Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

Maria V&#228;h&#228;tupa; Toini Pemmari; Ilkka Junttila; Marko Pesu; Tero  A.H. J&#228;rvinen

doi:10.3791/60445

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Cancer Research

מודל מסרטן העור המושרה כימי באמצעות דימתילבנץ [a] פחם ו-12-O-טטרדאנואיל פורבול-13-אצטט (DMBA-הסברתי)

Published: December 19, 2019

doi:

10.3791/60445

Maria Vähätupa*¹, Toini Pemmari*¹, Ilkka Junttila², Marko Pesu², Tero A.H. Järvinen

¹Faculty of Medicine and Health Technology,Tampere University and Tampere University Hospital, ²Department of Clinical Microbiology,Fimlab Laboratories

Summary

שני השלבים העור קרצינונוספגנזה נגרמת על ידי שני כימיקלים למריחה על הגוף. מוטגן 7, 12-diמתילבנץ [א] פחם) גורם מוטציות בתאים עוריות ויישום מתמשך של מקשה צמיחה כללית 12-O-טטרדקליאיל פורובול-13-אצטט מאיץ הפפילומה העור היווצרות.

Abstract

סרטן היא אחת ממחלות האדם ההרסניות ביותר. מודלים של סרטן ניסיוני חשוב לקבל תובנה לתוך הגומלין המורכבים של סוגי תאים שונים וגנים בקידום התקדמות הגידול כדי לספק פלטפורמה לבדיקת יעילות של גישות טיפוליות שונות. אחד הדגמים הנפוצים ביותר בשימוש בסרטן דלקתיות הניסויים הוא DMBA-הסברתי שני בשלב העור קרצינופוגנזה מודל. היווצרות הגידול הוא המושרה במודל זה על ידי יישום מקומי של שני כימיקלים שונים, 7, 12-diמתילבנץ [a] פחם (DMBA) ו 12-O-טטרדאנואיל פורובול-13-אצטט (הסברתי), כי ביחד לגרום היווצרות הפפילומה בעור. כמו התוצאה העיקרית היא היווצרות הפפילומה בעור, המודל הוא אידיאלי, אמין, הדרך הניתן ליישום לטפל בשני הגידול (הישרדות ללא הגידול) ואת התקדמות הגידול (מספר וגודל של גידולים גלויים). ההשפעות של הטיפול DMBA-הסברתי מועברים באמצעות מנגנון דלקתי, מה שהופך את המודל הזה מתאים במיוחד ללמוד את התפקיד של מערכת החיסון במערך הגידול. עם זאת, מודל זה מוגבל לעור ומשטחים אחרים שבהם ניתן להחיל את הכימיקלים. פרוטוקול מפורט מסופק במאמר זה כדי להשתמש במודל בהצלחה.

Introduction

סרטן הוא אחד הגורמים המובילים למוות בעולם. לכן, יש דרישה לפתח מודלים אמין של מחלות נסיוניות כדי להשיג הבנה טובה יותר של המחלה, כמו גם לחקור גישות טיפוליות פוטנציאליות. אחד הניסויים הנפוצים ביותר ב vivo מודלים לחקר התפתחות סרטן העור הוא המושרה כימית שני בשלב העור קרצינובגנזה דגם¹^,². המודל מספק כלי לחקר ייזום הגידול, קידום, והתקדמות בנוסף אירועים ספציפיים כגון הסתננות התא החיסונית אנגיוגנזה.

כדי להשתמש במודל העור של שני השלבים, העור האחורי של עכברים מטופל עם שני כימיקלים שונים, כי ביחד לגרום להיווצרות הגידול. המודל הוא יזם עם מינון נמוך של המוטגן, DMBA, ואחריו חשיפה ממושכת למקדם הגידול, הסברתי³ (איור 1). Dmba מוטציה דנ א באופן אקראי על ידי יצירת הפונקציות הקווננטי עם ה-dna של תאים עוריות ותאי גזע העיקרי keratinocyte⁴^,⁵^,⁶^,⁷. כמה מוטציות אקראיות אלה להתרחש במקום הפרוטו-אונאוגן, כגון Hras1 (מוטציות ב קראס ו Nras מזוהים גם) ואת ההמרה של פרוטו-אונגנים כדי אונגנים כוננים את היווצרות הגידול תחת גירויים נכונה. הסברתי, בתורו, הוא הגידול הנפוץ ביותר בשימוש בצמיחה-הסוכן לקדם. המטרה המולקולרית שלה היא קינאז חלבון (PKC)⁸. הסברתי גם מפעיל Wnt/β-catenin איתות כי הוא חיוני להיווצרות הגידול במודל⁹. חשיפה חוזרת וממושכת אל הסוכן לקדם מוביל איתות התא משופר, הגדלת הייצור של גורמי גדילה, תגובה דלקתית מקומית, אשר ברור בשל סינתזה מוגברת DNA וחדירת תאים דלקתיים בעור המטופל.

מתווכים דלקתיים מפתח במודל DMBA-הסברתי זוהו¹⁰. Interleukin-17a (IL-17a) ידוע להיות טווריגניים במיוחד במודל dmba-הסברתי¹¹^,¹². היא פועלת בסינרגיה עם אינטרלוקין 6 (IL-6) ומשתתפת ב-מקרופאג ובגיוס נויטרופילים¹³^,¹⁴. בנוסף, CD4⁺ T תאים נויטרופילים הוכחו להיות tuמוריגניים במודל dmba-הסברתי. לבסוף, מקרופאגים יכולים גם לקדם tuמוריגנזה במודל¹⁵^,¹⁶^,¹⁷.

במהלך שלב הקידום, התפשטות התא של התאים מוטציה הוא משופר והיפרפלזיה מתמשכת של האפידרמיס נשמר¹. זה מוביל התפתחות הפפילומה בעור בתוך 10 – 20 שבועות, אחרי אשר הפפילומה להתחיל להמיר גידולים ממאירים, קרצינומה של תאים קשקשיים (SCCs)². עם זאת, פחות מ 10% של התקדמות הפפילומה כדי ממאירות, למרות אחוז זה גם תלוי ברקע גנטי של עכברים²^,¹⁸. במשך עשורים זה לא היה ידוע איזה סוג של תאים היו בתחילה מוטציה בגידולים המובילים ממאירות, אף על פי מחקרים מסוימים דיווחו בבירור תכונות נפרדות של גידולים ממאירים בהשוואה שפיר הפפילומה¹⁹^,²⁰. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הגדילו מאוד את ההבנה שלנו על מקור המשובטים של היווצרות הגידול ב-DMBA-הסברתי מודל²¹^. ^{. בסדר,} 22 ²³. זה הוכח כי הן מח עצם נגזר האפיתל תאים ותאי גזע שיער זקיק לתרום את היווצרות הגידול²². מחקרים ספציפיים השושלת שושלת היוחסין חשפה כי הפפילומה השיפיר הם של מקור חד שבטיים, אבל הם לגייס אוכלוסיות חדשות אפיתל החדש²¹^,²³. עם זאת, רק אחד של שיבוטים תא מתפקד כמנהל התקן עבור קרצינופוגנזה; הוא מכיל מוטציה של Hras²³. ההתקדמות ליצירת קרצינומה קשורה. לסריקת שבטיים²³

DMBA מסרטן יוזם היווצרות הפפילומה ו הסברתי מקדמת צמיחת הגידול. מכאן, את החניכה הגידול ניתן ללמוד בנפרד מן הקידום על ידי הפרעה בניסוי לפני תקופת הטיפול הסברתי. כמו התקדמות הגידול הוא למד שבועי הוא מציע הזדמנות גדולה לניתוח מפורט הגידול בגידולים במהלך המחקר. בגלל הגידולים מופקים על ידי כימיקלים חיצוניים, מוטציה אונגניים ב germline היא מיותרת. כך, לימוד ההשפעות של רקע גנטי (למשל, הסתרה/העברה לעומת סוג פראי) על tuמוריגנזה הוא פשוט². בסכום, DMBA/הסברתי מודל סרטן העור היא גישה שימושי במיוחד עבור לימוד התפקיד של מערכת החיסון בהתקדמות הגידול, כמו גם להערכת ייזום הגידול וקידום צעדים עצמאית או באופן בלתי תלוי.

איור 1: DMBA-הסברתי-המושרה העור קרצינואוגנזה מודל המתאר. DMBA מסרטן הוא למריחה על הראש כדי לגרום למוטציות DNA בשלב החניכה של המודל. הצמיחה-קידום הסוכן הסברתי מנוהל 2x בשבוע כדי לשפר את התפשטות התא במהלך שלב הקידום, המוביל להתפתחות של הפפילומה בעור. בעלי חיים הם הקריבו לאחר תגובת הפפילומה מגיע לרמה, בדרך כלל בתוך שבועות 15 – 20, בהתאם לרקע הגנטי של העכברים. חלק קטן של הפפילומה יכול עוד להתפתח SCCs בתוך 20 – 50 שבועות. כדי ללמוד אירועים מוקדמים בטקס החניכה ובשלב הקידום המוקדם, ניתן לאסוף דגימות (למשל, זמן קצר לאחר הסברתי השני). צילום מייצג והמטאוקסילין וחתך אאוזין ויטראז ‘ של הפפילומה על העור C57BL/6 לאחר 19 שבועות של טיפול מוצגים. סרגל קנה מידה = 0.1 מ”מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן אושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים הלאומית של פינלנד (פרוטוקול מספר Eסאווי/23659/2018). 1. ניסויים בבעלי חיים, ריאגנטים וציוד להשתמש בגיל ועכברים מתאימים למין. התחל את המחקר בגיל 7 עד 9 שבועות, כי העור ברוב העכברים הוא בתוך הזמן (שלב המנוחה) סביב גיל<sup class…

Representative Results

התוצאה העיקרית היא ההישרדות (כלומר, הפפילומה החופשי) הזמן בין קבוצות הטיפול או הגנוטיפ. התוצאה המשנית היא מספר הפפילומה בשבוע בכל קבוצה (איור 2). התוצאות הצפויות הן הבדל משמעותי מבחינה סטטיסטית בזמן הפפילומה החופשי ובמספר הפפילומה בין קבוצות הניסוי (שתיים או יותר). מומלץ לס?…

Discussion

DMBA-הסברתי-סרטן העור המושרה הוא אחד הדגמים הנפוצים ביותר של סרטן, כי הוא מאוד מאפשר ומספק מידע על התקדמות הגידול מפני חניכה ממאירות. מדידת תוצאת המפתח, היווצרות הפפילומה, היא בקלות ובאמינות כמותית. המודל מטפל הן בייזום הגידול (הישרדות ללא גידול) והתקדמות (מספרי גידול וגדלים) בו זמנית. המודל מ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה הזאת ממומנת על ידי האקדמיה של פינלנד (מענקים 25013080481 ו 25013142041 (I.J.), 286377 ו 295814 (שוטרים), 287907 (טי ג’יי), פדאימיקי וקרן סקארי Sohlberg (שוטרים, טי-ג’יי), הקרן הרפואית הפינית (ט), מחקר המדינה התחרותית מימון של התחום אחריות מומחה של אוניברסיטת טמפרה החולים (הענקת 9V049 ו 9V049 (מוסמך), 9V049 ו 9V049 (טי ג’יי), מימון מחקר המדינה תחרותי של שטח אחריות מומחה של מעבדות Fimlab (גרנט X51409 (I.J.)), Tays הקרן לתמיכה (I.J., הבסיס, טי-ג’יי), קרן שחפת טמפרה (I.J., בסיס, טי-ג’יי), קרן התרבות הפינית (M.V.), קרן פאולו (ט), אגודת הסרטן של פינלנד (בסיס), וקרן אמיל אלטונין (ט).

Materials

1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill	Starlab	S1182-1730-C
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill	Starlab	S1180-9710-C
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)	Sigma	D3254-100MG	Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.
Acetone	Sigma	1000141011	Evaporates rapidly and is inflammable.
Attane vet 1000 mg/g	Piramal Critical Care Limited		Liquid isoflurane for inhalation
Battery-Operated Clipper Isis	Albert Kerlb GmbH	GT421	For shaving the fur
CONTRAfluran-Restgasfilter	ZeoSys GmbH		For anesthesia
Linex Nature N1030 Ruler 30 cm	Staples Business Advantage	60383	For measuring papillomas
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm – Red	VetTech Solutions Ltd	AN045AR	For sacrifice
Mekasoft	Mekalasi	23008	Table cover
Mice (Balb/c JRj)	Janvier labs		Other strains also possible
Mice (C57BL/6JRj)	Janvier labs		Other strains also possible
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera	Panasonic
Paraformaldehyde	Merck	30525-89-4	For histology samples
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)	Enzo	BML-PE160-0001
Precision balance PLJ-C/PLJ-G	KERN & SOHN GmbH	PLJ 600-3CM
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing	VetTech Solutions Ltd	AN044BX	For sacrifice
RNAlater	Qiagen	76104	For nucleic acid samples
Tacta pipette 100-1000 ul	Sartorius	LH-729070
Tacta pipette 20-200 ul	Sartorius	LH-729060
UNO Anaesthetic Key Filler	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO Face Mask for Mouse	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO FM2200 Flowmeter	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO Gas Exhaust Unit	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO Induction Box	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia
UNO200VAP Vaporizer	Scintica instrumentation inc.		For anesthesia

References

DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, 400-409 (2015).
Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
Day, C. -. P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Vähätupa, M., Pemmari, T., Junttila, I., Pesu, M., Järvinen, T. A. Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA). J. Vis. Exp. (154), e60445, doi:10.3791/60445 (2019).