Kjemisk-indusert Skin kreft modell bruke Dimethylbenz [a] Anthracene og 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-acetate (DMBA-TPA)
Summary
To-trinns hud kreft er indusert av to lokalt anvendte kjemikalier. A arvestoffskadelig 7, 12-dimethylbenz [a] anthracene) forårsaker mutasjoner i epidermal celler og en kontinuerlig anvendelse av generell vekst stimulator 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate akselererer hudens papilloma formasjon.
Abstract
Kreft er en av de mest ødeleggende menneskelige sykdommer. Eksperimentelle kreft modeller er viktig for å få innsikt i det komplekse samspillet mellom ulike celletyper og gener for å fremme tumorprogresjon og for å gi en plattform for å teste effekten av ulike terapeutiske tilnærminger. En av de mest brukte eksperimentelle inflammatorisk kreft modellene er DMBA-TPA to-trinns hud kreft modell. Tumor formasjon er indusert i denne modellen av aktuell anvendelse av to ulike kjemikalier, 7, 12-dimethylbenz [a] anthracene (DMBA) og 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA), som sammen forårsake papilloma dannelse i huden. Som det primære utfallet er papilloma dannelse i huden, er modellen en ideell, pålitelig og reproduserbar måte å ta opp både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og tumorprogresjon (antall og størrelse på synlige svulster). Effekten av DMBA-TPA-behandlingen overføres via en inflammatorisk mekanisme, som gjør denne modellen spesielt egnet for å studere immunsystemets rolle i tumor dannelse. Imidlertid er denne modellen begrenset til huden og andre overflater der kjemikaliene kan påføres på. En detaljert protokoll er gitt i denne artikkelen for å bruke modellen vellykket.
Introduction
Kreft er en av de viktigste årsakene til dødsfall i verden. Derfor er det et krav om å utvikle pålitelig eksperimentell sykdom modeller for å få en bedre forståelse av sykdommen, samt å utforske potensielle terapeutiske tilnærminger. En av de mest brukte eksperimentelle in vivo-modeller for å studere hudkreft utvikling er den kjemisk indusert to-trinns hud kreft modell1,2. Modellen gir et verktøy for å studere tumor innvielse, forfremmelse, og progresjon i tillegg til bestemte hendelser som immun celle infiltrasjon og angiogenese.
For å bruke to-trinns hud kreft modell, er baksiden hud av mus behandlet med to forskjellige kjemikalier som sammen induserer tumor formasjon. Modellen initieres med en lav dose av arvestoffskadelig, DMBA, etterfulgt av forlenget eksponering for tumor arrangøren, TPA3 (figur 1). DMBA mutates DNA tilfeldig ved å danne kovalente addukter med DNA av epidermal celler og primære Keratinocyte stamceller4,5,6,7. Noen av disse tilfeldige mutasjoner finner sted i en proto-diagnostisk, slik som Hras1 (mutasjoner i Kras og NRAs er også oppdaget) og konvertering av proto-oncogenes til oncogenes stasjoner svulsten formasjonen under riktig stimuli. TPA, i sin tur, er den mest brukte tumor vekst-fremme agent. Dens molekylære mål er protein kinase C (PKC)8. TPA aktiverer også wnt/β-catenin signalering som er avgjørende for tumor dannelse i modellen9. Gjentatt og langvarig eksponering for fremme agent fører til økt celle signalering, økt produksjon av vekstfaktorer, og en lokal inflammatorisk reaksjon, som er tydelig på grunn av økt DNA-syntese og inflammatorisk celle infiltrasjon i den behandlede huden.
De viktigste inflammatoriske meglere i DMBA-TPA-modellen har blitt identifisert10. Interleukin-17A (Il-17A) er kjent for å være spesielt tumorigene i DMBA-TPA-modellen11,12. Det fungerer i synergi med interleukin 6 (Il-6) og deltar i macrophage og nøytrofile rekruttering13,14. I tillegg har CD4+ T celler og nøytrofile blitt vist å være TUMORIGENE i DMBA-TPA-modellen. Endelig kan makrofager også fremme tumorigenesis i modellen15,16,17.
I løpet av kampanje fasen, celle spredning av muterte celler er forbedret og en vedvarende, ved over huden opprettholdes1. Dette fører til papilloma utvikling i huden i 10-20 uker, hvoretter papillomer begynner å konvertere til ondartede svulster, plateepitel celle kreftsvulster (SCCs)2. Men mindre enn 10% av papillomer fremdrift til kreft, selv om denne prosentandelen også avhenger av den genetiske bakgrunnen til musene2,18. I flere ti år var det ikke kjent hvilken type celler opprinnelig ble mutert i svulster som fører til kreft, selv om noen studier hadde rapportert klart distinkte funksjoner i ondartet svulster i forhold til godartet papillomer19,20. Men nyere studier har i stor grad økt vår forståelse på klonal opprinnelsen til tumor dannelse i DMBA-TPA-modellen21. 22i. 23. det ble demonstrert at både benmarg-avledet epitelceller og hårsekken stamceller bidrar til tumor formasjon22. Stage-spesifikke avstamning tracing studier har avduket at godartet papillomer er av monoklonale opprinnelse, men de rekruttere nye epitel celle populasjoner21,23. Men bare én av celle kloner fungerer som en driver for kreft; den inneholder en HRAS mutasjon23. Progresjon til kreft formasjon er forbundet med en klonal feie23.
Kreftfremkallende DMBA initierer papilloma formasjon og TPA fremmer tumor vekst. Derfor kan tumor innvielsen bli studert separat fra kampanjen ved å avbryte eksperimentet før den TPA behandlingsperioden. Som tumorprogresjon er studert ukentlig det gir en stor mulighet for detaljert tumor vekst analyse gjennom studien. Fordi svulster er generert av eksterne kjemikalier, en kreftfremkallende mutasjon i germline er unødvendig. Dermed studere virkningene av en genetisk bakgrunn (f. eks knockout/transgene g. Wild type) på tumorigenesis er enkel2. I sum er DMBA/TPA hudkreft modellen en spesielt nyttig tilnærming for å studere rollen til immunsystemet i tumorprogresjon samt for evaluering av tumor innvielse og forfremmelse trinn uavhengig eller uavhengig.
Figur 1: DMBA-TPA-indusert hud kreft modell omriss. Kreftfremkallende DMBA brukes lokalt for å indusere DNA-mutasjoner i startfasen av modellen. Veksten-fremme agent TPA administreres 2x i uken for å forbedre celle spredning i løpet av kampanje fasen, som fører til utvikling av papillomer i huden. Dyr blir ofret etter papilloma responsen når et platå, vanligvis innen uker 15 – 20, avhengig av den genetiske bakgrunnen til musene. En liten andel av papillomer kan videreutvikle seg i SCCs i løpet av 20 – 50 uker. For å studere tidlige hendelser i initiering og tidlig forfremmelse fasen, kan prøvene samles (f. eks, kort tid etter den andre TPA-programmet). En representativ fotografi og hematoksylin og eosin farget tverrsnitt av papillomer på en C57BL/6 mus huden etter 19 ukers behandling er vist. Scale bar = 0,1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Representative Results
Discussion
DMBA-TPA-indusert hudkreft er en av de mest brukte kreft modeller fordi det er svært reproduserbar og gir informasjon om tumorprogresjon fra innvielse til kreft. Nøkkelen utfallet mål, papilloma formasjon, er lett og pålitelig kvantitativ. Modellen adresserer både tumor initiering (tumor-fri overlevelse) og progresjon (tumor tall og størrelser) samtidig. Modellen er egnet for å studere ulike forbindelser, slik som potensielle legemiddel, og virkningene av individuelle gener på tumorprogresjon i genmodifiserte dyr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Academy of Finland (tilskudd 25013080481 og 25013142041 (I.J.), 286377 og 295814 (M.P.), 287907 (TJ)), Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation (M.P., TJ), Finnish Medical Foundation (T.P.), The konkurrerende State Research Finansiering av Expert ansvar området Tampere University Hospital (Grant 9V049 og 9X044 (M.P.), 9X011 og 9V010 (TJ)), den konkurransedyktige State Research finansiering av Expert ansvarsområde av Fimlab Laboratories (Grant X51409 (I.J.)), Tays Support Foundation (I.J., M.P., TJ), Tampere tuberkulose Foundation (I.J., M.P., TJ), den finske Cultural Foundation (M.V.), Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.), og Emil Aaltonen Foundation (T.P.).
Materials
| 1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), Refill | Starlab | S1182-1730-C | |
| 300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), Refill | Starlab | S1180-9710-C | |
| 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) | Sigma | D3254-100MG | Harmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light. |
| Acetone | Sigma | 1000141011 | Evaporates rapidly and is inflammable. |
| Attane vet 1000 mg/g | Piramal Critical Care Limited | Liquid isoflurane for inhalation | |
| Battery-Operated Clipper Isis | Albert Kerlb GmbH | GT421 | For shaving the fur |
| CONTRAfluran-Restgasfilter | ZeoSys GmbH | For anesthesia | |
| Linex Nature N1030 Ruler 30 cm | Staples Business Advantage | 60383 | For measuring papillomas |
| Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm – Red | VetTech Solutions Ltd | AN045AR | For sacrifice |
| Mekasoft | Mekalasi | 23008 | Table cover |
| Mice (Balb/c JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Mice (C57BL/6JRj) | Janvier labs | Other strains also possible | |
| Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital Camera | Panasonic | ||
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | For histology samples |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) | Enzo | BML-PE160-0001 | |
| Precision balance PLJ-C/PLJ-G | KERN & SOHN GmbH | PLJ 600-3CM | |
| Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S Housing | VetTech Solutions Ltd | AN044BX | For sacrifice |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | For nucleic acid samples |
| Tacta pipette 100-1000 ul | Sartorius | LH-729070 | |
| Tacta pipette 20-200 ul | Sartorius | LH-729060 | |
| UNO Anaesthetic Key Filler | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Face Mask for Mouse | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO FM2200 Flowmeter | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Gas Exhaust Unit | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO Induction Box | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia | |
| UNO200VAP Vaporizer | Scintica instrumentation inc. | For anesthesia |
References
- DiGiovanni, J. Multistage carcinogenesis in mouse skin. Pharmacology & Therapeutics. 54 (1), 63-128 (1992).
- Abel, E. L., Angel, J. M., Kiguchi, K., DiGiovanni, J. Multi-stage chemical carcinogenesis in mouse skin: fundamentals and applications. Nature Protocols. 4 (9), 1350-1362 (2009).
- Perez-Losada, J., Balmain, A. Stem-cell hierarchy in skin cancer. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 434-443 (2003).
- Bonham, K., et al. Activation of the cellular Harvey ras gene in mouse skin tumors initiated with urethane. Molecular Carcinogenesis. 2 (1), 34-39 (1989).
- Quintanilla, M., Brown, K., Ramsden, M., Balmain, A. Carcinogen-specific mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis. Nature. 322 (6074), 78-80 (1986).
- Nelson, M. A., Futscher, B. W., Kinsella, T., Wymer, J., Bowden, G. T. Detection of mutant Ha-ras genes in chemically initiated mouse skin epidermis before the development of benign tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14), 6398-6402 (1992).
- Morris, R. J. A perspective on keratinocyte stem cells as targets for skin carcinogenesis. Differentiation. 72 (8), 381-386 (2004).
- Chung, Y. W., Kim, H. K., Kim, I. Y., Yim, M. B., Chock, P. B. Dual function of protein kinase C (PKC) in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-inducec manganese superoxide dismutase (MnSOD) expression: activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt, respectively. The Journal of Biological Chemistry. 286 (34), 29681-29690 (2011).
- Su, Z., et al. Tumor promoter TPA activates Wnt/β-catenin signaling in a casein kinase 1-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (32), 7522-7531 (2018).
- Swann, J. B., et al. Demonstration of inflammation-induced cancer and cancer immunoediting during primary tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 652-656 (2008).
- Wang, L., Yi, T., Zhang, W., Pardoll, D. M., Yu, H. IL-17 enhances tumor development in carcinogen-induced skin cancer. Cancer Research. 70 (24), 10112-10120 (2010).
- He, D., et al. IL-17 mediated inflammation promotes tumor growth and progression in the skin. PLoS One. 7 (2), 32126 (2012).
- Roussel, L., et al. IL-17 promotes p38 MAPDK-dependent endothelial activation enhancing neutrophil recruitment to sites of inflammation. Journal of Immunology. 184 (8), 4531-4537 (2010).
- Wanqiu, H., Young-Hee, J., Hyun, S. K., Byung, S. K. Interleukin-6 (IL-6) and IL-17 synergistically promote viral persistence by inhibition cellular apoptosis and cytotoxic T cell function. Journal of Virology. 88 (15), 8479-8489 (2014).
- Yusuf, N., et al. Antagonistic roles of CD4+ and CD8+ T-cells in 7,12-dimethylbenz(a)anthracene cutaneous carcinogenesis. Cancer Research. 68 (10), 3924-3930 (2008).
- Gong, L., et al. Promoting effect of neutrophils on lung tumorigenesis is mediated by CXCR2 and neutrophil elastase. Molecular Cancer. 12 (1), 154 (2013).
- Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).
- Woodworth, C. D., et al. Strain-dependent differences in malignant conversion of mouse skin tumors is an inherent property of the epidermal keratinocyte. Carcinogenesis. 25 (9), 1771-1778 (2004).
- Tennenbaum, T., et al. The suprabasal expression of alpha 6 beta 4 integrin is associated with a high risk for malignant progression in mouse skin carcinogenesis. Cancer Research. 53 (20), 4803-4810 (1993).
- Hennings, H., Shores, R., Mitchell, P., Spangler, E. F., Yuspa, S. H. Induction of papillomas with a high probability of conversion to malignancy. Carcinogenesis. 6 (11), 1607-1610 (1985).
- Auto, Y., et al. Time-Series Analysis of Tumorigenesis in a Murine Skin Carcinogenesis Model. Scientific Reports. 8 (1), 12994 (2018).
- Park, H., et al. Bone marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis. Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).
- Dao, V., et al. Prevention of carcinogen and inflammation-induced dermal cancer by oral rapamycin includes reducing genetic damage. Cancer Prevention Research. 5, 400-409 (2015).
- Yeong, L. T., Abdul Hamid, R., Saiful Yazan, L., Khaza’ai, H., Mohtarrudin, N. Low dose triterpene-quinone fraction from Ardisia crispa root precludes chemical-induced mouse skin tumor promotion. BMC Complementary and Alternative Medicine. 15 (1), 431 (2015).
- Kong, Y. H., Xu, S. P. Salidroside prevents skin carcinogenesis induced by DMBA/TPA in a mouse model through suppression of inflammation and promotion of apoptosis. Oncology Reports. 39 (6), 2513-2526 (2018).
- Jung, M., Bu, S. Y., Tak, K. H., Park, J. E., Kim, E. Anticarcinogenic effect of quercetin by inhibition of insulin-like growth factor (IGF)-1 signaling in mouse skin cancer. Nutrition Research and Practice. 7 (6), 439-445 (2013).
- Hu, Y. Q., Wang, J., Wu, J. H. Administration of resveratrol enhances cell-cycle arrest followed by apoptosis in DMBA-induced skin carcinogenesis in male Wistar rats. European review for medical and pharmacological sciences. 13, 2935-2946 (2016).
- Schweizer, J., Loehrke, H., Hesse, B., Goerttler, K. 7,12-Dimethylbenz[a]anthracene/12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate-mediated skin tumor initiation and promotion in male Sprague-Dawley rats. Carcinogenesis. 3 (7), 785-789 (1982).
- Vähätupa, M., et al. T-cell-expressed proprotein convertase FURIN inhibits DMBA/TPA-induced skin cancer development. Oncoimmunology. 5 (12), 1245266 (2016).
- May, U., et al. Resistance of R-Ras knockout mice to skin tumour induction. Scientific Reports. 5, 11663 (2015).
- Krajewska, M., et al. Image analysis algorithms for immunohistochemical assessment of cell death events and fibrosis in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (7), 649-663 (2009).
- Järvinen, T. A., Ruoslahti, E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21671-21676 (2010).
- Schwarz, M., Münzel, P. A., Braeuning, A. Non-melanoma skin cancer in mouse and man. Archives of Toxicology. 87 (5), 783-798 (2013).
- Slaga, T. J. SENCAR mouse skin tumorigenesis model versus other strains and stocks of mice. Environmental Health Perspectives. 68, 27-32 (1986).
- Goerttler, K., Loehrke, H., Schweizer, J., Hesse, B. Systemic two-stage carcinogenesis in the epithelium of the forestomach of mice using 7,12-dimethylbenz(a)anthracene as initiator and the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate as promoter. Cancer Research. 39 (4), 1293-1297 (1979).
- Topping, D. C., Nettesheim, P. Promotion-like enhancement of tracheal carcinogenesis in rats by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. Cancer Research. 40, 4352-4355 (1980).
- Wille, J. J. Circadian rhythm of tumor promotion in the two-stage model of mouse tumorigenesis. Cancer Letters. 190 (2), 143-149 (2003).
- Lee, Y. S., et al. Inhibition of skin carcinogenesis by suppression of NF-κB dependent ITGAV and TIMP-1 expression in IL32γ overexpressed condition. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 293 (2018).
- Kiss, A., et al. Cell type-specific p38δ targeting reveals a context-, stage-, and sex-dependent regulation of skin carcinogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1532 (2019).
- Tomo-o, I., et al. Positron emission tomography imaging of DMBA/TPA mouse skin multi-step tumorigenesis. Molecular Oncology. 4 (2), 119-125 (2010).
- Mantovani, A., Allavena, P., Sica, A., Balkwill, F. Cancer-related inflammation. Nature. 454 (7203), 436-444 (2008).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews. Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Hennings, L., et al. Malignant conversion and metastasis of mouse skin tumors: a comparison of SENCAR and CD-1 mice. Environmental Health Perspectives. 68, 69-74 (1986).
- Gómez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Ouhtit, A., Ananthaswamy, H. N. A model for UV-induction of skin cancer. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (1), 5-6 (2001).
- Day, C. -. P., Marchalik, R., Merlino, G., Michael, H. T. Mouse models of UV-induced melanoma: genetics, pathology, and clinical relevance. Laboratory Investigation. 97 (6), 698-705 (2017).
