Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

نموذج سرطان الجلد المستحث بالمواد الكيميائية باستخدام ثنائي ميثيل بنز [a] انثراسين و 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-خلات (دمبا-طن سنويا)

Published: December 19, 2019 doi: 10.3791/60445
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,2, 1
1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University and Tampere University Hospital, 2Department of Clinical Microbiology, Fimlab Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

ويسبب سرطان الجلد مرحلتين من قبل اثنين من المواد الكيميائية التطبيقية موضعيا. الطفرات 7 ، 12-ديميثيلبنز [a] انثراسين) يسبب طفرات في خلايا البشرة والتطبيق المستمر لمشجع النمو العام 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-خلات يسرع تكوين الورم الحليمي الجلد.

Abstract

السرطان هو واحد من الامراض البشرية الأكثر تدميرا. نماذج السرطان التجريبية مهمة للحصول علي نظره ثاقبه في التفاعل المعقد لأنواع الخلايا المختلفة والجينات في تعزيز تطور الورم وتوفير منصة لاختبار فعاليه النهج العلاجية المختلفة. واحده من الأكثر شيوعا النماذج السرطانية التهابيه التجريبية هو نموذج DMBA-طن سنويا سرطان الجلد مرحلتين. يتم الحث علي تشكيل الورم في هذا النموذج من قبل التطبيق الموضعي لاثنين من المواد الكيميائية المختلفة ، 7 ، 12-ديميثيلبنز [a] انثراسين (دمبا) و 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-خلات (طن سنويا) ، التي تسبب معا تشكيل الحليمات في الجلد. وبما ان النتيجة الاوليه هي تشكيل الورم الحليمي في الجلد ، فان النموذج هو طريقه مثاليه وموثوقه وقابله للتكرار لمعالجه كل من بدء الورم (بقاء الورم خاليا من الأورام) وتقدم الورم (عدد وحجم الأورام المرئية). وتنتقل اثار العلاج DMBA-طن سنويا عن طريق اليه التهابيه ، مما يجعل هذا النموذج مناسبه خاصه لدراسة دور الجهاز المناعي في تشكيل الورم. ومع ذلك ، يقتصر هذا النموذج علي الجلد والأسطح الأخرى حيث يمكن تطبيق المواد الكيميائية علي. يتم توفير بروتوكول مفصل في هذه المقالة لاستخدام النموذج بنجاح.

Introduction

السرطان هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في العالم. ولذلك ، هناك طلب لتطوير نماذج الامراض التجريبية الموثوقه للحصول علي فهم أفضل للمرض ، وكذلك لاستكشاف النهج العلاجية المحتملة. واحده من الأكثر استخداما التجريبية في نماذج فيفو لدراسة التنمية سرطان الجلد هو المستحثة كيميائيا الجلد مرحلتين السرطانية نموذج1,2. يوفر النموذج أداه لدراسة بدء الورم ، والترقية ، والتقدم بالاضافه إلى احداث محدده مثل تسلل الخلايا المناعية وتولد الاوعيه.

لاستخدام نموذج سرطان الجلد علي مرحلتين ، يتم التعامل مع الجلد الخلفي من الفئران مع اثنين من المواد الكيميائية المختلفة التي تحفز معا تشكيل الورم. ويبدا النموذج مع جرعه منخفضه من الطفرة ، DMBA ، تليها التعرض لفترات طويلة لمروج الورم ، طن سنويا3 (الشكل 1). Dmba المطاوع الحمض النووي عشوائيا عن طريق تشكيل القناات المختلطة مع الحمض النووي للخلايا البشرة والخلايا الجذعية الكيراتينيه الاوليه4,5,6,7. بعض من هذه الطفرات العشوائية تجري في الجينات بروتو ، مثل Hras1 (الطفرات في Kras و Nras يتم الكشف عنها أيضا) وتحويل الجينات بروتو إلى الجينات يدفع تشكيل الورم تحت المحفزات المناسبة. طن سنويا, في المقابل, هو الأكثر شيوعا الورم الأكثر استخداما عامل تعزيز النمو. هدفه جزيئيه بروتين [كيناز] [ك] ([بكك])8. كما ينشط طن سنويا Wnt/β-catenin الإشارات التي هي حاسمه لتشكيل الورم في النموذج9. التعرض المتكرر والمطول لعامل تعزيز يؤدي إلى تعزيز الإشارات الخلية ، وزيادة إنتاج عوامل النمو ، ورد فعل التهابي المحلية ، والتي هي واضحة بسبب زيادة تخليق الحمض النووي وتسلل الخلايا التهابيه في الجلد المعالج.

