Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Chemisch-geïnduceerde huid carcinogenese model met behulp van Dimethylbenz [a] anthraceen en 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetaat (DMBA-TPA)

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60445
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,2, 1
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University and Tampere University Hospital, 2Department of Clinical Microbiology, Fimlab Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

Tweetraps huid carcinogenese wordt geïnduceerd door twee topisch toegepaste chemicaliën. Een mutagene stof 7, 12-dimethylbenz [a] anthraceen) veroorzaakt mutaties in de epidermale cellen en een continue toepassing van de algemene groeistimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetaat versnelt de vorming van papillomavirus.

Abstract

Kanker is een van de meest verwoestende menselijke ziekten. Experimentele kanker modellen zijn belangrijk om inzicht te krijgen in het complexe samenspel van verschillende celtypen en genen in het bevorderen van tumorprogressie en om een platform te bieden voor het testen van de werkzaamheid van verschillende therapeutische benaderingen. Een van de meest gebruikte experimentele inflammatoire kanker modellen is de DMBA-TPA tweetraps huid carcinogenese model. Tumor vorming wordt in dit model geïnduceerd door de actuele toepassing van twee verschillende chemicaliën, 7, 12-dimethylbenz [a] antraceen (DMBA) en 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetaat (TPA), die samen de papillomavirus vorming in de huid veroorzaken. Omdat het primaire resultaat papillomavirus-vorming in de huid is, is het model een ideale, betrouwbare en reproduceerbaar manier om beide tumor initiatie (tumor vrije overleving) en tumorprogressie (aantal en grootte van zichtbare tumoren) aan te pakken. De effecten van de DMBA-TPA-behandeling worden overgebracht via een ontstekingsmechanisme, waardoor dit model vooral geschikt is om de rol van het immuunsysteem bij tumorvorming te bestuderen. Dit model is echter beperkt tot de huid en andere oppervlakken waar de chemicaliën kunnen worden aangebracht. In dit artikel vindt u een gedetailleerd protocol om het model te kunnen gebruiken.

Introduction

Kanker is een van de belangrijkste doodsoorzaken in de wereld. Daarom is er een eis om betrouwbare experimentele ziekte modellen te ontwikkelen om een beter begrip van de ziekte te verkrijgen en om mogelijke therapeutische benaderingen te onderzoeken. Een van de meest gebruikte experimentele in vivo modellen om de ontwikkeling van huidkanker te bestuderen is de chemisch geïnduceerde tweetraps huid carcinogenese model1,2. Het model biedt een hulpmiddel om tumor initiatie, promotie en progressie te bestuderen naast specifieke gebeurtenissen zoals immuuncelinfiltratie en angiogenese.

Om het tweetraps huid carcinogenese model te gebruiken, wordt de rughuid van muizen behandeld met twee verschillende chemicaliën die samen tumorvorming induceren. Het model wordt geïnitieerd met een lage dosis van de mutagene stof, DMBA, gevolgd door langdurige blootstelling aan de tumor promotor, TPA3 (Figuur 1). Dmba muteert DNA willekeurig door covalente adducten te vormen met het DNA van epidermale cellen en primaire Keratinocyt stamcellen4,5,6,7. Sommige van deze willekeurige mutaties vinden plaats in een proto-oncogen, zoals Hras1 (mutaties in kras en Nri's worden ook gedetecteerd) en de omzetting van proto-oncogenen naar oncogenen stimuleert de tumorvorming onder de juiste stimuli. TPA, op zijn beurt, is de meest gebruikte tumor groeibevorderende agent. Het moleculaire doelwit is proteïne kinase C (PKC)8. TPA activeert ook WNT/β-bovenbouw in signalering die cruciaal is voor tumorvorming in model9. Herhaalde en langdurige blootstelling aan de bevorderend middel leidt tot verbeterde celsigna lering, verhoogde productie van groeifactoren, en een lokale ontstekingsreactie, die duidelijk zijn als gevolg van verhoogde DNA-synthese en inflammatoire celinfiltratie in de behandelde huid.

De belangrijkste ontstekingsmediatoren in het DMBA-TPA-model zijn geïdentificeerd10. Interleukine-17a (Il-17a) is bekend dat het bijzonder tumorigene in de dmba-TPA model11,12. Het werkt in synergie met Interleukine 6 (Il-6) en participeert in macrofaag en neutrofiele recruitment13,14. Daarnaast is aangetoond dat CD4+ T-cellen en neutrofielen tumorigene zijn in het dmba-TPA-model. Tot slot, macrofagen kunnen ook bevorderen tumorvorming in het model15,16,17.

Tijdens de promotie fase wordt de celproliferatie van de gemuleerde cellen versterkt en wordt een aanhoudende hyperplasie van de epidermis gehandhaafd1. Dit leidt tot de ontwikkeling van papillomavirus in de huid in 10 – 20 weken, waarna de papillomas beginnen te converteren naar kwaadaardige tumoren, plaveiselcel carcinomen (SCCs)2. Echter, minder dan 10% van de papillomas vooruitgang naar maligniteit, hoewel dit percentage ook afhangt van de genetische achtergrond van de muizen2,18. Decennia lang was het niet bekend wat voor soort cellen werden aanvankelijk gemuleerd in de tumoren leidt tot maligniteit, hoewel sommige studies duidelijk onderscheiden kenmerken in de kwaadaardige tumoren had gemeld in vergelijking met goedaardige papillomas19,20. Echter, recente studies hebben sterk toegenomen ons begrip op de klonale oorsprong van tumorvorming in de DMBA-TPA model21. 22. 23. aangetoond is dat zowel epitheliale cellen als haarfollikel stamcellen in het beenmerg bijdragen aan de tumorvorming22. Stage-specifieke Lineage tracing studies hebben onthuld dat goedaardige papillomas van monoklonale oorsprong zijn, maar ze rekruteren nieuwe epitheliale celpopulaties21,23. Echter, slechts één van de cel klonen fungeert als een driver voor carcinogenese; het bevat een Hras-mutatie23. De progressie naar carcinoom vorming wordt geassocieerd met een van klonen sweep23.

De kankerverwekkende stof DMBA initieert de papillomavirus-formatie en TPA bevordert de tumorgroei. Vandaar, de tumor initiatie kan afzonderlijk worden bestudeerd van de promotie door het onderbreken van het experiment voor de TPA behandelingsperiode. Als de tumorprogressie wekelijks wordt bestudeerd biedt het een grote kans voor gedetailleerde tumorgroei analyse gedurende de studie. Omdat de tumoren worden gegenereerd door externe chemicaliën, is een oncogene mutatie in de kiembaan overbodig. Het bestuderen van de effecten van een genetische achtergrond (bijv. Knockout/transgene vs. wild type) op tumorvorming is dus rechtlijnig2. Kortom, de DMBA/TPA huidkanker model is een bijzonder nuttige aanpak voor het bestuderen van de rol van het immuunsysteem in de progressie van de tumor, alsmede voor de evaluatie van de inleiding van de tumor en promotie stappen onafhankelijk of onderling afhankelijk.

Figure 1
Figuur 1: DMBA-TPA-geïnduceerde huid carcinogenese modeloverzicht. De kankerverwekkende stof DMBA wordt topisch toegepast om DNA-mutaties in de initiatie fase van het model te induceren. De groeibevorderende agent TPA wordt 2 x per week toegediend om de celproliferatie tijdens de promotie fase te verbeteren, wat leidt tot de ontwikkeling van papillomas in de huid. Dieren worden geofferd nadat de papillomavirus-reactie een plateau bereikt, meestal binnen weken 15 – 20, afhankelijk van de genetische achtergrond van de muizen. Een klein deel van de papillomas kan binnen 20 – 50 weken verder uitgroeien tot Scc's. Voor het bestuderen van vroege gebeurtenissen in de initiatie-en vroege promotie fase kunnen monsters worden verzameld (bijvoorbeeld kort na de tweede TPA-toepassing). Een representatieve foto en hematoxyline en eosine gekleurd doorsnede van papillomas op een C57BL/6 muis huid na 19 weken behandeling worden getoond. Schaalbalk = 0,1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het hier beschreven protocol is goedgekeurd door de nationale Commissie voor dierenethiek van Finland (protocolnummer ESAVI/23659/2018).

1. proefdieren, reagentia en apparatuur

  1. Gebruik leeftijd en seks-gematchte muizen. Start de studie met een leeftijd van 7 – 9 weken, omdat de huid in de meeste muizen zich in telogene bevindt (de rustfase) rond die leeftijd2.
  2. Observeer het gedrag van de dieren tijdens de studie en als ze vechten, wat vaak gebeurt met mannen, huis ze apart. Gevechten kunnen snijden in de huid veroorzaken, die tumorvorming bevorderen. Vrouwelijke muizen hebben de voorkeur vanwege hun minder agressief gedrag. De typische experimentele groepsgrootte varieert tussen de 8 – 20 dieren per groep24,25,26,27.
    Opmerking: vermogens berekeningen op basis van de biologische variantie in eerdere studies helpen bij het kiezen van een voldoende grote groepsgrootte. De stammen die worden gebruikt als voorbeelden in dit artikel zijn Balb/c en C57BL/6. Echter, veel andere muis stammen zoals sencar en FVB zijn gebruikt met de dmba-TPA-model, evenals Wistar en Sprague-Dawley ratten2,28,29. Een licentie van het nationale of lokale Comité van dierlijke werk is nodig voor de inleiding van de studie. Naast algemene welzijnsoverwegingen zijn de modelspecifieke eindpunten meestal plaveiselcelcarcinoom (SCC) en een infectie van de huid. Krassen in de huid als gevolg van jeuk na het aanbrengen van de tumorigene chemicaliën in aceton is typerend, maar anders moeten de dieren geen tekenen van ongemak vertonen. Regelmatig wegen (bijvoorbeeld 2x per maand) helpt bij het evalueren van het welzijn van de dieren.
  3. Gebruik de DMBA en TPA, beide verdund in aceton. De werkconcentratie van DMBA is 250 g/L. Een dosis voor één dier is 50 μg DMBA in 200 μL aceton. De stam concentratie van TPA is 125 g/L en de behandelings concentratie 25 g/L. Een TPA-dosis voor één dier is 5 μg in 200 μL aceton.
    Letop: dmba is schadelijk bij inslikken en kan kanker veroorzaken. Aceton verdampt snel en is ontvlambaar. Het kan leiden tot duizeligheid en irriteren ogen. Gebruik een ademhalingsmasker en/of werk onder een vacuüm stroom. Verander handschoenen na het hanteren van een van deze chemicaliën. Kooien voor individueel geventileerde voorkomen de verspreiding van de chemicaliën tijdens de behuizing van de muizen. Verzamel na het aanbrengen de pipetpunten die worden gebruikt voor het hanteren van de DMBA en gooi deze weg als gevaarlijk afval.
    Opmerking: de dmba moet beschermd zijn tegen licht. De verdunde TPA wordt bewaard in-20 °C, bij voorkeur beschermd tegen licht.
  4. Aanschaffen van de volgende apparatuur: een schaal, een gewone scheerapparaat voor de vacht, pipetten en tips van een geschikte grootte, een gewone liniaal, een digitale camera, een Kladblok en een pen of een computer voor het opnemen van de papillomas, een geïnhaleerd anesthesie systeem of een muis fixator met een opening op de achterkant, en een kooldioxide-narcotische systeem voor het opofferen van muizen.

2. huid papilloma inductie en promotie

  1. Scheer de achterste huid en weeg het dier. Later, Scheer de huid wanneer nodig, maar niet op het moment van de chemische blootstelling.
    Letop: Wees voorzichtig bij het scheren rond de papillomas en Vermijd het maken van bezuinigingen op de huid. Weeg elk dier elke 2 weken om eventuele gewichtsverlies op te merken.
  2. Breng 50 μg DMBA in 200 μL aceton topisch op het geschoren gebied aan met behulp van een pipet 48 h na het scheren van de vacht. Indien nodig, bedwingen het dier met behulp van lichte inhalatie anesthesie of een muis fixator.
  3. Na 7 dagen, geef de eerste dosis TPA. Breng 5 μg TPA aan in 200 μL aceton topisch met een pipet 2x per week, bij voorkeur maandag en donderdag of dinsdag en vrijdag.
  4. Tellen, opnemen en fotograferen van de papillomas elke week. Een palpabele massa groter dan 1 mm in diameter wordt als een papillomavirus beschouwd als het langer dan 1 week blijft. Markeer elke afzonderlijke papillomavirus op een kaart en vermeld de grootte wekelijks. Bewaar digitale foto's.

3. dieren offer en Monsterverzameling

  1. Ga door met de behandeling totdat de tumor reactie een plateau bereikt. Over het algemeen zal de papillomavirus-last naar verwachting 10 – 20 weken na de initiatie toenemen, afhankelijk van de gebruikte muis stam. Het plateau wordt verwacht in 15 – 20 weken. Een klein deel van de papillomas (onder 3%) kan zich ontwikkelen tot Scc's binnen 20 – 50 weken2.
  2. Offer de dieren 24 h na de laatste TPA-toepassing. Gebruik kooldioxide-narcose met cervicale dislocatie of een andere geschikte methode.
  3. Afhankelijk van de onderzoeksvraag, verzamelen van de juiste monster materiaal van de dieren30,31.
    1. Neem bijvoorbeeld bloedmonsters voor het opofferen en scheid het plasma.
    2. Snij stukjes van de huid voor de kleuring van immunohistochemie (IHC) (bijv. hematoxyline en eosine, prolifererende of inflammatoire cellen).
    3. Gebruik biopsie stoten om huid stukjes te verzamelen met papillomavirus weefsel of niet-papillomavirus (behandelde) huid voor genexpressie (bijv. qPCR) en/of eiwit analyses (bijv. Western Blot of ELISA).
    4. Verzamel een stukje van de milt en huid-afvoerende lymfeklieren voor Flowcytometrie analyse als meer gedetailleerde analyse van de immuuncelpopulaties gewenst is. U ook de epidermale en dermale lagen scheiden voor verdere analyses.

4. statistieken

  1. Teken een Kaplan-Meier-overlevings curve van de papilloom vrije tijd en gebruik de mantel-Cox log-Rank test voor de overleving. Teken een lineaire curve van het aantal papillomas per week. Omdat dit aantal gegevens is, gebruikt u een niet-lineaire regressiemodel. Raadpleeg indien nodig een statisticus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het belangrijkste resultaat is de overleving (d.w.z. papillomavirus vrije) tijd tussen de behandelings-of genotype groepen. Het secundaire resultaat is het aantal papillomas per week in elke groep (Figuur 2). De verwachte resultaten zijn een statistisch significant verschil in het papillomavirus vrije tijd en in het aantal papillomen tussen de experimentele (twee of meer) groepen. Het wordt aanbevolen om het aantal papillomas te tellen en een curve te tekenen tijdens de promotie fase (TPA) om een idee te krijgen van de verschillen tussen de groepen in dat stadium. Het experiment te vroeg beëindigen kan een statistisch significant verschil verbergen.

Figure 2
Figuur 2: de belangrijkste uitkomsten van het DMBA-TPA-geïnduceerde huid carcinogenese model. Representatieve afbeeldingen van papillomas op de muis huid en de twee belangrijkste uitkomsten. Gegevens werden gecombineerd uit vier afzonderlijke experimenten. Opmerking: experimenten met Balb/C-en C57BL/6-muizen werden afzonderlijk uitgevoerd. A ) een overlevings plot van het papillomavirus vrije tijd. Onderbroken lijn = Balb/c en ononderbroken lijn = C57BL/6. (B) het gemiddelde aantal papillomas per muis. Onderbroken lijn = Balb/c en ononderbroken lijn = C57BL/6. Foutbalken = SEM. (C) een Balb/C-muis met papillomas na 11 weken na behandeling met dmba. (D) een C57BL/6-muis met papillomen na 11 weken na behandeling met dmba. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Histologie, mRNA, en cellulaire en eiwitanalyse kan worden uitgevoerd om te verkennen van de mechanismen die onderliggende zijn van de waargenomen verschillen. Histologische analyses zijn bijvoorbeeld geschikt voor het bestuderen van de structuur van de papillomen, morfologie van de huid (epidermale en dermale dikte), verschillende biologische processen (proliferatie, apoptosis, angiogenese) of de infiltratie van immuuncellen32 (Figuur 3). De huid is ideaal voor een betrouwbare kwantificering van morfologische en IHC-parameters door state-of-Art beeldanalyse systemen30,31,32,33. Gen-en eiwit uitdrukkingen uit de (papilloma) huid monsters kunnen eenvoudig worden bestudeerd met standaardmethoden30. Flow cytometrie is een nuttig hulpmiddel voor de analyse van verschillende immuuncelpopulaties van de milt en huid-drainerende lymfeklieren, zoals eerder beschreven30. De keuze van de analytische methoden is afhankelijk van de onderzoeksvraag en moet worden overwogen voordat het experiment wordt gestart.

Figure 3
Figuur 3: histologische analyse van inflammatoire celinfiltratie in het DMBA-TPA-model. Representatieve histologische dwarsdoorsneden van PFA-vaste paraffine-ingesloten huid in het DMBA-TPA-model. Huid secties werden gekleurd met een macrofaag marker F4/80 (bruin). Schaal staven = 200 μm. (a) slechts een paar F4/80 positieve macrofagen werden gezien in de normale, onbehandelde huid. B) macrofaag infiltratie in de dermis bleek in het beginstadium van de kanker promotie, na 2 weken en 36 uur na de tweede toediening van TPA. Ook werd epidermale hyperproliferatie gezien na 2 weken, zoals blijkt uit de verdikking van de epidermis. (C) de huid van niet-papilloma na 19 weken toonde nog steeds een opmerkelijke infiltratie van macrofagen. D) een sterke accumulatie van macrofagen werd gezien onder papillomen in de dermis van de met dmba-TPA behandelde dieren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DMBA-TPA-geïnduceerde huidkanker is een van de meest gebruikte kanker modellen omdat het zeer reproduceerbaar is en informatie verschaft over de progressie van de tumor van initiatie tot maligniteit. De belangrijkste uitkomst maatregel, de vorming van papillomavirus, is eenvoudig en betrouwbaar kwantitatief. Het model behandelt beide tumor initiatie (tumor-vrije overleving) en progressie (tumor aantallen en-maten) tegelijkertijd. Het model is geschikt voor het bestuderen van verschillende verbindingen, zoals potentiële therapieën, en de effecten van individuele genen op de progressie van de tumor bij genetisch gemodificeerde dieren. Bij het toepassen van het model voor een bepaalde stam, is het raadzaam om de bestaande literatuur te bestuderen om een idee te krijgen van hoe de stam reageert in het model (bijv. om erachter te komen hoe snel de eerste papillomen zullen verschijnen). Bij het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen wordt het gebruik van wild type littermates altijd aanbevolen. Het gebruik van mogelijke extra controles, zoals het vervangen van ofwel DMBA of TPA of beide door aceton, is zeer discable, omdat bekend is dat het verwijderen van DMBA of TPA of het omkeren van hun toedienings volgorde hoogst onwaarschijnlijk zal resulteren in de inductie van papillomavirus groei34. Wanneer het essentieel is om tumor initiatie te bestuderen (d.w.z. door toediening van DMBA alleen), kan het worden bereikt door de dieren op te offeren na de DMBA-dosis. Bij het bestuderen van het effect van een individueel gen in een transgene of Knockout-instelling, wordt aanbevolen om monsters te nemen van onbehandelde dieren om mogelijke verschillen op te sporen die vóór de tumorvorming tussen genetisch gemanipuleerde en wild type stammen30,31kunnen bestaan.

Hoewel het DMBA-TPA-model relatief eenvoudig is om technisch te handelen, is nauwkeurige timing essentieel voor succes. De toepassing van DMBA en de reguliere toepassing van TPA zijn beide cruciaal voor de tumor ontwikkeling34. Een zorgvuldige wekelijkse onderzoek van de papillomas is essentieel om alle gegevens te verzamelen. Opgemerkt moet worden dat bepaalde behandelingen of genetische achtergronden papillomas kunnen veroorzaken om te groeien en later te krimpen of zelfs verdwijnen30. Soms ontstaan er andere niet-kankerachtige laesies en Scc's. In dit geval wordt histologisch onderzoek van de laesie aanbevolen. Een andere belangrijke stap is ervoor te zorgen dat TPA de enige tumor promotor is. Huid trauma induceert de productie van cytokines die van invloed kunnen zijn op de tumor promotie2,34. Zo moet de iatrogene verwonding van de huid tijdens het scheren worden vermeden en moeten agressieve, vecht muizen afzonderlijk worden ondergebracht. Naast de gevechten zijn ook andere aspecten van dierenwelzijn belangrijk. Gewichtsverlies, DOF en verwarde vacht, en apathetisch gedrag zijn tekenen van ongemak. Het ongemak is niet alleen een ethische kwestie, omdat negatieve energiebalans remt de tumorgroei34.

Het DMBA-TPA-model biedt een mogelijkheid voor vele modificaties. Omdat sommige stammen bekend zijn gevoeliger dan anderen, een zorgvuldige selectie maakt het plannen van het experiment en het aanpassen van de hoeveelheid en de frequentie van TPA toepassing18,35. Het model wordt voornamelijk gebruikt voor het ontwikkelen van Huidtumoren, maar lokale toepassing op het maagdarmkanaal is een optie36. Bovendien, een gemodificeerde versie van het model is gebruikt voor het bestuderen van de ontwikkeling van de tumor in de luchtpijp37. Omdat de ontwikkeling van de tumor kan worden gereguleerd met DMBA en TPA toepassingen, het model maakt het bestuderen van de uitkomsten na het wijzigen van milieuaspecten zoals dieet en circadiane ritme38. Door het scheiden van tumor initiatie (DMBA) en promotie (TPA), het model maakt het bestuderen van deze twee processen onafhankelijk. Bijvoorbeeld, het opofferen van de muizen na de dmba behandeling toelaat het bestuderen van het mechanisme van de behandeling of het effect van een gen van belang in tumor initiatie2,34. Om de vroege gebeurtenissen in de tumor initiatie en promotie te bestuderen, kunnen dieren op een vroeg tijdstip worden geofferd. Bijvoorbeeld, monsters kunnen worden verzameld kort na de tweede TPA administratie (bijvoorbeeld 3 h, 12 h, 36 h, of 48 h na)30,31. Het is ook vermeldenswaard dat het klassieke DMBA-TPA tweetraps carcinogenese model kan worden gewijzigd met behulp van verschillende chemicaliën of met behulp van de "derde" chemische stof. Deze worden beoordeeld door Abel et al2.

Het DMBA-TPA-model is al decennia lang gebruikt voor verschillende doeleinden34. Het is gebruikt voor het bestuderen van de effecten van verschillendeTherapeutics 24,25,26 en genen31,32,39,40 maar ook voor het bestuderen van voeding27, het circadiane ritme38, en de ontwikkeling van diagnostische hulpmiddelen41. Als de tumoren vormen van de huid, het model biedt een unieke kans om tumorweefsel monsters verzamelen in verschillende stadia van de progressie21. Bij de introductie van nieuwe chemopreventive agents of immunomodulatoren, is het raadzaam om eerst gegevens te verzamelen over hoe de stam heeft gereageerd in het DMBA-TPA-model in eerdere studies. Indien niet beschikbaar, een voor studie zonder de potentiële therapeutische agent wordt aanbevolen om te bepalen van de timing en het aantal papillomas, evenals de variantie in deze parameters. Bestaande gegevens uit gepubliceerde studies kunnen ook helpen bij het bepalen van de dosering van de geteste stof24,27, maar indien niet beschikbaar, met behulp van een seriële verdunning van de geteste verbinding maakt het evalueren van de dosisrespons van de agent onderzocht25,26.

Ontsteking is essentieel voor menselijke tumorigenese, als het is betrokken bij alle fasen van tumorprogressie: de initiatie, de promotie, en de conversie naar maligniteit42,43. De chemisch geïnduceerde huid carcinogenese model is een ontsteking-gedreven carcinogenese model. Pro-inflammatoire cytokine respons en de infiltratie van ontstekingscellen naar de behandelde huid zijn al duidelijk in de vroege fase van het model. De eerste infiltrerende cellen zijn neutrofielen, gevolgd door accumulatie van macrofagen, T-cellen, etc.30,31. Deze cellen creëren een inflammatoire micro-omgeving in de huid, en een crosstalk tussen inflammatoire en epidermale cellen wordt geïnitieerd, wat leidt tot de productie van cytokines, chemokines, en prostaglandinen die de tumor initiatie en groei lokaal rijden. Omdat het DMBA-TPA-model een ontstekingsgedreven model is, bevat het geen enkele andere aspecten van klinische kanker. Hoewel het bekend is dat de scc's uiteindelijk metastasen in het dmba-TPA-model kunnen veroorzaken, ontwikkelen slechts een klein deel van de papillomen zich in SCCS2,23. Bijgevolg is metastase een zeldzaam kenmerk in het DMBA-TPA-model, hoewel sommige gevoelige uitgefokte voorraden zoals CD-1 of SENCAR een toegenomen kans hebben op het ontwikkelen van metastase44. Het uiterlijk van SCC wordt vaak beschouwd als een dierenwelzijns kwestie en dus als een eindpunt criterium. Daarom, ondanks het bestaan van metastase in het model, zijn sommige andere modellen zoals transplantatie of genetisch gemanipuleerde modellen meer geschikt voor het bestuderen van metastase45. Een andere beperking van het model is dat het een oppervlak vereist om de chemicaliën toe te passen. Zo is het bestuderen van de progressie van kanker in een specifiek intern orgaan buiten de reikwijdte van het model.

Een ander veelvoorkomend huidkanker model is het UV-straling model46. Het model is vergelijkbaar met het DMBA-TPA-model omdat geen van beide modellen celtransplantatie of genetische modificatie nodig heeft om kanker te veroorzaken. Het fundamentele verschil tussen de modellen is dat het UV-straling model agressieve SSC-vorming induceert, terwijl de tumor uitkomst in het DMBA-TPA-model over het algemeen goedaardige papillomas is. Als UV-straling wordt gecombineerd met de toepassing van chemische carcinogenen of in muis stammen met een genetische achtergrond die de stam vatbaar maakt voor de ontwikkeling van kanker, kan zelfs melanoom vorming plaatsvinden. De meest voorkomende mutaties in het UV-straling model inactiveren het p53-gen, een cruciaal tumor suppressor-gen bij mensen46, terwijl de meest voorkomende mutaties in het DMBA-TPA-model het hras-Gene23activeren. De UV-straling veroorzaakt ook immunosuppressie46,47, wat een verstorende factor kan zijn bij het bestuderen van de aspecten van het immuunsysteem. Deze twee modellen werken echter ook in combinatie. UV-straling kan worden gebruikt als een bevorderend middel met DMBA of als initiërende agent met TPA46.

Een redelijke vraag is of het DMBA-TPA-model menselijke kanker nabootst. Een klein deel van de papillomen ontwikkelt naar SCCs. Niettemin, de Premaligne stadium van menselijke SCC is actinische keratose, en het verschilt van de papillomavirus formatie gezien in het model. Toch wordt papillomavirus-vorming vergelijkbaar met het model gedetecteerd bij mensen die behandeld zijn voor melanoom met vemurafenib. Dit suggereert dat de door Hras gemuleerde stamcellen die essentieel zijn voor carcinogenese in het DMBA-TPA-model ook bestaan op de menselijke huid34. Bovendien wordt gemeld dat de opname van 2-deoxy-2-[18f]-fluoro-D-glucose (18f-FDG) papillomas en microinvasieve scc's hoger is dan in de omringende huid, maar niet zo hoog als in een volledig invasief SCC, die de gelijkenis van de Premaligne stadia41weerspiegelt. Als u het DMBA-TPA-model voor toxiciteits evaluatie gebruikt, moet men niet vergeten dat de herhaling van de blootstelling een groot effect heeft op de tumor promotie34. Ten minste enkele van de moleculaire mechanismen zijn gebruikelijk voor het model en de menselijke huid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland (subsidies 25013080481 en 25013142041 (I.J.), 286377 en 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), Päivikki en Sakari Sohlberg Foundation (M.P., T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), het competitieve State Research Financiering van het gebied van de deskundige verantwoordelijkheid van het universitair ziekenhuis van Tampere (Grant 9V049 en 9X044 (M.P.), 9X011 en 9V010 (T.J.)), de competitieve staats onderzoeksfinanciering van het deskundige verantwoordelijkheidsgebied van Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), tays Support Foundation (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosefonds (I.J., M.P., T.J.), de Finse culturele stichting (M.V.), de Paulo Foundation (T.P.), kanker Sociëteit van Finland (M.P.), en de Emil Aaltonen Foundation (T.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill Starlab S1182-1730-C
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill Starlab S1180-9710-C
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) Sigma D3254-100MG Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.
Acetone Sigma 1000141011 Evaporates rapidly and is inflammable.
Attane vet 1000 mg/g Piramal Critical Care Limited Liquid isoflurane for inhalation
Battery-Operated Clipper Isis Albert Kerlb GmbH GT421 For shaving the fur
CONTRAfluran-Restgasfilter ZeoSys GmbH For anesthesia
Linex Nature N1030 Ruler 30 cm Staples Business Advantage 60383 For measuring papillomas
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red VetTech Solutions Ltd AN045AR For sacrifice
Mekasoft Mekalasi 23008 Table cover
Mice (Balb/c JRj) Janvier labs Other strains also possible
Mice (C57BL/6JRj) Janvier labs Other strains also possible
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera Panasonic
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 For histology samples
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) Enzo BML-PE160-0001
Precision balance PLJ-C/PLJ-G KERN & SOHN GmbH PLJ 600-3CM
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing VetTech Solutions Ltd AN044BX For sacrifice
RNAlater Qiagen 76104 For nucleic acid samples
Tacta pipette 100-1000 ul Sartorius LH-729070
Tacta pipette 20-200 ul Sartorius LH-729060
UNO Anaesthetic Key Filler Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Face Mask for Mouse Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO FM2200 Flowmeter Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Gas Exhaust Unit Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Induction Box Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO200VAP Vaporizer Scintica instrumentation inc. For anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
  2. Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
  3. Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
  4. Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
  5. Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
  6. Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
  7. Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
  8. Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
  9. Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
  10. Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
  11. Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
  12. He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
  13. Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
  14. Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
  16. Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
  17. Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
  18. Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
  19. Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
  20. Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
  21. Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
  22. Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
  23. Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
  24. Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, Philadelphia Pa. 400-409 (2015).
  25. Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
  26. Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
  27. Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
  28. Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
  29. Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
  30. Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
  31. May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
  32. Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
  33. Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
  34. Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
  35. Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
  36. Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
  37. Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
  38. Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
  39. Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
  40. Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
  41. Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
  42. Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
  43. Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
  44. Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
  45. Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  46. Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
  47. Day, C. -P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).

Tags

Kankeronderzoek probleem 154 huidkanker chemische carcinogenese mutageen promotor DMBA-TPA papilloma angiogenese ontsteking tumor proliferatie
Chemisch-geïnduceerde huid carcinogenese model met behulp van Dimethylbenz [a] anthraceen en 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetaat (DMBA-TPA)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M., Pemmari, T., … More

Vähätupa, M., Pemmari, T., Junttila, I., Pesu, M., Järvinen, T. A. H. Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA). J. Vis. Exp. (154), e60445, doi:10.3791/60445 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter