디메틸벤드[a]안트라세네 및 12-O-테트레이드카노일 포르볼-13-아세테이트(DMBA-TPA)를 이용한 화학적 유발 피부 발암 모델
Summary
2 단계 피부 발암은 2개의 국소 적용된 화학제품에 의해 유도됩니다. 돌연변이 원 7,12-디메틸벤젠[a]anthracene)은 표피 세포의 돌연변이를 일으키고 일반적인 성장 자극기 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-아세테이트의 지속적인 적용은 피부 유두종 형성을 가속화합니다.
Abstract
암은 가장 치명적인 인간의 질병 중 하나입니다. 실험적인 암 모형은 종양 진행을 승진시키기에 있는 다른 세포 모형 및 유전자의 복잡한 상호 작용에 통찰력을 얻고 다른 치료 접근의 효험을 시험하기 위한 발판을 제공하기 위하여 중요합니다. 가장 일반적으로 사용되는 실험적 염증성 암 모델 중 하나는 DMBA-TPA 2단계 피부 발암 모델입니다. 종양 형성은 두 가지 다른 화학 물질, 7,12-디메틸벤드[a]안트라세네(DMBA) 및 12-O-테트레이드카노일 포르볼-13-아세테이트(TPA)의 국소 적용에 의해 이 모델에서 유도되며, 이는 함께 피부에 유두종 형성을 일으킨다. 1 차적인 결과는 피부에 있는 유두종 대형이기 때문에, 모형은 종양 개시 (종양 자유로운 생존) 및 종양 진행 (눈에 보이는 종양의 수 그리고 크기) 둘 다를 해결하는 이상적이고, 믿을 수 있고, 재현가능한 방법입니다. DMBA-TPA 치료의 효과는 염증 메커니즘을 통해 전달되며, 이 모델은 종양 형성에서 면역 계통의 역할을 연구하는 데 특히 적합합니다. 그러나 이 모델은 화학 물질을 적용할 수 있는 피부 및 기타 표면으로 제한됩니다. 이 문서에서는 모델을 성공적으로 사용할 수 있는 자세한 프로토콜이 제공됩니다.
Introduction
암은 세계에서 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 따라서, 질병에 대한 더 나은 이해를 얻고 잠재적인 치료 접근법을 탐구하기 위해 신뢰할 수 있는 실험적 질병 모델을 개발해야 하는 요구가 있다. 피부암 발병을 연구하기 위해 생체내에서 가장 일반적으로 사용되는 실험 모델 중 하나는 화학적으로 유도된 2단계 피부발암 생성 모델1,2이다. 이 모델은 면역 세포 침투 및 혈관 신생과 같은 특정 사건 이외에 종양 개시, 승진 및 진행을 연구하는 도구를 제공합니다.
2단계 피부 발암 모델을 사용하기 위해, 마우스의 뒷피부는 함께 종양 형성을 유도하는 2개의 상이한 화학물질로 치료된다. 모델은 돌연변이원, DMBA의 저용량으로 개시되고, 종양 프로모터, TPA3에 장기간 노출된다(도1). DMBA는 표피 세포와 1 차적인 각질 세포 줄기 세포의 DNA를 가진 공유 adducts를 형성하여 무작위로 DNA를돌연변이4,5,6,7. 이 무작위 돌연변이의 몇몇은 Hras1와 같은 프로토 종양유전자에서 일어나고 (Kras와 Nras에 있는 돌연변이는 또한 검출됩니다) 및 종양 유전자에 프로토 종양유전자의 변환은 적당한 자극의 밑에 종양 대형을 구동합니다. TPA는 차례로, 가장 일반적으로 사용되는 종양 성장 촉진 제이다. 이의 분자 표적은 단백질 키나아제C(PKC)8이다. TPA는 또한 모델9에서종양 형성에 중요한 Wnt/β-카테닌 신호를 활성화합니다. 촉진제에 대한 반복적이고 장기간 노출되면 세포 신호 신호, 성장 인자의 생산 증가, 및 치료된 피부의 DNA 합성 및 염증 세포 침투 증가로 인한 국소 염증 반응이 나타납니다.
DMBA-TPA 모델의 주요 염증 성 중재자는10. 인터류핀-17A(IL-17A)는 DMBA-TPA 모델11,12에서특히 종양발생성인 것으로 알려져 있다. 인터류키친 6(IL-6)과 시너지 효과를 발휘하며 대식세포 및 호중구 모집에 참여하고13,14. 또한,CD4+ T 세포 및 호중구는 DMBA-TPA 모델에서 종양발생이 있는 것으로 나타났다. 마지막으로, 대식세포는 또한 모델15,16,17에서종양 발생을 촉진할 수 있다.
촉진 단계에서, 돌연변이된 세포의 세포 증식은 강화되고 표피의 지속적인 증식은1. 이것은 10-20 주에 있는 피부에 있는 유두종 발달로 이끌어 내고, 그 후에 유두종은 악성 종양, 편평상피세포 암(SCC)2로 전환하기 시작합니다. 그러나, 유두종의 10% 미만은 악성으로 진행되지만, 이 비율은 또한 마우스2,18의유전적 배경에 의존한다. 수십 년 동안 어떤 종류의 세포가 악성 종양으로 이어지는 종양에서 처음 돌연변이되었는지는 알려지지 않았지만, 일부 연구는 양성 유두종19,20과비교할 때 악성 종양에서 명확하게 뚜렷한 특징을 보고했음에도 불구하고. 그러나, 최근 연구 결과는 DMBA-TPA 모형21에있는 종양 대형의 클론 기원에 우리의 이해를 크게증가시켰습니다. 22. 23.골수 유래 상피 세포와 모낭 줄기 세포 모두 종양 형성에 기여하는 것으로 입증되었다22. 단계 특정 혈통 추적 연구 결과는 양성 유두종이 단클론 기원의 다는 것을, 그러나 새로운 상피 세포 인구를 모집한다는 것을 밝혔다21,23. 그러나, 세포 클론 중 하나만 발암을 위한 드라이버로 기능; 그것은 Hras 돌연변이23을포함합니다. 암종 형성에 대한 진행은 클론스윕(23)과연관된다.
발암 물질 DMBA 유두종 형성을 시작 하 고 TPA 종양 성장을 촉진. 따라서, 종양 개시는 TPA 치료 기간 전에 실험을 중단시킴으로써 촉진으로부터 별도로 연구될 수 있다. 종양 진행이 매주 연구됨에 따라 연구 전반에 걸쳐 상세한 종양 성장 분석을 위한 좋은 기회를 제공한다. 종양은 외부 화학 물질에 의해 생성되기 때문에 생식선의 종양 발생 돌연변이가 필요하지 않습니다. 따라서, 종양 발생에 대한 유전 적 배경 (예를 들어, 녹아웃 / 이식 유전자 대 야생 유형)의 효과를 연구하는 것은 간단합니다2. 요약하면, DMBA/TPA 피부암 모델은 종양 진행에서 면역 계통의 역할을 연구할 뿐만 아니라 종양 개시 및 승진 단계의 독립적으로 또는 상호 의존적으로 평가하는 데 특히 유용한 접근법이다.
도 1: DMBA-TPA-유도 피부 발암 모델 개요. 발암 물질 DMBA는 모델의 개시 단계에서 DNA 돌연변이를 유도하기 위해 국소적으로 적용된다. 성장 촉진제 TPA는 촉진 단계 동안 세포 증식을 향상시키기 위해 일주일에 2회 투여되며, 피부의 유두종 발달로 이어진다. 유두종 반응이 고원에 도달한 후, 보통 마우스의 유전적 배경에 따라 15-20주 이내에 동물을 희생한다. 유두종의 작은 비율은 20-50 주 안에 SCC로 더 발전할 수 있습니다. 개시 및 조기 승격 단계에서 초기 이벤트를 연구하기 위해 샘플을 수집할 수 있습니다(예: 두 번째 TPA 적용 직후). 19주 간의 치료 후 C57BL/6 마우스 피부에 유두종의 대표적인 사진과 헤마톡실린 및 에오신 스테인드 단면이 표시됩니다. 배율 표시줄 = 0.1 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
DMBA-TPA 유도된 피부암은 매우 재현성이 뛰어나고 개시에서 악성종양에 이르는 종양 진행에 대한 정보를 제공하기 때문에 가장 일반적으로 사용되는 암 모델 중 하나입니다. 주요 결과 측정, 유두종 형성은 쉽고 안정적으로 양적입니다. 이 모델은 종양 개시 (종양없는 생존) 및 진행성 (종양 수 및 크기)을 동시에 해결합니다. 이 모델은 잠재적 치료제와 같은 다양한 화합물을 연구하는 데 적합하며 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 핀란드 아카데미 (보조금 25013080481 및 25013142041 (I.J.), 286377 및 295814 (M.P.), 287907 (T.J.), Päivikki 및 사카리 솔베르크 재단 (M.P., T.J.), 핀란드 의학 재단 (T.P.), 경쟁 국가 연구 탐페레 대학 병원의 전문가 책임 영역 의 자금 조달 (부여 9V049 및 9X044 (M.P.), 9X011 및 9V010 (T.J.), Fimlab 실험실의 전문가 책임 영역의 경쟁 국가 연구 자금 조달 (부여 X51409 (I.J.)), Tays 지원 재단(I.J., M.P., T.J.), 탐페레 결핵 재단(I.J., M.P., T.J.), 핀란드 문화 재단(M.V.), 파울로 재단(T.P.), 핀란드 암 학회(M.P.), 에밀 알토넨 재단(T.P.).
Materials
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm – Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
References
- DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
- Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
- Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
- Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
- Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
- Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
- Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
- Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
- Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
- Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
- Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
- He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
- Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
- Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
- Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
- Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
- Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
- Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
- Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
- Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, 400-409 (2015).
- Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
- Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
- Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
- Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
- Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
- Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
- May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
- Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
- Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
- Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
- Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
- Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
- Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
- Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
- Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
- Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
- Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
- Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
- Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
- Day, C. -. P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).