وقد تم تحديد الوسطاء التهابيه الرئيسية في نموذج DMBA-طن سنويا10. Interleukin-17a (آيل-17a) ومن المعروف ان التورم بشكل خاص في dmba-طن سنويا نموذج11,12. هو يعمل في تازر مع [اينترليوكين] 6 ([آيل-6]) ويساهم في [بلبلج] و [العدلات] تعيين13,14. الاضافه إلى ذلك ، وقد أظهرت الخلاياالتائية و العدلات ان تكون توتوريغينيك في نموذج DMBA-طن سنويا. أخيرا, الضامة يستطيع أيضا روجت [توتوريجينيسيس] في النموذج15,16,17.

خلال مرحله الترقية ، يتم تعزيز تكاثر الخلايا المتحولة ويتم الحفاظ علي فرط تنسج البشرة1. وهذا يؤدي إلى نمو الورم الحليمي في الجلد في 10 – 20 أسابيع ، وبعد ذلك تبدا الورم الحليمي لتحويل إلى الأورام الخبيثة ، سرطان الخلايا الحرشفية (SCCs)2. ومع ذلك, اقل من 10% من الورم الحليمي التقدم إلى الخبيثة, علي الرغم من ان هذه النسبة المئوية تعتمد أيضا علي الخلفية الوراثية للفئران2,18. علي مدي عقود لم يكن معروفا ما هو نوع من الخلايا في البداية تحور في الأورام التي تؤدي إلى خباثة ، علي الرغم من ان بعض الدراسات قد أبلغت عن ميزات واضحة متميزة في الأورام الخبيثة بالمقارنة مع الحليمات الحميدة19،20. ومع ذلك, وقد زادت الدراسات الاخيره إلى حد كبير فهمنا علي الأصل النسيلي من تشكيل الورم في dmba-طن سنويا نموذج21. 22-الآن 23. وقد ثبت ان كلا من الخلايا الظهاريه المستمدة من نخاع العظم والخلايا الجذعية بصيلات الشعر تسهم في تشكيل الورم22. وكشفت الدراسات المتعلقة بالسلالات الخاصة بمرحله محدده ان الحليمات الحميدة هي من أصل أحادي ، لكنها تجند السكان الجدد من الخلايا الظهاريه21،23. ومع ذلك ، واحد فقط من الخلايا المستنسخة يعمل كسائق للسرطان. انه يحتوي علي طفرة Hras23. ويرتبط التقدم لتشكيل سرطان مع اكتساح النسيلي23.

و DMBA مسرطنه يبدا تشكيل الورم الحليمي و طن سنويا يعزز نمو الورم. التالي ، يمكن دراسة بدء الورم بشكل منفصل عن الترقية عن طريق مقاطعه التجربة قبل فتره العلاج طن سنويا. كما يتم دراسة تطور الورم أسبوعيا فانه يوفر فرصه كبيره لتحليل مفصل نمو الورم في جميع انحاء الدراسة. لان الأورام يتم إنشاؤها بواسطة المواد الكيميائية الخارجية ، وطفرة اونكوغينيك في جرثومي غير ضروري. التالي ، فان دراسة اثار الخلفية الجينية (علي سبيل المثال ، الضربة القاضية/الجينات مقابل النوع البري) علي الأورام السرطانية هي مباشره2. وباختصار ، فان نموذج سرطان الجلد DMBA/طن سنويا هو نهج مفيد بشكل خاص لدراسة دور الجهاز المناعي في تطور الورم وكذلك لتقييم بدء الورم والخطوات الترويجية بشكل مستقل أو اينتردبندنتلي.

Figure 1
الشكل 1: DMBA-طن سنويا-الجلد الناجم عن نموذج سرطان المخطط التفصيلي. يتم تطبيق DMBA مسرطنه موضعيا للحث علي طفرات الحمض النووي في مرحله البدء من النموذج. يتم أداره النمو-تعزيز وكيل طن سنويا 2x في الأسبوع لتعزيز تكاثر الخلايا خلال مرحله الترقية ، مما يؤدي إلى تطوير الأورام الحليمة في الجلد. يتم التضحية بالماشية بعد ان تصل استجابه الورم الحليمي إلى هضبة ، عاده في غضون أسابيع 15 – 20 ، اعتمادا علي الخلفية الجينية للفئران. يمكن لنسبه صغيره من الورم الحليمي ان تتطور إلى SCCs في غضون 20 – 50 أسبوعا. لدراسة الاحداث المبكرة في مرحله البدء والترقية المبكرة ، يمكن جمع العينات (علي سبيل المثال ، بعد فتره وجيزة من تطبيق طن سنويا الثاني). صوره تمثيليه و هيوسين و ايزين المقطع العرضي الملون من الورم الحليمي علي جلد الماوس C57BL/6 بعد 19 أسابيع من العلاج تظهر. شريط مقياس = 0.1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة علي البروتوكول الموصوف هنا من قبل اللجنة الوطنية للأخلاقيات الحيوانية في فنلندا (البروتوكول رقم ESAVI/23659/2018).

1. التجريبية الحيوانية ، الكواشف ، والمعدات

  1. استخدام العمر والفئران المطابقة للجنس. بدء الدراسة في 7-9 أسابيع من العمر ، لان الجلد في معظم الفئران في تساقط (مرحله يستريح) حول هذا العمر2.
  2. راقبت التصرف من الماشية اثناء الدراسة وان هم يتنازعون, اي غالبا يحدث مع ذكران, منزلهم علي حده. المعارك قد تسبب الجروح في الجلد ، والتي تعزز تشكيل الورم. ويفضل الفئران الإناث نظرا لسلوكهم اقل عدوانيه. يختلف حجم المجموعة التجريبية النموذجية بين 8 – 20 الحيوانية للمجموعة24,25,26,27.
    ملاحظه: تساعد حسابات الطاقة استنادا إلى التباين البيولوجي الذي يظهر في الدراسات السابقة علي اختيار حجم مجموعه كبيره بما فيه الكفاية. وتشمل السلالات المستخدمة كامثله في هذه المقالة Balb/c و C57BL/6. ومع ذلك, وقد استخدمت العديد من سلالات الماوس الأخرى مثل sencar و fvb مع dmba-طن سنويا-نموذج, فضلا عن wistar و sprague-dawley الفئران2,28,29. وهناك حاجه إلى ترخيص من اللجنة الوطنية أو المحلية للعمل الحيواني قبل بدء الدراسة. بالاضافه إلى اعتبارات الرفاه العام ، فان نقاط النهاية الخاصة بالنموذج هي عاده سرطان الخلايا الحرشفية (SCC) وعدوي الجلد. الخدوش في الجلد بسبب الحكة بعد تطبيق المواد الكيميائية التي توتوريغينيك في الأسيتون هو نموذجي ولكن خلاف ذلك يجب ان تظهر الكائنات اي علامات عدم الراحة. الوزن بانتظام (علي سبيل المثال ، 2x في الشهر) يساعد علي تقييم رفاهية الماشية.
  3. استخدام DMBA و طن سنويا ، علي حد سواء المخفف في الأسيتون. تركيز العمل من DMBA هو 250 g/L. جرعه للحيوان واحد هو 50 ميكروغرام من DMBA في 200 μL من الأسيتون. تركيز المخزون من طن سنويا هو 125 g/L وتركيز العلاج 25 غرام/لتر. جرعه طن سنويا للحيوان واحد هو 5 ميكروغرام في 200 μL من الأسيتون.
    تحذير: dmba ضار إذا ابتلع وقد يسبب السرطان. يتبخر الأسيتون بسرعة وهو قابل للاشتعال. قد يسبب الدوخة وتهيج العينين. استخدام قناع التنفس و/أو العمل تحت تدفق الفراغ. تغيير القفازات بعد التعامل مع اي من هذه المواد الكيميائية. أقفاص التهوية بشكل فردي منع انتشار المواد الكيميائية اثناء السكن من الفئران. بعد التطبيق ، وجمع النصائح ماصه المستخدمة للتعامل مع DMBA والتخلص من النفايات الخطرة.
    ملاحظه: يجب حماية dmba من الضوء. يتم تخزين طن سنويا المخفف في-20 درجه مئوية ، ويفضل ان تكون محمية من الضوء.
  4. شراء المعدات التالية: مقياس ، واله حلاقه عادية لفروه ، والماصات ونصائح من حجم مناسب ، مسطره عادية ، وكاميرا رقميه ، والمفكرة وقلم أو جهاز كمبيوتر لتسجيل الأورام الحليمة ، ونظام التخدير استنشاق أو الماوس يقيد مع فتح علي القمه الخلفية ، ونظام التخدير ثاني أكسيد الكربون للتضحية الفئران.

2. الحث الجلد الورم الحليمي والترويج

  1. حلق الجلد الخلفي وتزن الحيوانية. في وقت لاحق ، حلق الجلد كلما لزم الأمر ولكن ليس في وقت التعرض للكيماويات.
    ملاحظه: كن حذراعند الحلاقة حول الورم الحليمي وتجنب اجراء اي تخفيضات علي الجلد. تزن كل الحيوانية كل أسبوعين لتلاحظ اي فقدان الوزن المحتملة.
  2. تطبيق 50 ميكروغرام من DMBA في 200 μL من الأسيتون موضعيا علي المنطقة حليق باستخدام ماصه 48 h بعد حلاقه الفراء. إذا لزم الأمر ، كبح جماح الحيوانية باستخدام التخدير استنشاق الضوء أو يقيد الماوس.
  3. بعد 7 أيام, إعطاء جرعه طن سنويا الاولي. تطبيق 5 ميكروغرام من طن سنويا في 200 μL من الأسيتون موضعيا مع ماصه 2x في الأسبوع ، ويفضل الاثنين والخميس أو الثلاثاء والجمعة.
  4. عد وسجل والتقط صوره للورم الحليم كل أسبوع تعتبر الكتلة المحسوسة التي يزيد قطرها عن 1 ملم ورما حليما إذا بقيت أطول من أسبوع واحد. ضع علامة علي كل ورم حليمي فردي علي الخريطة وسرد حجمه كل أسبوع. خزن الصور الرقمية.

3. تضحية الحيوانية وجمع عينه

  1. استمر في العلاج حتى تصل استجابه الورم إلى الهضبة. عموما ، من المتوقع ان يزيد عبء الورم الحليمي من 10 إلى 20 أسبوعا بعد البدء ، اعتمادا علي سلاله الماوس المستخدمة. ومن المتوقع ان الهضبة في 15-20 أسابيع. نسبه صغيره من الورم الحليمي (اقل من 3 ٪) يمكن ان تتطور إلى SCCs في غضون 20-50 أسابيع2.
  2. التضحية الحيوانية 24 ح بعد تطبيق طن سنويا الماضي. استخدام الخدر ثاني أكسيد الكربون مع خلع عنق الرحم أو طريقه أخرى مناسبه.
  3. اعتمادا علي سؤال البحث ، وجمع المواد المناسبة عينه من الكائنات30،31.
    1. علي سبيل المثال ، أخذ عينات الدم قبل التضحية وفصل البلازما.
    2. قطع قطع من الجلد لمناعي (IHC) تلطيخ (علي سبيل المثال ، الهيلوكسيلين و ايوسين ، تكاثر أو التهاب الخلايا).
    3. استخدام اللكمات الخزعة لجمع قطع الجلد مع الانسجه الحليمة أو الجلد غير الورم الحليمي (معامله) للتعبير عن الجينات (علي سبيل المثال ، qPCR) و/أو تحليلات البروتين (علي سبيل المثال ، وصمه عار الغربية أو اليسا).
    4. جمع قطعه من الطحال والغدد الليمفاوية استنزاف الجلد لتحليل التدفق الخلوي إذا كان المطلوب تحليل أكثر تفصيلا من السكان الخلية المناعية. يمكنك أيضا فصل طبقات البشرة والجلد لمزيد من التحاليل.

4-الإحصاءات

  1. رسم منحني البقاء كابلان-ماير من الوقت الخالي من الورم الحليمي واستخدام رف-كوكس سجل رتبه اختبار للبقاء علي قيد الحياة. رسم منحني خطي لعدد الأورام الحليمة في الأسبوع. لان هذا هو حساب البيانات ، استخدم نموذج انحدار غير خطيه. استشر الإحصائي إذا لزم الأمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتيجة الرئيسية هي البقاء (اي ، الورم الحليمي الحر) الوقت بين العلاج أو مجموعات النمط الجيني. والنتيجة الثانوية هي عدد الأورام الحليمة في كل أسبوع في كل مجموعه (الشكل 2). النتائج المتوقعة هي فرق كبير إحصائيا في وقت فراغ الورم الحليمي وفي عدد الأورام الحليمة بين المجموعات التجريبية (اثنين أو أكثر). فمن المستحسن لحساب عدد من الأورام الحليمة ورسم منحني خلال المرحلة الترويجية (طن سنويا) للحصول علي فكره عن الاختلافات بين المجموعات في تلك المرحلة. إنهاء التجربة في وقت مبكر جدا قد يخفي فرقا كبيرا إحصائيا.

Figure 2
الشكل 2: النتائج الرئيسية لنموذج السرطان الجلدي المستحث بالجلد. الصور التمثيلية من الورم الحليمي علي جلد الفار والنتيجتين الرئيسيتين. وجمعت البيانات من أربع تجارب منفصلة. ملاحظه: تم اجراء تجارب مع الفئران Balb/C و C57BL/6 بشكل منفصل. (ا) مؤامرة البقاء علي قيد الحياة من الوقت الخالي من الورم الحليمي. خط متقطع = Balb/c وخط الصلبة = C57BL/6. (ب) متوسط عدد الأورام الحليمة لكل ماوس. خط متقطع = Balb/c وخط الصلبة = C57BL/6. أشرطه الخطا = SEM. (ج) ماوس balb/c مع الورم الحليمي في 11 أسابيع بعد العلاج dmba. (D) C57BL/6 الماوس مع الورم الحليمي في 11 أسابيع بعد العلاج dmba. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الانسجه ، mRNA ، وتحليل الخلايا والبروتين يمكن اجراؤها لاستكشاف أليات الكامنة وراء الاختلافات الملحوظة. علي سبيل المثال ، التحليلات النسيجية مناسبه لدراسة بنيه الأورام الحليمة ، وتشكل الجلد (البشرة وسمك الجلد) ، والعمليات البيولوجية المختلفة (الانتشار ، موت الخلايا المبرمج ، وتكوين الاوعيه) ، أو تسلل الخلية المناعية32 (الشكل 3). تعتبر البشرة مثاليه لتحديد كميات موثوقه من المعلمات المورفولوجية والihc بواسطة أنظمه تحليل الصور الحديثة30،31،32،33. الجينات والبروتين التعبيرات من (الورم الحليمي) عينات الجلد يمكن دراستها بسهوله مع الأساليب القياسية30. قياس التدفق الخلوي هو أداه مفيده لتحليل الخلايا المناعية المختلفة من الطحال والغدد الليمفاوية استنزاف الجلد ، كما هو موضح سابقا30. ويعتمد اختيار الأساليب التحليلية علي مساله البحث ويحتاج إلى النظر فيها قبل بدء التجربة.

Figure 3
الشكل 3: التحليل النسيجي لتسلل الخلايا التهابيه في نموذج DMBA-طن سنويا. ممثل الانسجه عبر مقاطع من PFA-الثابتة البارافين-الجلد جزءا لا يتجزا من في نموذج DMBA-طن سنويا. كانت ملطخه أقسام الجلد مع علامة الضامة F4/80 (براون). قضبان المقياس = 200 μm. (ا) لم ينظر الا إلى عدد قليل من الضامة الايجابيه F4/80 في الجلد العادي ، غير المعالجة. (ب) كان تسلل الضامة في الادمه واضحة في المرحلة المبكرة من الترويج للسرطان ، في 2 أسابيع و 36 h بعد الاداره الثانية طن سنويا. أيضا ، وشهدت فرط انتشار البشرة في 2 أسابيع ، كما هو مبين من سماكه البشرة. (ج) الجلد غير الحليمة في 19 أسابيع لا يزال يظهر تسلل ملحوظ من الضامة. (د) وكان ينظر إلى تراكم قوي من الضامة تحت الحليمات في الادمه من الحيوانية DMBA-طن سنويا المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DMBA-سنويا-الناجمة عن سرطان الجلد هي واحده من نماذج السرطان الأكثر استخداما لأنها قابله للاستنساخ للغاية ويوفر معلومات عن تطور الورم من البدء إلى الأورام الخبيثة. قياس النتائج الرئيسية ، تكوين الورم الحليمي ، هو الكمية بسهوله وموثوقيه. يعالج النموذج كلا من بدء الورم (بقاء الورم خاليا) والتقدم (اعداد الورم واحجامه) في وقت واحد. النموذج هو مناسبه لدراسة المركبات المختلفة ، مثل العلاجات المحتملة ، وأثار الجينات الفردية علي تطور الورم في الحيوانية المعدلة وراثيا. عند تطبيق نموذج لأي سلاله معينه ، فانه من المستحسن لدراسة الأدبيات الموجودة لتحقيق فكره عن كيفيه تفاعل السلالة في النموذج (علي سبيل المثال ، لمعرفه كيف بسرعة سوف تظهر الأورام الحليمة الاولي). عند استخدام الفئران المعدلة وراثيا ، ينصح دائما باستخدام أصحاب الأنواع البرية. استخدام الضوابط الاضافيه المحتملة ، مثل استبدال اما DMBA أو طن سنويا أو كليهما من قبل الأسيتون ، هو قابل للنقاش للغاية ، لأنه من المعروف ان أزاله DMBA أو طن سنويا أو عكس أمر الاداره الخاصة بهم من المستبعد جدا ان يؤدي إلى الحث علي نمو الورم الحليمي34. عندما يكون من الضروري دراسة بدء الورم (اي ، عن طريق أداره DMBA وحدها) ، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق التضحية الحيوانية بعد جرعه DMBA. عند دراسة تاثير الجينات الفردية في اعداد المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب ، فمن المستحسن ان تاخذ عينات من الكائنات غير المعالجة للكشف عن الاختلافات المحتملة التي قد تكون موجودة قبل تشكيل الورم بين المهندسة وراثيا وسلالات نوع البرية30،31.

علي الرغم من ان نموذج DMBA-طن سنويا بسيطه نسبيا لاجراء تقنيا ، توقيت دقيق ضروري للنجاح. تطبيق DMBA والتطبيق المنتظم من طن سنويا علي حد سواء حاسمه لتطوير الورم34. الفحص الأسبوعي الدقيق للأورام الحليمة ضروري لجمع كل البيانات. ومن الضروري ملاحظه ان بعض العلاجات أو الخلفيات الوراثية قد تتسبب في نمو الأورام الحليمة وفي وقت لاحق يتقلص أو حتى تختفي30. في بعض الأحيان ، تنشا آلافات غير السرطانية الأخرى و SCCs. في هذه الحالة ، ينصح الفحص النسيجي لافه. خطوه أخرى حاسمه لضمان ان طن سنويا هو بروموتور الورم الوحيد. الصدمات الجلدية يحفز إنتاج السايتوكينات التي قد تؤثر علي تعزيز الورم2,34. التالي ، يجب تجنب الاصابه بجروح الجلد اثناء الحلاقة ، ويجب ان يتم إيواء الفئران المقاتلة العدوانية بشكل منفصل. الاضافه إلى القتال ، فان الجوانب الأخرى لرفاه الماشية مهمة أيضا. فقدان الوزن ، والفراء مملة ومتشابكة ، والسلوك لامبالي علامات الانزعاج. الانزعاج ليس فقط قضية اخلاقيه ، لان التوازن السلبي للطاقة يثبط نمو الورم34.

يوفر نموذج DMBA-طن سنويا فرصه للعديد من التعديلات. لان بعض السلالات معروفه بأنها أكثر حساسية من غيرها ، فان الاختيار الدقيق يمكن من جدوله التجربة وضبط كميه وترددالتطبيق35. ويستخدم هذا النموذج أساسا لتطوير أورام الجلد ، ولكن التطبيق المحلي علي الجهاز الهضمي هو خيار36. الاضافه إلى ذلك ، تم استخدام نسخه معدله من النموذج لدراسة تطور الورم في القصبة الهوائية37. لأنه يمكن تنظيم تطور الورم مع DMBA والتطبيقات طن سنويا ، ونموذج يتيح دراسة النتائج بعد تعديل الجوانب البيئية مثل النظام الغذائي والايقاعيه إيقاع38. عن طريق فصل بدء الورم (DMBA) والترويج (طن سنويا) ، فان النموذج يتيح دراسة هاتين العمليتين بشكل مستقل. علي سبيل المثال ، التضحية الفئران بعد العلاج dmba يسمح دراسة اليه العلاج أو تاثير جين الفائدة في بدء الورم2،34. لدراسة الاحداث المبكرة في بدء الورم والترويج له ، يمكن التضحية بالماشية في وقت مبكر. علي سبيل المثال ، يمكن جمع العينات بعد فتره وجيزة من الاداره الثانية طن سنويا (علي سبيل المثال 3 h ، 12 h ، 36 h ، أو 48 h بعد)30،31. ومن الجدير بالذكر أيضا ان نموذج السرطانية الكلاسيكية DMBA-طن سنويا من مرحلتين يمكن تعديلها باستخدام مواد كيميائية مختلفه أو باستخدام المادة الكيميائية "الثالثة". يتم مراجعه هذه من قبل هابيل وآخرون2.

وقد استخدم نموذج DMBA-طن سنويا لعقود لأغراض مختلفه34. وقد استخدمت لدراسة اثار التداوي مختلفه24,25,26 والجينات31,32,39,40 ولكن أيضا لدراسة التغذية27, إيقاع الايقاعيه38, وتطوير أدوات التشخيص41. كما شكل الأورام من الجلد ، ويوفر النموذج فرصه فريدة لجمع عينات الانسجه السرطانية في مراحل مختلفه من التقدم21. عند إدخال العوامل الكيميائية الجديدة أو المناعية ، فانه من المستحسن لجمع البيانات أولا عن كيفيه الضغط قد ردت في نموذج DMBA-طن في الدراسات السابقة. إذا لم يكن متوفرا ، يوصي باجراء دراسة مسبقه بدون العامل العلاجي المحتمل لتحديد توقيت وعدد الأورام الحليمة وكذلك الفرق في هذه المعلمات. البيانات الموجودة من الدراسات المنشورة قد تساعد أيضا في تحديد الجرعة من مجمع اختبار24,27, ولكن إذا لم تكن متوفرة, استخدام التخفيف التسلسلي للمجمع اختبار تمكن تقييم استجابه الجرعة من وكيل درس25,26.

التهاب ضروري لنشاه الإنسان ، كما انها تشارك في جميع مراحل تطور الورم: البدء ، والترويج ، والتحويل إلى خبيث42،43. نموذج سرطان الجلد المستحث كيميائيا هو نموذج للسرطان يحركه التهاب. استجابه السايسيسين الموالية للالتهابات وتسلل الخلايا التهابيه إلى الجلد المعالج واضحة بالفعل في المرحلة المبكرة من النموذج. الخلايا الاولي التسلل هي العدلات ، تليها تراكم الضامة ، خلايا T ، الخ30،31. هذه الخلايا تخلق البيئة المجهرية التهابيه في الجلد ، ويبدا الحديث عبر الخلايا التهابيه والبشرة ، مما يؤدي إلى إنتاج السايتوكينات ، chemokines ، والبروستاغلينات التي تدفع بدء الورم والنمو محليا. كما نموذج DMBA-طن سنويا هو نموذج يحركها التهاب ، فانه لا يشمل بعض الجوانب الأخرى من السرطان السريري. علي الرغم من انه من المعروف ان sccs في نهاية المطاف قد يسبب الانبثاث في نموذج دمبا-طن سنويا, فقط جزء صغير من الورم الحليمي تتطور إلى sccs2,23. التالي ، الانبثاث هو ميزه نادره في نموذج DMBA-طن سنويا ، علي الرغم من ان بعض الأسهم الحساسة outbred مثل CD-1 أو SENCAR قد يكون لها احتمال متزايد لتطوير44الانبثاث. وغالبا ما يعتبر ظهور SCC قضية رعاية الحيوانية التالي نقطه نهاية معيار. ولذلك ، علي الرغم من وجود الانبثاث في النموذج ، وبعض النماذج الأخرى مثل زرع أو نماذج المهندسة وراثيا هي أكثر ملاءمة لدراسة الانبثاث45. وثمة قيد آخر علي النموذج هو انه يتطلب سطحا لتطبيق المواد الكيميائية. التالي ، فان دراسة تطور السرطان في جهاز داخلي محدد خارج نطاق النموذج.

آخر نموذج سرطان الجلد المشترك هو نموذج الاشعه فوق البنفسجية46. النموذج هو مماثل للنموذج DMBA-طن سنويا لان أيا من هذين النموذجين يحتاج إلى زرع الخلايا أو التعديل الوراثي للتسبب في السرطان. الفرق الأساسي بين النماذج هو ان نموذج الاشعه فوق البنفسجية يدفع تشكيل العدوانية SSC ، في حين ان النتيجة الورم في نموذج DMBA-طن سنويا هو الورم الحليمي الحميد عموما. إذا تم الجمع بين الاشعه فوق البنفسجية مع تطبيق المواد المسرطنة الكيميائية أو في سلالات الماوس مع الخلفية الوراثية التي تجعل السلالة عرضه لتطوير السرطان ، وحتى تكوين سرطان الجلد يمكن ان يحدث. الطفرات الأكثر شيوعا في نموذج الاشعه فوق البنفسجية إلغاء تنشيط الجينات p53 ، وهو جين حاسم الورم المثبط في البشر46، في حين ان الطفرات الأكثر شيوعا في نموذج dmba-طن سنويا تنشيط hras-الجينات23. الاشعه فوق البنفسجية يسبب أيضا كبت المناعة46،47، والتي قد تكون عاملا مربكا عند دراسة جوانب الجهاز المناعي. ومع ذلك ، فان هذين النموذجين يعملان أيضا في تركيبه. ويمكن استخدام الاشعه فوق البنفسجية كعامل تعزيز مع DMBA أو كوكيل البدء مع46طن سنويا.

والسؤال المعقول هو ما إذا كان نموذج DMBA-طن سنويا يحاكي سرطان الإنسان. تتطور نسبه صغيره من الحليمات إلى SCCs. ومع ذلك ، فان مرحله ما قبل الخبيثة من SCC الإنسان هو التقرن الشعاعي ، وانه يختلف عن تشكيل الورم الحليمي ينظر في النموذج. ومع ذلك ، يتم الكشف عن تكوين الورم الحليمي مشابهه للنموذج في الافراد البشرية المعالجة لسرطان الجلد مع vemurafenib. وهذا يوحي بان الخلايا الجذعية المتحولة Hras التي تعتبر ضرورية للسرطان في نموذج DMBA-طن سنويا أيضا موجودة علي الجلد البشري34. وعلاوة علي ذلك ، أفيد ان امتصاص 2-ديكسي-2-[18و]-فلورو-د-الجلوكوز (18ف-fdg) الأورام الخبيثة والصغيرة sccs هو اعلي من الجلد المحيطة بها ولكن ليس مرتفعا كما في SCC الغازية تماما ، مما يعكس تشابه المراحل الخبيثة41. إذا كان استخدام نموذج DMBA-طن سنويا لتقييم السمية ، يجب علي المرء ان نتذكر ان تكرار التعرض له تاثير كبير علي تعزيز الأورام34. علي الأقل بعض أليات الجزيئية شائعه للنموذج والجلد البشري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل اكاديميه فنلندا (المنح 25013080481 و 25013142041 (I.J.) ، 286377 و 295814 (عضو البرلمان) ، 287907 (تي جي)) ، ومؤسسه Päivikki و Sakari Sohlberg (عضو البرلمان ، تي جي) ، والمؤسسة الطبية الفنلندية (T.P.) ، والبحوث الحكومية التنافسية تمويل منطقه مسؤوليه الخبراء في مستشفي جامعه تامبيري (منحه 9V049 و 9V049 (عضو البرلمان) ، 9V049 و 9V049 (تي جي)) ، وتمويل البحوث الحكومية التنافسية لمجال مسؤوليه الخبراء في مختبرات فيلاب (منحه X51409 (I.J.)) ، Tays مؤسسه الدعم (I.J. ، عضو البرلمان ، تي جي) ، مؤسسه تامبيري للسل (I.J. ، عضو البرلمان ، تي جي) ، المؤسسة الثقافية الفنلندية (سفينة) ، مؤسسه باولو (T.P.) ، جمعيه السرطان في فنلندا (عضو البرلمان) ، ومؤسسه اميل علتونين (T.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill Starlab S1182-1730-C
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill Starlab S1180-9710-C
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) Sigma D3254-100MG Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.
Acetone Sigma 1000141011 Evaporates rapidly and is inflammable.
Attane vet 1000 mg/g Piramal Critical Care Limited Liquid isoflurane for inhalation
Battery-Operated Clipper Isis Albert Kerlb GmbH GT421 For shaving the fur
CONTRAfluran-Restgasfilter ZeoSys GmbH For anesthesia
Linex Nature N1030 Ruler 30 cm Staples Business Advantage 60383 For measuring papillomas
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - Red VetTech Solutions Ltd AN045AR For sacrifice
Mekasoft Mekalasi 23008 Table cover
Mice (Balb/c JRj) Janvier labs Other strains also possible
Mice (C57BL/6JRj) Janvier labs Other strains also possible
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera Panasonic
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 For histology samples
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) Enzo BML-PE160-0001
Precision balance PLJ-C/PLJ-G KERN & SOHN GmbH PLJ 600-3CM
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing VetTech Solutions Ltd AN044BX For sacrifice
RNAlater Qiagen 76104 For nucleic acid samples
Tacta pipette 100-1000 ul Sartorius LH-729070
Tacta pipette 20-200 ul Sartorius LH-729060
UNO Anaesthetic Key Filler Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Face Mask for Mouse Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO FM2200 Flowmeter Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Gas Exhaust Unit Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO Induction Box Scintica instrumentation inc. For anesthesia
UNO200VAP Vaporizer Scintica instrumentation inc. For anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
  2. Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
  3. Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
  4. Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
  5. Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
  6. Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
  7. Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
  8. Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
  9. Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
  10. Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
  11. Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
  12. He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
  13. Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
  14. Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
  15. Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
  16. Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
  17. Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
  18. Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
  19. Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
  20. Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
  21. Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
  22. Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
  23. Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
  24. Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, Philadelphia Pa. 400-409 (2015).
  25. Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
  26. Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
  27. Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
  28. Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
  29. Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
  30. Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
  31. May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
  32. Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
  33. Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
  34. Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
  35. Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
  36. Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
  37. Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
  38. Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
  39. Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
  40. Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
  41. Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
  42. Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
  43. Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
  44. Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
  45. Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  46. Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
  47. Day, C. -P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).

Tags

أبحاث السرطان العدد 154 سرطان الجلد السرطانية الكيميائية الطفرة بروموتور دمبا-طن سنويا الورم الحليمي تولد الاوعيه التهاب ورم انتشار
نموذج سرطان الجلد المستحث بالمواد الكيميائية باستخدام ثنائي ميثيل بنز [a] انثراسين و 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-خلات (دمبا-طن سنويا)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vähätupa, M., Pemmari, T., … More

Vähätupa, M., Pemmari, T., Junttila, I., Pesu, M., Järvinen, T. A. H. Chemical-Induced Skin Carcinogenesis Model Using Dimethylbenz[a]Anthracene and 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA). J. Vis. Exp. (154), e60445, doi:10.3791/60445 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter