ジメチルベンズを用いた化学的誘発性皮膚発癌モデル[a]アントラセンと12-O-テトラデカノイル・ホルボル-13-酢酸(DMBA-TPA)
Summary
二段皮膚発癌は、局所的に適用される2つの化学物質によって誘発される。変異原7,12-ジメチルベンズ[a]アントラセン)は、表皮細胞の突然変異を引き起こし、一般的な増殖刺激剤12-O-テトラデカノイルホルボル-13-酢酸の連続的な適用は、皮膚乳頭腫形成を促進する。
Abstract
癌は最も壊滅的な人間の病気の一つです。実験的な癌モデルは、腫瘍の進行を促進する上で異なる細胞型および遺伝子の複雑な相互作用に関する洞察を得て、異なる治療アプローチの有効性をテストするためのプラットフォームを提供するために重要である。最も一般的に使用される実験的炎症性癌モデルの1つは、DMBA-TPA二段皮膚発癌モデルである。腫瘍形成は、7,12-ジメチルベンズ(a)アントラセン(DMBA)と12-O-テトラデカノイルホルボル-13-酢酸(TPA)の2つの異なる化学物質の局所適用によってこのモデルに誘導され、一緒に皮膚に乳頭腫形成を引き起こす。主な結果は皮膚における乳頭腫形成であるため、モデルは、腫瘍の開始(腫瘍を含まない生存)と腫瘍進行(目に見える腫瘍の数と大きさ)の両方に対処するための理想的で信頼性が高く、再現可能な方法です。DMBA-TPA治療の効果は炎症機構を介して伝達され、このモデルは腫瘍形成における免疫系の役割を研究するのに特に適している。しかし、このモデルは、化学物質を適用できる皮膚および他の表面に制限される。この記事では、モデルを正常に使用するための詳細なプロトコルが提供されています。
Introduction
癌は世界の主要な死因の一つである。したがって、疾患のより良い理解を得るために、また潜在的な治療アプローチを探求するために、信頼性の高い実験疾患モデルを開発する必要があります。皮膚癌の発症を研究するために生体内モデルで最も一般的に使用される実験の1つは、化学的に誘導された二段皮膚発癌モデル1、2である。このモデルは、免疫細胞浸潤や血管新生などの特定の事象に加えて、腫瘍の開始、促進、および進行を研究するためのツールを提供します。
二段皮膚発癌モデルを使用するために、マウスの背部皮膚は、一緒に腫瘍形成を誘導する2つの異なる化学物質で治療される。モデルは、変異原、DMBAの低用量で開始され、続いて腫瘍プロモーターへの長期暴露、TPA3(図1)。DMBAは、表皮細胞および原発性角化細胞幹細胞4、5、6、7のDNAと共有付加を形成することによりDNAをランダムに変異させる。これらのランダム突然変異の一部は、Hras1(KrasおよびNrasの突然変異も検出される)のようなプロトオンコジーンで起こり、プロトオンコゲ遺伝子を腫瘍遺伝子に変換すると、適切な刺激の下で腫瘍形成を促進する。TPAは、順番に、最も一般的に使用される腫瘍増殖促進剤である。その分子標的はプロテインキナーゼC(PKC)8である。TPAはまた、モデル9の腫瘍形成に不可欠なWnt/β-カテニンシグナル伝達を活性化する。促進剤への反復および長期暴露は、細胞シグナル伝達の増強、増殖因子の産生の増加、および治療された皮膚におけるDNA合成および炎症性細胞浸潤の増加によって明らかである局所炎症反応につながる。
DMBA-TPAモデルの主要な炎症メディエーターは10.インターロイキン-17A(IL-17A)は、DMBA-TPAモデル11、12において特に腫瘍原性であることが知られている。インターロイキン6(IL-6)との相乗効果で動作し、マクロファージおよび好中球募集13、14に参加しています。さらに、CD4+T細胞および好中球は、DMBA-TPAモデルにおいて腫瘍原性であることが示されている。最後に、マクロファージはまた、モデル15、16、17における腫瘍形成を促進することができる。
促進段階では、変異細胞の細胞増殖が増強され、表皮の持続的な過形成が1に維持される。これは、10〜20週で皮膚の乳頭腫の発症につながり、その後乳頭腫は悪性腫瘍に変換し始め、扁平上皮癌(SCC)2。しかしながら、乳頭腫の10%未満は悪性腫瘍に進行するが、この割合はマウス2、18の遺伝的背景にも依存する。何十年もの間、悪性腫瘍につながる腫瘍で最初にどのような種類の細胞が変異したのかは分かっていなかったが、良性乳頭腫19、20と比較した場合、悪性腫瘍の明らかに明確な特徴を報告していた。しかし、最近の研究は、DMBA-TPAモデル21における腫瘍形成のクローン起源に関する我々の理解を大幅に高めています。22.23.骨髄由来上皮細胞および毛包幹細胞の両方が腫瘍形成22に寄与することが実証された。ステージ特異的系統追跡研究は、良性乳頭腫がモノクローナル起源であることを明らかにしたが、彼らは新しい上皮細胞集団21、23を募集する。しかし、細胞クローンの1つだけは発癌のドライバーとして機能します。それはフラス突然変異23を含んでいます。癌形成への進行は、クローンススイープ23に関連している。
発がん性DMBAは乳頭腫形成を開始し、TPAは腫瘍の増殖を促進する。したがって、腫瘍開始は、TPA治療期間の前に実験を中断することによって、促進とは別に研究することができる。腫瘍の進行が毎週研究されているように、それは研究全体を通して詳細な腫瘍の成長分析のための素晴らしい機会を提供しています。腫瘍は外部化学物質によって生成されるため、生殖細胞系列の発癌性突然変異は不要である。従って、遺伝的背景(例えば、ノックアウト/トランスジーン対野生型)が腫瘍形成に及ぼす影響を研究することは、簡単な2である。要するに、DMBA/TPA皮膚癌モデルは、腫瘍進行における免疫系の役割を研究するだけでなく、腫瘍の開始および促進ステップを独立または相互に依存的に評価するための特に有用なアプローチである。
図1:DMBA-TPA誘発皮膚発癌モデルの概要発がん性DMBAは、モデルの開始段階でDNA突然変異を誘導するために局所的に適用される。増殖促進剤TPAは、促進段階の間に細胞増殖を増強するために週2倍投与され、皮膚における乳頭腫の発症につながる。動物は、乳頭腫応答が高原に達した後、マウスの遺伝的背景に応じて、通常15〜20週以内に犠牲にされる。乳頭腫のごく一部は、さらに20〜50週間以内にSCCに発展することができます。開始および早期プロモーション段階の初期の事象を研究するために、サンプルを収集することができる(例えば、2番目のTPAアプリケーションの直後)。19週間の治療後のC57BL/6マウス皮膚上の乳頭腫の代表的な写真およびヘマトキシリンおよびエオシン染色断面が示されている。スケール バー = 0.1 mm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
DMBA-TPA誘発性皮膚癌は、非常に再現性が高く、開始から悪性腫瘍への腫瘍進行に関する情報を提供するため、最も一般的に使用される癌モデルの1つである。主要な結果測定は、乳頭腫形成が容易かつ確実に定量的である。このモデルは、腫瘍開始(腫瘍フリー生存)と進行(腫瘍数とサイズ)の両方に同時に対処する。このモデルは、潜在的な治療薬などの異なる化合物の研究、および遺伝子組み…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フィンランドアカデミー(助成金25013080481および25013142041(I.J.)、286377および295814(M.P.)、287907(T.J.))、パイビッキとサカリ・サルベルク財団(M.P.)によって資金提供されました。 T.J.)、フィンランド医学財団(T.P.)、競争国家研究タンペレ大学病院の専門家責任領域(助成金9V049および9X044(M.P.)、9X011および9V010(T.J.))、フィムラボ研究所の専門家責任領域の競争国家研究ファイナンス(助成金X51409(I.J.))、テイズ支援財団(I.J.、M.P.、T.J.)、タンペレ結核財団(I.J.、M.P.、T.J.)、フィンランド文化財団(M.V.)、パウロ財団(T.P.)、フィンランド癌協会(M.P.)、エミール・アールトネン財団(T.P.)。
Materials
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm – Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
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