Studera effekterna av Tumörutsöndras Paracrine ligander på Makrofagaktivering med hjälp av co-kultur med permeabla membran stöder
Summary
Här presenterar vi en metod med permeabla membran stöd för att underlätta studiet av icke-kontakt parakrin signalering används av tumörceller för att undertrycka immunförsvaret. Systemet är mottaglig för att studera rollen av tumör-utsöndras faktorer i dämpande makrofagaktivering.
Abstract
Tumör-derived parakrin signalering är en förbisedd del av lokal immunsuppression och kan leda till en tillåtande miljö för fortsatt cancer tillväxt och metastaser. Paracrine signaler kan innebära cell-cell kontakt mellan olika celltyper, såsom PD-L1 uttrycks på ytan av tumörer interagerar direkt med PD-1 på ytan av T-celler, eller utsöndring av ligander av en tumör cell för att påverka en immun cell. Här beskriver vi en co-Culture metod för att förhöra effekterna av tumör-utsöndras ligander på immunceller (makrofage) aktivering. Detta enkla förfarande utnyttjar kommersiellt tillgängliga 0,4 μm polykarbonat membran permeabla stöd och standard vävnad kultur plattor. I den beskrivna processen är makrofager odlade i övre kammaren och tumörceller i nedre kammaren. Närvaron av 0,4 μm barriären möjliggör studiet av intercellulära signalering utan confounding variabeln av fysisk kontakt, eftersom de två celltyperna delar samma medium och exponering för parakrin ligands. Denna metod kan kombineras med andra, såsom genetiska förändringar av makrofagen (t. ex. isolering från genetiska knock-out möss) eller tumör (t. ex., CRISPR-medierade förändringar) för att studera rollen av specifika utsöndras faktorer och receptorer. Metoden lämpar sig också för standardiserade molekylära biologiska analyser som kvantitativ omvänd Transkription av polymeras kedjereaktion (QRT-PCR) eller Western blot-analys, utan behov av flödes sortering för att separera de två cell populationerna. Enzymlänkade immunosorbent analyser (ELISAs) kan på samma sätt utnyttjas för att mäta utsöndras ligander för att bättre förstå den dynamiska interaktionen av cellsignalering i multipel celltyp kontext. Varaktigheten av medkulturen kan också varieras för studien av temporally reglerade händelser. Denna Co-Culture metod är ett robust verktyg som underlättar studiet av tumör-utsöndras signaler i immun sammanhang.
Introduction
Nyligen genomförda studier har fokuserat på förmågan hos cancerceller att undvika detektion av immunceller, undertrycka lokala immunförsvaret aktivering, eller att producera en tolerogena tumör-tillåtande miljö i tumören mikromiljö. Två breda klasser av tumör-och immun cells interaktioner har beskrivits som underlättar dessa effekter: kontaktmedierade interaktioner eller tumörutsöndras ligander. En av de mest välstuderade och kliniskt tractable mekanismerna för kontakt-medierad Immunhämning utnyttjas av tumörer är uttrycket av PD-L1, som interagerar med PD-1 på T-celler för att hämma deras aktivering och funktion1,2. Som svar på interferon-gamma (IFNγ), som uttrycks av ett antal aktiverade immunceller, tumörceller kan öka uttrycket av PD-L1 att inducera utmattning av PD-1 – uttrycker aktiverade T-celler, vilket hindrar dem från att effektivt utrota tumörceller3. Användning av antikroppar för att blockera interaktionen mellan PD-L1 och PD-1 används för närvarande för att behandla flera cancertyper hos människa4. Mot bakgrund av denna kliniska framgång och andra, identifiering och inriktning av tumör-derived immunsuppressiva mekanismer har fått ökad uppmärksamhet.
Bortom dämpning av adaptiv immunitet, tumörer är också kända för att utsöndra faktorer som undertrycka den pro-inflammatoriska reaktioner av medfödda immunceller. Tumör-derived eller tumör-inducerad sekret, inklusive Il-6, Il-10, VEGF, Il-23, och kolonin stimulerande faktor (CSF-1), har visat sig hämma antitumöreffekt svar av naturliga mördare (NK) celler, granulocyter, och dendritiska celler i tumören mikromiljö5,6,7. Tumörceller kan också utsöndra faktorer som skeva rekrytering och differentiering av myeloida-härledda celler i tumören mikromiljö att främja dämpning av T-cells aktivering8,9.
En typ av medfödda immunceller som har en djupgående effekt på tumörprogression är makrofagen. Under många år har närvaron av tumörassocierade makrofager (TAMs) använts som en negativ prognostisk av patientens överlevnad10. Konceptet att immunsuppressiva TAMs dämpa immun Cell-medierad clearance av tumörer infördes mer än 40 år sedan11. På senare tid har det visats att makrofage pro-inflammatorisk reaktion kan vara nedreglerad medan en Pro-tumör fenotyp kan induceras i tumören mikromiljö. Dessa immunsuppressiva makrofager kan bidra till en tolerogena svar, drivande tumör progression och resistens mot kemo-och immunterapi12. Med tanke på att makrofager är ofta en av de mest rikliga leukocyter med tumören, restaurering av deras tumör-specifika immun aktivitet representerar ett potentiellt mål för cancer Therapeutics13.
Medan kontakt-medierade interaktioner mellan tumörceller och makrofager kan modelleras genom direkt coculture, användning av permeabla membran stöd kan belysa vilka tumörutsöndrande faktorer är immunmodulerande utan potentiellt störande inverkan av tumör-immun cell-cell kontakt. Med något liknande metoder, andra har visat potentialen att identifiera utsöndras faktorer i mikroglia/neuronala interaktioner14 samt tumörceller med mesothelial celler15. Vi har också framgångsrikt använt denna Co-Culture teknik för att karakterisera rollen av en tumör-utsöndras protein, Pros1, som en suppressor av pro-inflammatorisk genuttryck efter stimulering av peritoneala makrofager med LP-skivor och interferon-gamma16. Här beskriver vi en enkel metod som kan användas för att förhöra hur tumör-utsöndras faktorer kan påverka makrofagaktivering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den Co-Culture assay presenteras här är en modifiering av tidigare etablerade analyser som gör det möjligt för studiet av tumör-utsöndras faktorer på immuncellernas aktivering. Medan cell-cell kontakt är känt för att framkalla förändringar i immunförsvaret, förmågan hos tumör-utsöndras ligander att modulera immunförsvaret aktiveringen är mindre väl förstått. Vi beskriver en metod som, till skillnad från direkt samodling, kan användas för att förhöra hur tumör-härledda utsöndrande faktorer p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Eric Ubil finansierades delvis av American Cancer Society postdoktor Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Arbetet stöddes av ett bidrag från NIH (R01-CA205398) och en Breast Cancer Research Foundation Award (BCRF-18-041) till HSE.
Materials
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer–response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
