkes i paraffin folie.
4. forberedelse af dissektion, motorisk neuron kultur medier og Dissociations løsninger
Bemærk: Koncentrationerne i parentes indikerer de endelige koncentrationer af hver reagens.
- Forbered dissektions mediet.
- Tø det varme inaktiverede heste serum natten over ved 4 °C, Forbered 1 mL aliquoter, og opbevar ved-20 °C. Tø-aliquoter ved RT direkte før brug.
- Opbevar B27-supplement (50x) i 1 mL aliquoter ved-20 °C. Tø-aliquoter ved RT umiddelbart før brug. Undgå at fryse/tø cyklusser.
- Opbevar glutamin-supplementet (100x) ved 4 °C eller-20 °C. Opdeles i 0,5 mL aliquoter ved opbevaring ved-20 °C.
- Opbevar penicillin-streptomycin (10.000 U/mL) i 1 mL aliquoter ved-20 °C. Tø-aliquoter ved RT umiddelbart før brug.
- For at gøre dissektions mediet blandes 9,4 mL dvale E med 200 μL heste serum (2%), 200 μL 50x B27 supplement (1x), 100 μL 100x Glutamin supplement (1x) (f. eks. GlutaMAX) og 100 μL af 10.000 U/mL penicillin-streptomycin (100 U/mL). Brug dette medium til at indsamle dissekeret væv og gøre den endelige suspension af dissocierede celler.
- Tilsæt 500 μL dissektions medium til individuelle 1,7 mL mikrocentrifuge glas til vævs samlingen dagen før neuron isolationen. Forbered et rør for hver vævstype, der vil blive indsamlet (f. eks. positiv kontrol, negativ kontrol, CN3/CN4, SMN), og opbevar ved 4 °C før brug.
- Kombiner 49 mL dvale E lave fluorescens medier med 1 mL B27 supplement (1x) og fyld en 24 brønd plade med dette medium (2 mL/brønd) dagen før neuron isolation. Brug denne skål til at indsamle muse embryoner. Opbevares ved 4 °C før brug.
- Forbered motoren neuron kulturmedium.
- Forbered 250 μL aliquoter på 25 mM 2-mercaptoethanol i Leibovitz ' L15 medium. Opbevares ved-20 °C.
- Genererer 5 μL aliquoter på 100 μg/mL opløsninger af BDNF, CNTF og GDNF fortyndet i steriliseret vand. Opbevares ved-80 °C og tø-aliquoter ved RT umiddelbart før brug.
- Forbered 10 mM forskolin opløsning ved at tilføje 64 μL dimethylsulfoxid (DMSO) til 5 mg (1,0670 μM) af forskolin og vortex godt at opløse helt. Tilsæt derefter steriliseret vand (1,003 mL) til DMSO-opløsningen og vortex Well. Opbevar 12 μL aliquoter på 10 mM forskolin ved-20 °C og tø-aliquoter ved RT umiddelbart før brug.
- Forbered 12 μL aliquoter på 100 mM isobutylmethylxanthin (IBMX) fortyndet i DMSO. Opbevares ved-20 °C og tø-aliquoter ved RT umiddelbart før brug.
- For at gøre motoren neuron Culture medium, bland 9,4 mL neurobasal medium med 200 μL heste serum (2%), 200 μL af 50x B27 supplement (1x), 100 μL af 100x Glutamin supplement (1x), 100 μL af 10.000 U/m: penicillin-streptomycin (100 U/mL), og 20 μL af 25 mM 2-mercaptoethanol (50 μM), fortrinsvis umiddelbart før brug. Dette trin kan udføres op til 1 dag før neuron isolation.
- Lige før brug tilsættes 1 μL hver af 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) og GDNF (10 ng/mL) og 10 μL af 10 mM forskolin (10 μM) og 10 μL 100 mM IBMX (100 μM) til motorens neuron kulturmedium. Forvarm mediet til 37 °C.
- Klargør dissociations løsningerne.
- Papain-opløsningen (20 U/mL papain og 0,005% DNase) og en albumin-ovomucoidinhibitor opløsning (1 mg/mL ovomucoid-hæmmer, 1mg/mL albumin og 0,005% DNase) fremstilles efter fabrikantens anvisninger.
- Forbered 500 μL aliquoter af hver af ovomucoidehæmmeren og papain-opløsninger og opbevar ved-80 °C. Tø-aliquoter ved 37 °C umiddelbart før brug.
5. ventral hjernen og rygmarv dissektion
Bemærk: Udfør alle de følgende trin bortset fra trin 5.1.1 − 5.1.3 og 5.1.5 − 5.1.6 under en fluorescens dissektion stereomicroskop. Den totale dissektionstid pr. eksperiment er typisk 3 − 5 timer, afhængigt af færdigheden ved dissektion-teknikken og antallet af motoriske neuroner, der kræves for hvert eksperiment.
- Ventral hjernen dissektion
- Euthanize en gravid mus ca. 11,5 dage postbefrugtning af kuldioxid gas og livmoderhals dislokation.
- Spray maven grundigt med ethanol og fjerne livmoderen ved hjælp af sterile microdissecting saks og tommelfinger dressing pincet. Vask livmoderen kortvarigt i steril PBS, og overfør derefter til dissektions pladen fyldt med forkølet sterile PBS.
- Fjern ISLMN: gfp-positive embryoner omhyggeligt fra livmoderen ved hjælp af sterile microdissecting saks, tommelfinger dressing pincet og Dumont #5 pincet i iskold sterile PBS under det klare lys af mikroskopet. Ved hjælp af en steril Moria mini-perforeret ske, overføre hvert embryo til en separat brønd af en 24 brønd plade fyldt med forkølet dvale-E lavt fluorescens medium suppleret med 1x B27. Hold 24 brønd pladen på is.
- Overfør et embryon til en steril dissektions plade og dæk det helt med iskold steril Hank's afbalancerede saltopløsning (HBSS).
- Sørg for, at dissektions trinene udføres under fluorescein isothiocyanat (FITC)-belysning af mikroskopet. Ved hjælp af pincet, fjerne halen og ansigtet af embryonet uden at beskadige midthjernen (figur 2BA). Placer embryonet tilbøjelige med lemmer skrævede nedenunder og hale peger mod forsiden af mikroskopet mod dissektor (angivet med en Asterisk, figur 2BB).
- Ved hjælp af pincet, slids åbne taget af den fjerde ventrikel for at generere en lille åbning. Brug denne åbning til at krog pincet ind i rummet skabt mellem den fjerde ventrikel og dens tag. Dissekere langs den dorsale overflade af embryo rostral Columns til cortex og lateral til gulvpladen og motor søjlen (figur 2ca, b). Åbn den dissekeret væv i en åben bog måde at afsløre GFP-positive CN3 og CN4 kerner.
Bemærk: Et lille stykke væv fra ventrale hjernen indeholdende mesenchyme, CN3, og CN4 vil nu blive eksponeret. - Adskil forsigtigt den ventrale hjernen fra fosteret og fjern meningeal væv ved hjælp af en pincet og en mikrodissecting kniv. Dissekere de bilaterale GFP-positive CN3 og CN4 kerner væk fra gulvpladen og andre GFP-negative omgivende væv ved hjælp af pincet og en microdissecting kniv (figur 2D). Maksimer antallet af GFP-positive motoriske neuroner i det exciserede væv, men undgå at røre eller beskadige dem.
- Hvis en samling af separate CN3 og CN4 kerner ønskes, skæres langs midterlinjen af disse to kerner (gul punkteret linje i figur 2D). Ved hjælp af en P1000-pipette opsamles det dissekterede ventrale mellemhjernevæv med minimal HBSS og placeres i et mærket 1,7 mL mikrocentrifuge glas fyldt med dissektions medium (Se trin 4.1.5). Opbevares på is indtil dissociation.
- Fortsæt med at samle ventrale midhjerner fra yderligere embryoner i samme rør, indtil det samlede antal opfylder forsøgs kravet (Se trin 8 for ideelle cellenumre).
Bemærk: En samlet samling på mindst 10 ventrale midhjerner, der giver ca. 1 x 104 CN3/CN4 motoriske neuroner, anbefales, fordi vævet udsættes for stress under dissociation og sortering.
- Ventral rygmarv dissektion
- Hold embryonet tilbøjelige med hovedet vender forsiden af mikroskopet mod dissector. Hold fosteret med et par pincet og Indsæt spidsen af det andet par pincet i den uåbnede hale del af den fjerde ventrikel.
- Åbn resten af baghjernen og rygmarven dorsalt over hele det rostrocaudale omfang af embryonet. Åben ved at skære dorsale væv, begyndende fra den fjerde ventrikel og arbejder mod den centrale kanal af den hale rygmarven ved hjælp af pincet som en saks (figur 2ca, b). Vær forsigtig med at undgå at berøre eller beskadige den ventrale rygmarv under denne procedure.
- Hold embryonet med et par pincet, og Knib det med det dorsale væv på hver side med det andet par pincet (figur 2EA).
Bemærk: Excised dorsale væv indeholder dorsale hud, mesenchyme, dorsale rodganglier (DRGs), dorsale hindbrain, og rygmarven. Fjern så meget af disse væv som muligt uden at beskadige SMN-kerner, fordi de er klæbende og kan fælde SMNs under filtrering eller forårsage tilstopning under FACS sortering. - Fjern den ventrale rygmarv ved hjælp af mikrodissektions kniven for at gennembore direkte under GFP-positive SMN. Løft den ventrale rygmarv med savlignende bevægelser på begge sider (figur 2FA, b). Skær den flydende ventrale rygmarv på tværs direkte over C1, hvor de første gfp-positive forreste horn projekter (figur 2G). Også skæres tværgående på den øvre grænse af den nedre lemmer (figur 2G). Fjern den cervikale (C1)-lænde (L2-L3) del af den ventrale rygmarv efter denne procedure.
- Placer den ventrale rygmarv dorsale side op og hold ved at trykke på GFP-negative væv mellem GFP-positive SMN kolonner med et par pincet. Fjern de resterende vedlagte mesenchyme, DRGs og rygmarv ved at trimme begge sider af den GFP-positive SMN-kolonne med mikrodissektions kniven (figur 2H). Vær forsigtig med at maksimere GFP-positive motoriske neuroner uden at beskadige dem.
- Ved hjælp af en P1000-pipette opsamles det dissekterede ventralrygmarvs væv med minimal HBSS og placeres i det SMN-mærkede 1,7 mL mikrocentrifuge glas fyldt med dissektions medium. Opbevares på is indtil dissociation. Fortsæt med at samle ventrale rygmarv fra yderligere embryoner i samme rør, indtil det samlede antal opfylder forsøgskravene.
Bemærk: Indsamling af mindst tre ventrale rygmarv, der giver ca. 2,1 x 104 SMN anbefales, fordi væv er udsat for stress under dissociation og sortering. - Saml ansigts motoriske neuroner og ekstremiteter i ISLMN: gfp -muse embryoner som gfp-positive og gfp-negative kontroller til henholdsvis fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). Ekstremiteterne er GFP-negative, fordi GFP-positive axoner af SMNs endnu ikke har udvidet sig til ekstremiteterne i denne embryonale alder.
6. vævs dissociation
Bemærk: Samlet dissociationstid er typisk 1,5 h pr. eksperiment.
- Varm papain og albumin-ovomucoid inhibitor opløsning aliquoter til 37 °c 30 min før dissociation.
- Drej kortvarigt mikrodissekeret væv med lav hastighed.
- Ved hjælp af en P100 pipette, Fjern forsigtigt så meget dvale E som muligt uden at aspirere væv.
Bemærk: Sørg for at fjerne alle resterende dvale E efter dette trin for at undgå at reducere effekten af papain dissociation i næste trin. - Tilsæt den passende mængde papain-opløsning (tabel 1) til hver af de 1,7 ml mikrocentrifuge glas, der indeholder de mikrodissekterede vævsprøver.
Bemærk: Den passende mængde papain til dissociationen blev bestemt for at maksimere den effektive dissociation og samtidig minimere stress på cellerne. - Forsigtigt udriv 8x med en P200 pipette. Udfør alle formalings trin forsigtigt for at bevare motorens neuron levedygtighed.
- De rør, der indeholder vævet, inkuberes i 30 min ved 37 °c, og med fingeren svirpe 10x hver 10 min. forsigtigt triturere hver suspension 8x med en P200 pipette efter inkubation. Spin ned cellerne ved 300 x g i 5 min.
- For at sikre effekten af ovomucoid-hæmning i næste trin skal du bruge en P1000-pipette til at fjerne og kassere så meget supernatanten som muligt uden at indsugning af vævene.
- Opløs pellets i det passende volumen af albumin-ovomucoid inhibitor opløsning (tabel 1) ved forsigtigt triturating 8x med en P200 pipette.
- Vent i 2 min at tillade eventuelle resterende stykker af udissocieret væv til at bosætte sig i bunden af røret.
- Saml så meget supernatanten som muligt uden at aspirere udissocierede væv ved hjælp af en P200 pipette. Supernatanten overføres til friske 1,7 mL mikrocentrifuge glas.
- Hvis nogle klumper af væv forbliver udissocierede efter trin 6,10, gentages trin 6.8 − 6.10 for det udissocierede væv, der forbliver i de originale 1,7 mL mikrocentrifuge glas for at maksimere det endelige udbytte af dissocierede celler, samtidig med at stress på cellerne minimeres dissocieret tidligere, indeholdt i supernatanten af trin 6,10.
- Spin ned cellerne ved 300 x g i 5 min. Fjern forsigtigt supernatanten med en P1000-pipette.
- Resuspension af pellet i den passende volumen af dissektion medium (tabel 1) ved pipettering 8x ved hjælp af en P1000 pipette. Den passende mængde af den endelige suspension blev fastlagt således, at celletætheden ikke overstiger 107 celler/ml, som kan blokere strømmen af strømnings cytometri maskine, men også således at cellerne ikke er alt for fortyndet, hvilket resulterer i en langsommere sortering hastighed.
- Filtrer suspensionerne gennem 70 μm celle-strainere for at eliminere eventuelle store klumper eller ufordøjet væv. Opslæmningen overføres til 5 mL rund bund polystyren reagensglas og opbevares på is, indtil det er nødvendigt.
7. fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)
Bemærk: Denne protokol blev optimeret ved hjælp af en FACS-sortering udstyret med en 15 MW 405 nm violet laser, en 100 MW 488 nm blå laser, en 75 MW 594 nm orange laser og en 40 MW 640 nm rød laser. Cellerne blev sorteret som kappe væske i sterile PBS under aseptiske forhold gennem en 100 μm dyse. For at minimere celle stress blev strømningshastigheden sat til et prøvetryk på 1 − 3, således at der blev erhvervet maksimalt 1.000 − 4000 hændelser pr. sekund. Den totale FACS-tid er typisk 1 − 2 h pr. eksperiment.
- Konfigurer spændinger for fremad-og side spredning, så celle populationen kan visualiseres korrekt. Opsætning af passende spændinger til celle sortering er kompleks og kræver en erfaren FACS-operatør.
- For at skelne mellem forskellige cellepopulationer, afbilde celler baseret på størrelse som bestemt af det fremad spredte område (FSC-A) versus intern kompleksitet som bestemt af side scatter området (SSC-A). Tegn en port omkring de levende celler som angivet i figur 3AA og figur BA for at udelukke snavs og døde celler. Gruppér cellerne i det indhegnet område som population 1 (P1).
- For at udelukke celle klumper og doublets, plot P1 celler næste baseret på side scatter bredde (SSC-W) versus SSC-A. Den samlede population af enkeltceller som population 2 (P2) (figur 3AB og figur BB).
- Plot P2 celler baseret på den fremadgående scatter bredde (FSC-W) versus FSC-A og Gate populationen af enkeltceller som population 3 (P3) (figur 3AC og figur BC).
Bemærk: brug af to på hinanden følgende porte i 7,3 og 7,4 udelukker celle klumper og form (høj FSC-W og høj FSC-A). - Gate P3-celler baseret på GFP versus allophycocyanin (APC). APC-kanalen registrerer autofluorescens. Når du gating på denne kanal, undgår du at indfange Autofilter celler. Brug GFP-negative celler til at justere spændingen for FITC/GFP fluorescerende kanaler. Ideelt set positions porte for disse cellepopulationer omkring 102. Vælg Gate tærskler for GFP-positiv population 4 (P4) individuelt for hver type af motor neuron (figur 3ad og figur BD).
Bemærk: Indstil GFP-porten meget højere for SMNs end for CN3s/CN4s for at opnå en ren kultur (figur 3ad og figur BD). En lavere GFP-port til SMN-kulturer fører til forurening af kulturerne med glia og ikke-motoriske neuroner. Dette er sandsynligvis fordi der er lavt niveau GFP udtryk i nogle glia og ikke-motoriske neuroner på grund af en utætte promotor. Procentdelen af GFP-positive celler sammenlignet med de samlede celler er typisk 0,5 − 1,5% for CN3s/CN4s og 1,5 − 2,5% for SMNs. Hvis dissektion var vellykket, kan disse tal bruges som benchmark til at bestemme den passende position for GFP-positive Gate (figur 3AE og figur be). - Udfør FACS i henhold til producentens protokol. P4 celler opsamles i friske 1,7 mL mikrocentrifuge glas fyldt med 500 μL motor neuron kulturmedium. Opbevares på is indtil plating.
Bemærk: Selvom cellerne kan sorteres direkte ind i brøndene, resulterer dette i et ulige antal celler pr. brønd. Sorter cellerne i 1,75 mL mikrocentrifuge glas og derefter pladen manuelt for at opnå en mere jævn plating fordeling.
8. kultur af rensede primær motoriske neuroner
- Fortynd FACS-isolerede CN3/CN4 og SMN-suspensioner med motor neuron-kulturmedium, som er forvarmet til 37 °C til tæthedsgrader på henholdsvis 5 x 103 og 1 x 104 celler/ml.
Bemærk: Et E 11.5 embryo giver ca. 1 x 103 CN3/CN4 og 7 x 103 SMN. Men disse udbytter er stærkt afhængige af renheden af dissekeret væv, grundighed af celle dissociation, og den passende tærskel af GFP Gates under FACS. - Overfør 96 brønd plader forbelagt med PDL og Laminin fra 37 °C vævskultur inkubator til laminar flow hætten og sug laminatet fra hver brønd. Brug plader og dæksedler straks uden at vaske.
- Tilsæt 200 μL fortyndet CN3/CN4 og SMN suspensioner i hver brønd af PDL/Laminin-coated 96 brønd plader. De endelige celle tætheder skal være 1 x 103 og 2 x 103 celler/godt for henholdsvis CN3/CN4 og SMN.
Bemærk: Indledende plating tæthed af SMNs i 96 brønd plader (2 x 103 celler/brønd) er dobbelt så meget som CN3s/CN4s (1 x 103 celler/brønd) for at opnå lignende endelige motoriske neuron numre og tætheder ved 2 og 9 dage in vitro (div) (4 − 6 x 102 og 2 − 4 x 102 celler pr brønd, henholdsvis). - Kultur neuroner i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Feed neuroner hver 5 dage ved at fjerne halvdelen af de gamle medier (100 μL) og erstatte med den samme mængde frisk motor neuron kulturmedium. Sørg for, at neuronal processer bliver synlige på 1 DIV og blive tykkere og længere af 14 DIV (figur 4). Neuronal celle organer bliver forstørret og har tendens til at aggregere i langsigtede kulturer, især for SMNs (figur 4).
Bemærk: Udfør alle mellem-og løsnings ændringer ved at lade halvdelen af den oprindelige medium volumen være for at undgå at fjerne de dyrkede celler. Dette omfatter fiksering og immuncytokemi (ICC) trin. Hvis alle medier fjernes, uanset hvor forsigtigt, de fleste af cellerne vil løsne sig og vaskes væk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med denne protokol var at rense og kultur både primær CN3s/CN4s og SMNs på lang sigt for at muliggøre komparative analyser af mekanismerne bag motoriske neuron lidelser (Se figur 1 og figur 2 for oversigt).
Når neuronerne blev isoleret og dyrket i kultur, blev næsten ren primær CN3/CN4 og SMN-kulturer opnået (figur 5a,B) og VEDLIGEHOLDT i mindst 14 div (figur 4 og figur 6). Renheds af CN3/CN4 og SMN kulturer ved 2 DIV var 93,5 ± 2,2% og 86,7 ± 4,7% henholdsvis, når vurderet af ICC ved hjælp af motoren neuron markør Islet1 og neuronal markør TUJ1 (figur 5B). Disse høje renheds var imidlertid stærkt afhængige af embryonerne alder og fastsættelsen af passende tærskler for GFP-porte under FACS (figur 3). Dissektion af embryoner ved E 10.5 er vanskeligere end dissektion på E 11.5 på grund af øget blødhed og sammenhængskraft af væv, hvilket resulterer i nedsat motorisk neuron udbytter. Renheds af E 10.5 CN3s/CN4s og SMNs var dog sammenlignelige med dem for E 11.5 embryoner (henholdsvis 92,8% og 82,2% ved 2 DIV; data indhentet fra et enkelt eksperiment). Renheds af CN3s/CN4s og SMNs faldt drastisk, da E 13.5 embryoner blev brugt, selv om kun den højeste GFP-positive population blev indsamlet (henholdsvis 20,7% og 7,4% ved 2 DIV; data indhentet fra et enkelt eksperiment), sandsynligvis på grund af ekspression af GFP i ikke-motoriske neuroner (figur 7). Den samme tendens gjaldt også for E 12.5-kulturerne, selv om den var langt mindre dramatisk. Derfor er embryoner på E 12.5 eller ældre uegnede til brug ved rensning af motor neuroner ved hjælp af denne protokol.
Pure motor neuron kulturer er værdifulde for at forstå isolerede vækstmønstre, adfærd og sårbarheder af motoriske neuroner. Dette eksempel demonstrerer, hvordan disse kulturer kan bruges til at teste motoriske neuron reaktioner på kemisk behandling. For at afgøre, om primære CN3s/CN4s og smns viser differens reaktioner på endoplasmatiske reticulum (er) stressorer, blev der opnået primære monokulturer af CN3s/CN4s og smns ved hjælp af denne protokol og behandlet med varierende koncentrationer af en er stressor, cyclopiazonic syre (CPA). Neuroner blev behandlet med CPA (5, 10, 15, 20, 25, eller 30 μM) eller køretøjets kontrol (DMSO) ved 2 DIV og fast 3 dage senere for ICC til at evaluere overlevelses ratioer (figur 8A). Antallet af levedygtige neuroner i hver prøve blev talt, og overlevelses ratioen blev beregnet som antallet af levedygtige celler i stof behandlede brønde divideret med antallet af levedygtige celler i brøndene behandlet med DMSO. CN3/CN4 monokulturer var signifikant mere modstandsdygtige over for CPA-behandling (10 − 25 μM) sammenlignet med SMN-monokulturer (figur 9 og figur 8B)31.
Afslutningsvis, denne protokol giver mulighed for generering af højt renset primær mus embryonale CN3/CN4 og SMN kulturer, der giver et stærkt og pålideligt system til undersøgelse af neuronal adfærd.
Figur 1: ordning for fremstilling af mus embryonale motor neuroner. Skematisk illustrerer de skridt, der er involveret i isolation og kultur af mus embryonale motoriske neuroner og den omtrentlige tid i timer eller dage for hvert trin. Rækkefølgen af dissektions proceduren for CN3/CN4 og for SMN er hver mærket sekventielt 1 til 4. Forkortelser: CN3/CN4 = oculomotoriske neuron/trochlear neuron; SMN = spinal motor neuron; FACS = fluorescens-aktiveret celle sortering; h = time; d = dag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: dissektion af ventrale hjernen og den cervikale (C1)-lumbal (L2-L3) del af ventrale rygmarven. A) laterale (a) og dorsale (b) synspunkter af gfp-positive motoriske neuroner i en e 11.5 ISLMN: gfp Transgene mus embryo under FLUORESCEIN isothiocyanat (FITC) belysning. Et hele Mount E 11.5 embryo blev fremstillet som tidligere beskrevet32 for at gøre embryonet gennemsigtigt. Efterfølgende blev embryonet analyseret ved immunofluorescens mærkning med anti-GFP-farvning (grøn). Billeder blev fanget under et Konfokal mikroskop. Skala stænger = 200 μm (lateral visning) og 400 μm (dorsal visning). Forkortelser: S = Superior; I = ringere; V = ventral; D = dorsal. (B-H) Dissektions trin fremhævet på billeder af e 11.5 ventrale hjernen og ventrale rygmarvs væv taget med et udstyret kamera under skarpt lys (BB) eller FITC belysning ved hjælp af en fluorescens dissektion stereomicroskop. Skala stænger = 200 μm (D) og 1 mm (A − C, E − H). B)a) fjernelse af embryoens ansigt og hale ved at skære langs de røde linjer. b) embryon, som er anbragt til dissektion. Placeringen af den forreste af mikroskopet er angivet med en asterisk. (C) skæring langs den faste røde linje for at slids åbne taget af den fjerde ventrikel (a) lateral visning og (b) dorsale udsigt. Brug af denne åbning til at skære langs overfladen af embryonet dorsale til hjernen (bane indikeret af stiplede røde pil). Dette udsætter vævet, der indeholder mesenchyme, CN3, og CN4, som kan løftes ud af kranium. For SMN dissektion, indsættelse af pincet i samme åbning mellem den fjerde ventrikel og dens tag, derefter skære mod den hale side af embryonet (bane indikeret af stiplede gule pil). D) endeligt syn på den ventrale hjernen, der indeholder bilaterale gfp-positive CN3 og CN4 kerner. Kanterne af vævet er fremhævet af en rød rektangel. Skæring langs gul punkteret linje for at indsamle CN3 og CN4 kerner separat, hvis det ønskes. (E) efter åbning af resten af baghjernen og rygmarven, flagrende dorsale væv klemt ud over de røde linjer på begge sider medpincet (a) før, og (b) efter. F) bilateralt fjernelse af overskydende vævs ventrale til rygmarven langs den røde linje (a) før og (b) efter. G) skæring af den ventrale rygmarv på de to steder, som er angivet med de røde linjer. På den rostrale side, skæring af den flydende ventrale rygmarv tværgående over C1, hvor den første GFP-positive forreste horn projekter. Skæring af den hale ende af rygmarven på tværs af den øvre grænse af den nedre ekstremitet. Når disse udskæringer er foretaget, kan den cervikale (C1) gennem lumbal (L2-L3) del af den ventrale rygmarv dissekeret væk. H) endeligt syn på den ventrale rygmarv, der indeholder gfp-positive SMN-søjler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentative sorter af ventrale midbrains (A) og ventrale rygmarv (B). (AA og BA) Fremad scatter område (FSC-A) versus side scatter område (SSC-A) sorteret plot før udelukkelse af snavs og døde celler. (AB, BB, AC, BC) Sorteret parceller for udelukkelse af celle klumper (b) og form (c) baseret på bredde (SSC-w) versus SSC-a og Forward scatter bredde (FSC-w) versus FSC-a, hhv. (Ad og BD) Sorteret plot at isolere ISLMN: gfp -positive motor neuroner. For at opnå en ren kultur skal GFP-porten indstilles højere for SMNs (BD) end for CN3s/CN4s (ad). (AE og be) Procentdele af celler gated for indsamling ved FACS sortering. % Parent repræsenterer procentdelen af celler i den aktuelle gated population i forhold til antallet af celler i den foregående indhegnet cellepopulation, hvorimod % Total repræsenterer procentdelen af indhegnede celler i forhold til de samlede celler. Forventede procentdele af GFP-positive celler sammenlignet med totale celler (boxed i rødt) er 0,5 − 1,5% for CN3/CN4 og 1,5 − 2,5% for SMN. Hvis dissektion blev udført med succes, kan disse procenter bruges som benchmark til opsætning af gfp-positive Gate in (ad og BD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: fasekontrast billeder af primære CN3/CN4 og SMN monokulturer ved 2, 7 og 14 div. Repræsentative differens interferens kontrast billeder af primære CN3/CN4 og SMN-kulturer blev erobret ved 2, 7 og 14 DIV med inverteret fluorescens mikroskop ved hjælp af tilsvarende billed erhvervelse og behandlings software og 40x mål. Neuronal processer blev tykkere og længere af 14 DIV. neuronal celle krop størrelser blev udvidet og tendens til at aggregere i langsigtede kulturer, især for SMNs. Begge kulturer kan opretholdes mindst 14 DIV. Scale bar = 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: karakteriseringer af isolerede e 11.5 mus CN3/CN4 og SMN kulturer. A) repræsentative immunocytokemi billeder af e 11.5 Mouse CN3s/CN4s (top) og smns (nederst) dyrket for 2 div. immunofluorescens mærkning med NEURONAL markør TUJ1 (grøn) og motoren neuron markør Islet1 (rød) udført for at analysere neuroner og kerner blev forfarvet med dapi (blå). Næsten alle de dyrkede celler var motoriske neuroner (TUJ1+, Islet1+). Billeder blev fanget med en inverteret fluorescens mikroskop ved hjælp af tilsvarende billede erhvervelse og behandling software og 20x mål. Prøverne blev afbildet og behandlet for at opnå maksimal signalintensitet uden mættede pixels. Alt det mikroskopiske arbejde og billedbehandling i de følgende tal blev udført under disse forhold, medmindre andet er angivet. Scale bar = 100 μm.B) renheds af e 11.5 mus CN3/CN4 og SMN kulturer ved 2 div. Renheds af CN3/CN4 og SMN-kulturer var henholdsvis 93,5 ± 2,2% og 86,7 ± 4,7%. Døde neuronal celle organer blev vurderet ved screening for pyknotisk nuklear morfologi og membran hævelse. Neuronal processer blev klassificeret som degenererede processer, når tegn på beading og hævelse blev observeret. Celler med hverken celledød eller degenererende processer blev betragtet som levedygtige ikke-motoriske neuroner (TUJ1+, Islet1-) eller levedygtige motor neuroner (TUJ1+, Islet1+)33. Renheds af motoriske neuron kulturer blev beregnet som antallet af levedygtige motor neuroner divideret med det samlede antal levedygtige ikke-motoriske neuroner plus levedygtige motor neuroner. Værdier repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM af tre separate eksperimenter. Ikke signifikant (p > 0,05) af elevens t -test. Celletælling blev udført manuelt under 20x forstørrelse. Forkortelser: SEM = standardfejl af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentativ immunocytokemi af primær CN3/CN4 og SMN monokulturer ved 2, 7 og 14 div. Primære CN3/CN4 og SMN kulturer blev analyseret ved 2, 7, 14 DIV ved immunofluorescens mærkning med TUJ1 (grøn), og kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Neuronal processer bliver tykkere og længere af 14 DIV. neuronal celle krop størrelser blev udvidet og tendens til at aggregere i langsigtede kulturer, især for SMNs. Både CN3/CN4 og SMN kulturer kan opretholdes mindst 14 DIV. billeder blev fanget under 10x forstørrelse. Scale bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: karakterisering af e 13.5 Mouse CN3/CN4 og SMN isolerede kulturer. E 13.5 CN3/CN4 og SMN blev isoleret og kultiveret ved hjælp af denne protokol og analyseret ved 2 DIV ved immunofluorescens mærkning med TUJ1 (grøn) og Islet1 (rød), og kernekerner blev modfarvet med DAPI (blå). Mange ikke-motoriske neuronal celler (TUJ1+, Islet1-) var til stede (pile) resulterer i en DRASTISK nedgang i både CN3/CN4 og SMN renhed, med faldet mere udtalt i SMN kulturer. Billeder blev fanget under 20x forstørrelse. Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: repræsentativ anvendelse af primær motorisk neuron kultur, der viser, at CN3s/CN4s er selektivt resistente over for er stress induceret af CPA. A) eksperimentel skitse: primære CN3/CN4 og SMN monokulturer blev behandlet med CPA eller køretøjets kontrol (DMSO) ved 2 div og celle overvejelserne blev evalueret gennem immuncytokemi analyse efter 3 dages behandling. Dette oplæg er blevet ændret fra offentliggjort arbejde31. B) kvantificering af overlevelses ratioer for CN3s/CN4s og smns behandlet med 5 − 30 μM CPA i 3 dage fra 2 div. neuroner blev analyseret ved immunfluorescent mærkning af celler med TUJ1, og kerner blev modfarvet med dapi. Overlevelses ratioer blev beregnet som antallet af levedygtige celler (Se figur 5B -legenden) i de stof behandlede brønde divideret med antallet af levedygtige celler i brønde, der indeholder alene køretøjet (DMSO). Celletælling blev udført manuelt under 20x forstørrelse. Værdier repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM af fire separate eksperimenter. * p < 0,05; p < 0,005 af elevens t -test. Dette tal er blevet ændret fra tidligere udgivet arbejde31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: repræsentativ immunocytokemi af primær CN3/CN4 og SMN monokulturer efter en 3 dages eksponering for stigende koncentrationer af CPA begyndende ved 2 div. Neuroner blev analyseret ved immunfluorescent mærkning af celler med TUJ1 (grøn) og kerner blev modfarvet med dapi (blå). Primære CN3s/CN4s var mere modstandsdygtige over for CPA behandling end primære SMNs. billeder blev fanget under 10x forstørrelse. Scale bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Antal mellem hjerner (X) | Papain | Albumin-ovomucoid | Dvale E | |||||||||
| 10 ≤ X ≤ 20 | 200 μL | 100 μL | 600 μL | |||||||||
| 20 < X ≤ 30 | 300 μL | 150 μL | 700 μL | |||||||||
| 30 < X ≤ 40 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| Antal rygmarvs ledninger (Y) | Papain | Albumin-ovomucoid | Dvale E | |||||||||
| 3 ≤ Y ≤ 5 | 200 μL | 100 μL | 500 μL | |||||||||
| 5 < Y ≤ 10 | 400 μL | 200 μL | 800 μL | |||||||||
| 10 < Y ≤ 15 | 600 μL | 300 μL | 1200 μL | |||||||||
Tabel 1: passende mængder af papain, albumin-ovomucoid og endelig suspension, der anvendes i dissociations trin. De passende mængder af papain og albumin-ovomucoid til brug med forskellige antal ventrale hjernen og ventrale rygmarvs væv blev ændret fra producentens anvisninger efter flere runder optimering. Da væv er udsat for stress under dissociation og sortering, anbefales en samlet samling på mere end 10 ventrale midhjerner og mere end tre ventrale rygmarv. Mængden af papain blev bestemt ved at overveje balancen mellem effektiv dissociation og stress i denne procedure. Mængden af albumin-ovomucoidinhibitor opløsning er halvdelen af papain. Den passende mængde af dvale E endelig suspension blev bestemt således, at celletætheden ikke overstiger 107 celler/ml, men cellerne ikke bliver alt for fortyndet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Historisk set har in vitro-studier af CN3 og/eller CN4 motoriske neuroner påberåbt sig heterogene kulturer såsom adskilles17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26og Slice27,28 kulturer, fordi disse celler ikke kan skelnes fra omgivende celler baseret på størrelse, og specifikke markører for disse celler er ikke blevet rapporteret. Denne protokol er en omfattende metode til isolation og kultur af primær E 11.5 murine CN3s/CN4s og SMNs fra de samme embryoner og bekræfter kulturens høje renhed. Ved at generere rene SMN-og CN3/CN4-kulturer fra de samme muse embryoner muliggør protokollen kontrollerede sammenligninger af in vitro-adfærd af CN3s/CN4s versus SMNs isoleret fra vildtype samt mutante embryoner.
De rene kulturer af CN3s/CN4s og SMNs genereret af denne protokol tillader sammenlignende undersøgelser af morfologiske, cellulære, molekylære og elektrofysiologiske egenskaber af disse motoriske neuroner. I teorien, fordi andre kranielle motor neuron populationer kan visualiseres og dissekeret fra denne ISLMN: gfp transgene Mouse line (herunder bortførte, motor trigeminal, facial, og hypogloal), denne protokol kunne udvides til deres isolation og kultur samt, forudsat at FACS gfp Gates justeres korrekt. Endelig kan de FACS-sorterede motoriske neuroner afledt af denne protokol underkastes genomisk (f. eks. assay for Transposase-tilgængelig kromatin ved hjælp af sekvensering eller ATAC-SEQ) og/eller transkriptomic (f. eks. RNA-sekvens31) for at studere normal udvikling og selektiv sårbarhed af specifikke motoriske neuron-undertyper i neurodegenerative
Der er flere trin i denne protokol, der er afgørende for at maksimere antallet af rene, sunde motor neuroner i det isolerede kultur system. Under dissektion, GFP-negative væv (f. eks, mesenchyme og DRG) bør være maksimalt fjernes uden at beskadige motoren neuroner, fordi disse væv er klæbende og kan fælde SMNs under filtrering eller forårsage tilstopning under FACS sortering. Under vævs dissociation skal den minimale essentielle mængde papain anvendes, og cellerne skal behandles forsigtigt med minimal, men tilstrækkelig trituration. Papain blev anvendt til vævs dissociations trinnet i denne protokol, fordi foreløbige data indikerede, at det var mindre destruktivt end trypsin til både CN3/CN4 og SMN. Overlevelses ratioer baseret på det belagte antal CN3s/CN4s og SMNs ved 2 DIV steg fra 39,5% til 52,7% og fra 52,3% til 58,4% henholdsvis, når papain blev anvendt i stedet for trypsin (0,25%, 4 min inkubation). Selv om disse tal er afledt af et enkelt eksperiment udført før fuld optimering, tyder yderligere rapporter også på, at Trypsin er suboptimal til celle ekstraktion fra nervesystemet væv12,34,35,36. Under FACS bør fluorescerende vitale farvestoffer (propidium kaliumiodid og værelse Blue) og små sorterings dyser (f. eks. 70 μm) ikke anvendes, fordi de er skadelige for motorisk neuron overlevelse. Brug af store sorterings dyser (100 μm eller større) anbefales stærkt, fordi SMN celledød stiger markant, når der anvendes en 70 μm dyse. Fastsættelse af passende gating tærskler for GFP-positive celler i FACS er et kritisk skridt for at opnå rene kulturer. Motor neuron kulturer er suppleret med forskolin, IBMX, og vækstfaktorer (BDNF, CNTF, og GDNF). Forskolin og ibmx er blevet rapporteret til at additivt fremme SMN overlevelse37,38. Foreløbige data fra de nuværende undersøgelser tyder på, at forskolin og IBMX også additivt øge CN3/CN4 overlevelse. Overlevelse ratio baseret på forgyldt antal CN3s/CN4s ved 2 DIV steg fra 17,5% til 26,9%, 31,9%, og 37,0% når IBMX, forskolin, og IBMX + forskolin blev tilføjet, henholdsvis (tal er baseret på et enkelt eksperiment udført forud for fuld optimering af cellekultur betingelser). Det er bedst at udføre alle medium ændringer og skyller af dyrkede celler ved at lade halvdelen af den oprindelige volumen for at undgå at løsne dyrkede celler. Endelig er det også ideelt at reducere den tid, der bruges mellem dissektion og plating af motoriske neuroner (f. eks. ved at forkorte dissektions tiden ved hjælp af flere dissektorer) for at forbedre kulturerne.
Der er fire store potentielle problemer, der kan opstå, når du følger denne protokol. Den første er lav udbytte af motoriske neuroner efter FACS. Potentielle årsager til lave udbytter omfatter brug af unge embryoner (f. eks. E 10.5), som har færre motoriske neuroner, utilstrækkelig fjernelse af klæbende GFP-negative væv under dissektion (fx mesenchyme og DRGs), som kan fælde motoriske neuroner og føre til deres fjernelse under filtrering, utilstrækkelig papainisering/trituration under dissociation og/eller indstilling af GFP-positive Gate for høj under FACS. Det andet potentielle problem er den lave renhed af motoriske neuron kulturer, som sandsynligvis opstår som følge af brugen af ældre embryoner (f. eks. E 12.5) og/eller fra at sætte den GFP-positive port for lav under FACS. For det tredje kan et lavt antal tilsluttede motoriske neuroner i kulturen observeres på grund af upassende FACS sortering og/eller utilstrækkelig PDL/laminat belægning af plader/dæksedler. For det fjerde kan motor neuroner vise lav levedygtighed i kulturen. Potentielle årsager til lav levedygtighed omfatter grov og/eller langvarig dissektion, overdreven papainisering/trituration under dissociation, uhensigtsmæssig håndtering af celler i hele protokollen (f. eks. grov Pipettering af celler, undladelse af at placere celler på is, manglende pre-chill PBS og HBSS) og/eller overdreven tid mellem euthanization af drægtige mus og endelig plating af cellerne. Brug af reagenser, der ikke er friske og/eller uhensigtsmæssige koncentrationer, kan også forringe forsøgsresultaterne.
Der er tre væsentlige begrænsninger i denne protokol. ISLMN: gfp TRANSGENE mus og FACS sortering er begge temmelig dyrt. De er imidlertid afgørende for denne protokol, da der i øjeblikket ikke findes nogen alternativ metode, som kan generere højt oprenset CN3s/CN4s på en mere økonomisk måde. Der er en lille E 10.5-E 12.5 alder vindue for embryonale mus, og det er svært at bekræfte, at passende alderen embryoner er til stede, især hvis en ultralyd maskine er ikke tilgængelig. Hvis kun rene smns er påkrævet, kan de udledes af e 12.5-15.0 muse embryoner ved hjælp af metoder som gradient centrifugering10,11,12 og/eller p75NTR-antistof-baserede celle sortering panorering teknikker13,14,15,16. Endelig, protein-baserede assays, der kræver en stor mængde af udgangsmateriale er ikke muligt fra disse kulturer på grund af den lille udbytte af motoriske neuroner (især CN3s/CN4s). Stamcelle-afledte motor neuroner31,39, som kan genereres ubegrænset, kunne i teorien erstattes til dette formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Brigitte pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) for instruktion i SMN dissektion teknikker; Dana Farber Cancer Institute flow cytometry Facility, den immunologiske division flow cytometry facilitet på Harvard Medical School, Joslin Diabetes Center flow cytometry Core, Brigham og Women's Hospital flow cytometry Core, og Boston children's Hospital flow cytometry Research facilitet til FACS isolering af primære motoriske neuroner; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, yderligere engle laboratorie medlemmer og projekt ALS konsortiemedlemmer til teknisk assistance og betænksomme diskussioner. Denne undersøgelse blev støttet af projekt ALS. Desuden blev R.F. finansieret af Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research tilskud i udlandet og NIH uddannelse Grant i genetik T32 GM007748; J.J. blev støttet af NIH/NEI træningsprogram i molekylære baser af øjensygdomme (5T32EY007145-16) gennem Schepens Eye Research Institute og af udviklingsmæssige Neurology Training program postdoc Fellowship (5T32NS007473-19) gennem Boston children's Hospital; M. C. W blev støttet af NEI (5K08EY027850) og children's Hospital Ophthalmology Foundation (fakultet Discovery Award); og E.C.E. er et Howard Hughes Medical Institute investigator.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | - | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size 0.05 mm x 0.01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | - | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7 mL Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| Rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | - | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant - A+B 0.9 kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 mm x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | - | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , In press e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G. Jr, Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
