To-trins hudcarcinogenese induceres af to topisk anvendte kemikalier. En mutagen 7, 12-dimethylbenz [a] anthracen) forårsager mutationer i Epidermal celler og en kontinuerlig anvendelse af generelle vækst stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbols-13-acetat accelererer huden papilloma dannelse.
Kræft er en af de mest ødelæggende sygdomme hos mennesker. Eksperimentelle kræft modeller er vigtige for at få indsigt i det komplekse samspil mellem forskellige celletyper og gener i at fremme tumorprogression og til at give en platform til afprøvning af effekten af forskellige terapeutiske tilgange. En af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle inflammatoriske kræft modeller er DMBA-TPA to-trins hud carcinogenese model. Tumor dannelse induceres i denne model af den topikale anvendelse af to forskellige kemikalier, 7, 12-dimethylbenz [a] anthracen (DMBA) og 12-O-tetradecanoyl phorbols-13-acetat (TPA), der tilsammen forårsager papilloma dannelse i huden. Som det primære resultat er papilloma dannelse i huden, modellen er en ideel, pålidelig, og reproducerbare måde at løse både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og tumorprogression (antal og størrelse af synlige tumorer). Virkningerne af DMBA-TPA behandling overføres via en inflammatorisk mekanisme, hvilket gør denne model specielt egnet til at studere rollen af immunsystemet i tumordannelse. Denne model er dog begrænset til huden og andre overflader, hvor kemikalierne kan påføres. Der findes en detaljeret protokol i denne artikel, hvor modellen kan bruges korrekt.
Kræft er en af de førende dødsårsager i verden. Derfor er der et krav om at udvikle pålidelige eksperimentelle sygdomsmodeller for at opnå en bedre forståelse af sygdommen samt for at udforske potentielle terapeutiske tilgange. En af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle in vivo modeller til at studere hudkræft udvikling er den kemisk induceret to-trins hud carcinogenese model1,2. Modellen giver et værktøj til at studere tumor initiering, forfremmelse, og progression i tillæg til specifikke begivenheder såsom immuncelle infiltration og angiogenese.
At bruge to-trins hud carcinogenese model, bagsiden hud af mus er behandlet med to forskellige kemikalier, der tilsammen fremkalde tumordannelse. Modellen initieres med en lav dosis af mutagen, DMBA, efterfulgt af længerevarende udsættelse for tumor promotoren, TPA3 (figur 1). Dmba muserer DNA tilfældigt ved at danne kovalente addukter med DNA fra Epidermal celler og primære keratinocyt stamceller4,5,6,7. Nogle af disse tilfældige mutationer finder sted i en proto-oncogene, såsom Hras1 (mutationer i Kras og NTM opdages også) og omdannelsen af proto-onkogener til onkogener driver tumordannelse under ordentlige stimuli. TPA, igen, er den mest almindeligt anvendte tumorvækst fremmende middel. Dens molekylære mål er proteinkinase C (PKC)8. TPA aktiverer også WNT/β-køreledningen i signalering, der er afgørende for tumordannelse i model9. Gentagen og langvarig udsættelse for fremme agent fører til øget celle signalering, øget produktion af vækstfaktorer, og en lokal inflammatorisk reaktion, som er indlysende på grund af øget DNA-syntese og inflammatorisk celleinfiltration i den behandlede hud.
De vigtigste inflammatoriske mediatorer i DMBA-TPA-modellen er blevet identificeret10. Interleukin-17a (Il-17a) er kendt for at være særligt tumorigent i dmba-TPA-modellen11,12. Det virker i synergi med interleukin 6 (Il-6) og deltager i makrofag og neutrofilrekruttering13,14. Desuden har CD4+ T- celler og neutrofiler vist sig at være tumorigent i dmba-TPA-modellen. Endelig kan makrofager også fremme tumor i model15,16,17.
Under forfremmelses fasen forstærkes celle spredningen af de muterede celler, og et vedvarende hyperplasi af epidermis vedligeholdes1. Dette fører til papilloma udvikling i huden i 10 – 20 uger, hvorefter papillomer begynder at konvertere til maligne tumorer, plade celle karcinomer (SCCS)2. Men mindre end 10% af papillomer fremskridt til malignitet, selv om denne procentdel også afhænger af den genetiske baggrund af musene2,18. I årtier var det ikke kendt, hvilken type celler blev oprindeligt muteret i tumorer fører til malignitet, selv om nogle undersøgelser havde rapporteret klart forskellige funktioner i de Maligne tumorer i forhold til benign papillomer19,20. Men, nylige undersøgelser har i høj grad øget vores forståelse på den klonale oprindelse af tumordannelse i DMBA-TPA model21. 22. 23. det blev påvist, at både knoglemarv-afledte epiteliale celler og hårsæk stamceller bidrager til tumordannelse22. Stage-specifikke Lineage Tracing undersøgelser har afsløret, at godartede papillomer af monoklonale oprindelse, men de rekruttere nye epiteliale cellepopulationer21,23. Men kun en af celle klonerne fungerer som en drivkraft for carcinogenese; den indeholder en HRAS-mutation23. Progression til karcinom dannelse er forbundet med en klonal feje23.
Det kræftfremkaldende DMBA initierer papilloma dannelse og TPA fremmer tumorvækst. Derfor kan tumor initiering undersøgt separat fra kampagnen ved at afbryde eksperimentet før TPA-behandlingsperioden. Som tumorprogression er undersøgt ugentligt det giver en stor mulighed for detaljeret tumorvækst analyse i hele studiet. Fordi tumorer er genereret af eksterne kemikalier, en onkogen mutation i kimcelle er unødvendig. Således er det ligetil at studere virkningerne af en genetisk baggrund (f. eks. knockout/transgene vs. vildtype) på tumor2. I sum, DMBA/TPA Skin Cancer model er en særlig nyttig tilgang til at studere rollen af immunsystemet i tumorprogression samt til evaluering af tumor initiering og forfremmelse skridt selvstændigt eller indbyrdes afhængige.
Figur 1: DMBA-TPA-induceret hud carcinogenese model skitse. Det kræftfremkaldende dmba påføres topisk for at inducere DNA-mutationer i Initierings fasen af modellen. Den vækstfremmende agent TPA administreres 2x om ugen for at øge celle spredningen under forfremmelses fasen, hvilket fører til udviklingen af papillomer i huden. Dyr ofres, efter at papillomas respons når et plateau, sædvanligvis inden for uger 15-20, afhængigt af muternes genetiske baggrund. En lille del af papillomer kan videreudvikle sig til VKF inden for 20 – 50 uger. For at studere tidlige hændelser i Initierings fasen og den tidlige forfremmelses fase kan der indsamles prøver (f. eks. kort tid efter den anden TPA-applikation). Et repræsentativt fotografi og hematoxylinlegemer og eosin farvede tværsnit af papillomer på en C57BL/6 mus hud efter 19 ugers behandling er vist. Scale bar = 0,1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
DMBA-TPA-induceret hudkræft er en af de mest almindeligt anvendte kræft modeller, fordi det er meget reproducerbare og giver oplysninger om tumorprogression fra initiering til malignitet. Den vigtigste resultatmåling, papilloma dannelse, er let og pålideligt kvantitativ. Modellen henvender sig både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og progression (tumor tal og størrelser) samtidig. Modellen er velegnet til at studere forskellige forbindelser, såsom potentiel terapeutisk, og virkningerne af individuelle gene…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af det finske Akademi (tilskud 25013080481 og 25013142041 (I.J.), 286377 og 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), den konkurrencedygtige statslige forskning Finansiering af området for ekspert ansvar på Tampere Universitets Hospital (Grant 9V049 og 9X044 (M.P.), 9X011 og 9V010 (T.J.)), den konkurrencedygtige stats forskningsfinansiering af Fimlab Laboratories-laboratoriets ekspert ansvarsområde (Grant X51409 (I.J.)), Tays Støttefond (I.J., M.P., T.J.), Tampere tuberkulose Foundation (I.J., M.P., T.J.), den finske Kulturfond (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.) og Emil Aaltonen Foundation (T.P.).
1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm – Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |