Summary
כאן, אנו מתארים מצב גדילה לתרבות המשתנה המושבה הקטנה של הפסאודומונס aeruginosa. כמו כן, אנו מתארים שתי שיטות נפרדות לאיתור וכימות של הייצור המיוצר על ידי P. aeruginosa באמצעות חומצה אוראלה מסורתי בזולה ומעין נוגדן חד-שבטיים ספציפי קילוף פלסטיצידיות (mab) מבוסס אליסה.
Abstract
פסאודומונס aeruginosa, פתוגן שלילי גרם-שלילית, יכול לייצר יתר על כך התוצאה היא פנוטיפ ייחודי הנקרא מוסטיידי. Alginate מקושר זיהומים ריאה כרונית וכתוצאה מכך פרוגנוזה גרועה אצל חולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF). הבנת מסלולים כי לווסת את הייצור של קילוף פלסטיצידיות יכול לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות הרומן מיקוד היווצרות קילוף פלסטיצידיות. עוד פנוטיפ הקשורות למחלות הוא משתנה המושבה הקטנה (SCV). SCV הוא בשל הצמיחה האיטית של חיידקים, הקשורים לעתים קרובות עם עמידות מוגברת antimicrobials. במאמר זה, אנו הראשון להראות שיטה של culturing טופס מוגדר גנטית של P. aeruginosa scv בשל המוטציות הביוסינתזה של פיקנוmidine. תוספי בסיסים ניטרוני, אורציל או ציטוסין, מחזירה את הצמיחה הנורמלית למוטציות אלה, הפגנת נוכחות של מסלול הצלה הscavenges בסיסים חינם מהסביבה. לאחר מכן, אנו דנים בשתי שיטות למדידת האלגיאט חיידקי. השיטה הראשונה מסתמכת על ההידרוליזה של הפוליסכד לתוך החומצה האוריונית שלה ולאחריו בעקבות השפעת מגיב כרומוגניים, קרזולה, בעוד השיטה השנייה משתמשת ב-אליסה בהתבסס על מסחרית זמין, alginate ספציפי ספציפיים. שתי השיטות דורשות עקומה סטנדרטית לכימות. כמו כן, אנו מראים כי השיטה החיסונית היא ספציפית לכמת וניתן להשתמש בה למדידת האלגיאט בדגימות הקליניות.
Introduction
דלקות ריאות כרוניות עם הפסאודומונס aeruginosa הם הגורם העיקרי של תחלואה ותמותה אצל חולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF). במהלך הילדות המוקדמת, חולים הם הכובש על ידי פתוגנים חיידקיים מרובים כולל מבודד nonmucoid של P. aeruginosa1,2. הופעתה של משתנה מושבה קטנה (SCV) מבודד, כמו גם mucoid מבודד הוא סמן עבור התחלתה של זיהומים כרוניים. מבודד SCV הם עמידים בפני סמים3 בשל שיעורי צמיחה איטית שלהם4, אשר מספקת להם הרתעה חמורה בחטיבות הטיפול וזיהומים כרוניים אחרים5 על ידי P. aeruginosa. העבודה על ידי Al אחמר ואח '6 הראה קשר בין scv ו-mucoidy מקושר על ידי הביוסינתזה דה נובו pyriine. פירימידין הרעב, בשל מוטציות בגנים המעורבים בייצור פירימידין, הביא את scv פניטיפ ב ההפניה nonmucoid התייחסות PAO1 ואת הנגזרת mucoid, PAO581 (PAO1mucA25).
אף-על-פי ייצור יתר של קילוף פלסטיצידיות הוא סמן מחלה חשובה עבור זיהומים ריאה כרונית ב-CF, לא ברור אם יש קורלציה ישירה בין כמות קילוף פלסטיצידיות פתולוגיה ריאות, וזה לא ברור אם קילוף פלסטיצידיות ניתן להשתמש כסמן פרוגנוזה לטיפול7. הייצור alginate מוסדר בעיקר על ידי שני operons, מעבד רגולציה (algumucabcd)8,9 ו הביו סינתטי המבצע (algd operons)10,11. הייצור alginate מוסדר בחוזקה על ידי פקטור סיגמא algu9,12 (הידוע גם בשם algt) והשפלה של הגורם האנטי סיגמא מוקה13. היכולת לפקח על ייצור קילוף פלסטיצידיות באתרו של המטופלים ' הרוק דגימות יכול לסייע בפיתוח של אפשרויות טיפוליות הרומן.
כאן, אנו מתארים מצב גדילה המזהה את נוכחותו של scv הנגרמת על ידי מוטציות שאינן יכולות לסנתז את פירימידין דה נובו. תוספת של אורציל ו/או ציטוסינוס, בסיס ניטרוגליצרין של פירימידין נוקלאוטיד, למדיום מפעיל את מסלול ההצלה, ובכך לשקם את הצמיחה הנורמלית של המוטציות. זו שיטת הצמיחה עבור אלה מוטציות scv ספציפיות ניתן להשתמש כשיטת הקרנה כדי לזהות מוטציות פירימידין בדגימות החולה. בנוסף, אנו דנים בשתי שיטות לאיתור ומדידה של קילוף פלסטיצידיות המיוצר ומופרש על ידי P. aeruginosa. הראשונה היא השיטה המסורתית14,15,16 משפילה את הפוליסכד באמצעות ריכוז גבוה של חומצה ולאחר מכן הוספת מחוון הצביעה כדי לכמת את הריכוז במדגם. השיטה השנייה, שפותחה במעבדה שלנו, מנצלת את היישום החיסוני הקשור לאנזימים (אליסה) באמצעות נוגדן חד-שבטיים אנטי-אלגיאט (mAb) שפותח על ידי QED ביולוגיה. השיטה אליסה מוכיחה להיות ספציפי יותר ורגיש יותר מאשר שיטת חומצה אוראונית ומאפשר שימוש בטוח יותר בשל הימנעות של חומצה גופרתית מרוכזת מאוד. עם היכולת של ה-אליסה לשמש ישירות על דגימות החולה רוק למדוד קילוף פלסטיצידיות, זה יכול להיות מפותח ככלי אבחון ניטור לעקוב אחר כמות קילוף פלסטיצידיות נוכח הריאות בתקופות שונות של הזיהום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תנאי צמיחה SCV והפעלה פיזיולוגית של מסלול ההצלה
- זיהוי של SCV.
- פס הזנים P. aeruginosa PAO1, PAO1Δpyrd, PAO581, ו PAO581Δpyrd על מקדם התחממות דודימונס בידוד (PIA) צלחות לגדול ב 37 ° c עבור 48 h. על לוחית הצמיחה לזהות בודד מושבה אחת כי יש את SCV הפנוטיפ (גודל המושבה 1-3 מ"מ בניגוד לגודל הרגיל 3-5 מ"מ המושבה).
- חזור על שלב 1.1.1 כדי לקבל לבודד טהור של SCV.
הערה: הצמיחה עשויה לדרוש עד 72 h בשל קצב הצמיחה האיטי של מושבות SCV.
- הפעלה פיזיולוגית. של מסלול ההצלה
- באמצעות לולאה החיסון סטרילי, לבחור את המושבה SCV מן הצלחת PIA ואת הרצף על מחומם מראש בתוספת עם 0.1 mM של uracil. הגדל צלחת ב 37 ° c עבור 24 עד 48 שעות.
הערה: כל לוחיות ה-PIA המשמשות בפרוטוקול זה מכילות 20 מ"ל/L של גליצרול שנוספו לתערובת לפני השימוש באוטוקלינג. לאחר שטמפרטורת התערובת היא מתחת 55 ° c להוסיף 11.21 mg/L של אורציל (0.1 מ"מ) למדיה הנוזלית לפני שפיכת צלחות. שיטה זו תסייע לזהות מוטציות פירימידין שגורמות scv הפנוטיפים ב P. aeruginosa. אם הפנווי scv הוא תוצאה של המוטציה אמר, אז צמיחה המושבה נורמלי גודל (3 על 5 מ"מ) היה נצפה על אורציל שיושלם לוחיות ה-PIA. אם הזנים היו היכולת לייצר alginate, אז הפנוטיפים mucoid יהיה גם לחזור על תוספת אורציל.
- באמצעות לולאה החיסון סטרילי, לבחור את המושבה SCV מן הצלחת PIA ואת הרצף על מחומם מראש בתוספת עם 0.1 mM של uracil. הגדל צלחת ב 37 ° c עבור 24 עד 48 שעות.
2. חומצה אוררונית שיטת קרזולה
- מתרבות טהורה של זן רצוי להיבדק, לזהות מושבה אחת. באמצעות קיסם סטרילי, לבחור את המושבה, ומניחים את קיסם בצינור בדיקת התרבות המכילה 5 מ ל של מרק בידוד פסבדו (pib). לגדול בחממה בייקר ב 37 ° c עבור 24 שעות.
הערה: הזנים הבאים PAO581 (PAO1mucA25), PAO581קארה, PAO581פחמימות, ו PAO581pyrd גדלו על לוחות pia או לוחות pia שיושלם עם 0.1 mM אורציל לקצור את קילוף פלסטיצידיות למדידה. - על הצלחת להוסיף מחמם לוחית הוספה 150 μL של ציר PIB מתורבת (עבור 15 מ"מ x 100 מ"מ לוחות) או 450 μL של ציר (עבור 15 מ"מ x 150 מ"מ לוחות). , בעזרת מכשיר הטלפון הסטרילי. הפיצו את הציר מעל לצלחת לגדל את הצלחת ב 37 ° c עבור 24 שעות.
הערה: כאשר משתמשים בנוזל עודף, אם בכלל, מלוחית השימוש בחיית מחמד, מפנה את הצלחת לצד אחד. שני הצלחות pib ו-PIA המשמשות בפרוטוקול מכילות 20 מ ל/L של גליצרול כדי לשמש תאים כמקור פחמן כדי לסייע בייצור קילוף פלסטיצידיות. - באמצעות בקר הפיפטה והפיפטה 50 mL סטרילי, להוסיף 0.85% כנגד הדשא גדל לאסוף את המדגם על ידי הפחתת הצלחת באמצעות spreader תא. מחית את המדגם באמצעות טריים 50 mL pipet לתוך צינור האוסף 50 mL. מערבולת המדגם על גבוה לערבב ולמקם את הדגימות על הקרח.
הערה: נפח הוספת 0.85% משתנה בהתאם לגודל הלוחית. ללוחות של 15 מ"מ x 100 מ"מ, השתמשו ב-10 מ ל, ובמשך 15 מ"מ x 150 מ"מ לוחות, השתמשו ב-20-50 mL. - למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) של דגימות על ידי הוספת 1 mL של המדגם לקובט חד פעמיות לקרוא את OD באמצעות ספקטרוסקופיה. חזור על שלב זה 2x כדי לקבל שלישיה של קריאות עבור כל דוגמה.
- להוסיף 3 מ ל של חומצה גופרתית/הפתרון borate לתוך צינורות התרבות ולתת לשבת על קרח. הוסף 350 μL של המדגם שנאסף לאט לתערובת חומצה בצינורות הבדיקה מערבולת על נמוך בקצרה.
- להכין מלאי בוראט על ידי הוספת 10.099 g של אשלגן הידרוקסידי (KOH) אבקה ל 45 mL של מים. הוסף 24.74 גרם של חומצה חומצת (H3בו3) לתערובת ולהביא נפח 100 mL.
- מניחים 1 L בקבוק בכיור עם קרח ובקבוק מילוי עם 500 mL של חומצה גופרתית מרוכזת. באיטיות להוסיף 15 מ ל של מלאי בוראט מוכן. אפשר לבקבוק להתקרר.
- הוסף עוד 10 מ"ל של מלאי בוראט עבור סך של 25 מ ל. ברגע שהבקבוק מקורר, הביאו את הכרך ל-1 ל'.
התראה: שיטה זו נשענת על שימוש בחומצה גופרתית מרוכזת מאוד. ציוד הגנה אישי תקין יש להשתמש כדי להבטיח את הבטיחות ואת הפרוטוקול סילוק הנכון של המדגם צריך לעקוב.
הערה: עבור שליטה חיובית ריכוז ידוע של חומצה D-mannuronic ו/או דגימות בקטריאלי הידוע החיידקי שנקטפו ומטוהר באמצעות קילוף פלסטיצידיות הפקת זנים של P. aeruginosa (למשל: PAO581-PAO1mucA25). עבור שליטה שלילית להשתמש 0.85% הפתרון הירי ו/או PAO1ΔAlgd (בתוך מסגרת מחיקה של גן algd המעבדת את החיידקים לחלוטין לא מסוגל לייצר alginate). צינורות מרובים יכולים להתבצע מכל מדגם כדי להגדיל את מספר חוזר טכני כדי לסייע בניתוח סטטיסטי. מכינים 3-5 שפופרות של כל דגם.
- הוסף 100 μL של 0.1% carבזולה בתמיסה אתנול ל חומצה/מיקס לדוגמה. קאפ את הצינור ואת מערבולת על הגדרה בינונית עבור 5 s. מניחים באמבט יבש ב 55 ° c עבור 30 דקות.
- לאחר הדגירה, להסיר את הצינורות ומערבולת בקצרה על גבוה ולאפשר קריר עבור 5 דקות.
הערה: צבע להיראות יהיה גוון של סגול. הצבע יישאר יציב למדידה של 1 עד 2 שעות. - קרא את OD530 של כל צינור על ידי הוספת 1 מ ל התערובת קובט נקי לקרוא את OD של דגימות ב 530 ננומטר על ספקטרוסקופיה. השתמש בצינור עם 0.85% הנאל כריק לספקטרוסקופיה.
- להכין עיקול רגיל על ידי מדידת OD530 של הריכוזים הסידוריים של ריכוזי המכונה D-mannuronic (1,024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml, ו-8 μg/ml). חזור על 2x. חלץ משוואה ליניארית מקריאות אלה.
הערה: עקומת התקן צריכה להתבצע רק פעם אחת. ניתן להשתמש במשוואה הליניארית שחולצו ממנה לבדיקה מאוחרת יותר.- לחשב את ריכוז קילוף פלסטיצידיות בכל מדגם באמצעות עקומת סטנדרטי לחלק את הריכוז קילוף פלסטיצידיות ממשוואה לינארית על ידי OD600 כדי לקבל את הסכום הכולל של קילוף פלסטיצידיות לכל OD600.
3. אליסה למען אלגיאט ככמת
- חזור על שלבים 2.1-2.4 כדי לקבל דגימות עבור מדידת קילוף פלסטיצידיות.
הערה: זנים המשמשים היו PAO1, PAO1ΔAlgd, ו PAO1 נושאים PHERD20T-algd. - באמצעות מיקרופיפטה להוסיף 50 μL של המדגם שנאסף לצלחת 96 מטופל-טוב. הוסף 50 μL של מאגר ציפוי (פחמתי/ביקרבונט מאגר pH 9.6) לבארות. מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור 2 h.
הערה: עבור שליטה חיובית, ריכוז ידוע של חומצה D-mannuronic ו/או קילוף פלסטיצידיות יציבה ידוע לייצר זן (למשל: PAO581-PAO1mucA25) ניתן להשתמש. עבור שליטה שלילית להשתמש 0.85% הפתרון הירי ו/או PAO1ΔAlgd (בתוך מסגרת מחיקה Of algd גן מעבד את החיידקים לחלוטין לא מסוגל לייצר כל alginate). ניתן לבצע מספר בארות מכל מדגם כדי להגדיל את מספר החזרות הטכניות לסיוע בניתוח סטטיסטי. הכן 3-5 בארות של כל דגם. - באמצעות בקבוק המים, לשטוף את הצלחת בארות 2x עם מלח 1 x פוספט מאגר (PBS) עם 0.05% רצף 20 (PBS-T) על ידי מילוי הבארות, ולאחר מכן מרוקן אותם על ידי היפוך הצלחת מעל.
- באמצעות מיקרופיפטה להוסיף 200 μL של חסימת מאגר (10% חלב רזה ב-PBS-T) לבארות. מודטה ב -4 ° c ללילה.
הערה: לעטוף את הצלחת בסרט פרפין או לכווץ לעטוף כדי למנוע התאיידות כלשהי במקרר. - באמצעות בקבוק המים לשטוף את הצלחת בארות 2x עם PBS-T על ידי מילוי הבארות, ולאחר מכן מרוקן אותם על ידי היפוך צלחת מעל.
- באמצעות מיקרופיפטה להוסיף 100 μL של הנוגדן העיקרי מדולל (העכבר נגד alginate נוגדן חד שבטיים) כדי בארות ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 1-2 על h.
הערה: הנוגדן העיקרי (עכבר נגד alginate נוגדן חד שבטיים) סופק בריכוז של 0.5 μg/mL (דילול של 1:2000 של 1 מ"ג/mL מניות) בתמיסה דילול הנוגדן (1% חלב רזה ב-1x PBS). - באמצעות בקבוק המים לשטוף את בארות הצלחת 3x עם PBS-T על ידי מילוי הבארות, ולאחר מכן מרוקן אותם על ידי היפוך צלחת מעל.
- באמצעות מיקרופיפטה להוסיף 100 μL של נוגדן משני מדולל לבארות ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 1-2 h.
הערה: הנוגדן המשני המשמש היה לנקב עז לנגד עכבר הנוגדן פולי-HRP לריכוז של 0.25 μg/mL (דילול של 1:2000 של 0.5 mg/mL מניות) בפתרון מדלל נוגדן. - באמצעות בקבוק המים לשטוף את בארות הצלחת 3x עם PBS-T על ידי מילוי הבארות, ולאחר מכן מרוקן אותם על ידי היפוך צלחת מעל.
- באמצעות מיקרופיפטה, הוסף 100 μL של פתרון TMB-אליסה (טבלת חומרים) ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות בחושך.
הערה: הצבע של תגובה חיובית יהיה גוון של כחול. - באמצעות מיקרופיפטה, הוסף 100 μL של פתרון עצירה (2 N חומצה גופרתית).
הערה: הצבע יהפוך מכחול לצהוב לאחר הוספת פתרון העצירה. צבע יציב עד 30 דקות לאחר התגובה היא נעצרה. - באמצעות קורא צלחת, לקרוא את ה-OD ב 450 nm.
- לייצר עקומה סטנדרטית על ידי מדידת OD450 של מדלל סדרתי של ריכוזים ידועים של חומצה D-mannuronic (1,024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml, ו-8 μg/ml). חזור על 2x. מקריאות אלה מחלצים משוואה קווית.
הערה: העקומה הסטנדרטית צריכה להתבצע רק פעם אחת. ניתן להשתמש במשוואה הליניארית שחולצו ממנה לבדיקה מאוחרת יותר.- לחשב את ריכוז קילוף פלסטיצידיות בכל מדגם באמצעות עקומת סטנדרטי לחלק את הריכוז קילוף פלסטיצידיות ממשוואה לינארית על ידי OD600 כדי לקבל את הסכום הכולל של קילוף פלסטיצידיות לכל OD600.
4. אנליזה סטטיסטית של מדידת אלגיאט
- בגליון תוכנה גרפי, הגדר עמודה עם המשוואה הליניארית הנגזרת מהעקומה הסטנדרטית. הגדר את תוצאות ציר y כריכוז קילוף פלסטיצידיות ואת התוצאות ציר ה-x כמו od530 עבור שיטת חומצה uronic ו-od450 עבור אליסה כדי לקבל את ריכוזי קילוף פלסטיצידיות בכל מדגם.
- כדי לנרמל את כמות קילוף פלסטיצידיות בכל מדגם על הסכום עבור 5.5 x108 cfu/mL (1 OD600), לחלק את הריכוז של כל מדגם שהושג לעיל על ידי ההתאמה OD600 ערך. אם מספר OD600 נמדדו עבור כל דוגמה, לחלק על ידי ממוצע od600.
- בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה סטטיסטית מועדפת (למשל, גראפד פריזמה 7.02).
- פתח את התוכנה. בחר עמודה תחת טבלה חדשה & Graph ובחר בערכת נתוני ANOVA חד כיוון.
- שם כל עמודה עם המתח נבדק ולהוסיף את ריכוזי קילוף פלסטיצידיות מתחת.
- לאחר הזנת כל הנתונים לחץ על לנתח בתפריט העליון. פעולה זו תפתח חלון הגדרות ניתוח. בחר את הפרמטרים המתאימים לבדיקה וציין אם יש צורך להפעיל השוואות מרובות.
הערה: לאחר ניתוח ערכת הנתונים תכיל ערך p שיסייע לקבוע את המשמעות הסטטיסטית של הנתונים. הנתונים ייחשבו משמעותיים מבחינה סטטיסטית אם ערך p הוא קטן מהערך set α (בדרך כלל α ערך מוגדר עבור p < 0.01). - תחת הכרטיסייה ' גרף ', בחרו בסוג התרשים של המייצג . פעולה זו תרשים באופן אוטומטי את הנתונים עם הכותרת המצוינת מגליון הנתונים של הקלט. ציין משמעות סטטיסטית של הנתונים בהתאם לצורך על-ידי הצגת הסימן * הנמצא מעל קווי חיבור בין פסי הריבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג צלחות של PAO1 ו PAO581 עם או בלי מחיקה מסגרת ב- pyrd גן (גן בשביל הביוסינתזה פירימידין) שתוצאתו scv6. המוטציה scv PAO1 שוחזר לצמיחה נורמלית בתגובה לתוספת אורציל (איור 1א, ב). יתר על כן, המוטציה scv PAO581Δpyrdהוחזרה מוליידי עם הטיפול אורציל אותו, כי זן אב PAO581 יש מוטציה mucA25 נוספת (איור 1ג, ד). התוצאות של השפעת החומצה האוריונית בזולה מוצגות באיור 26. הנתונים מייצגים דגימות של PAO581 ו PAO581 עם מוטציות בגנים ויסות פירימידין דה נובו ביוסינתזה גדל על pia ו pia בתוספת עם 0.1 mM של אורציל (איור 2א). הנתונים מראים כי הנוכחות של אורציל בתקשורת גורמת להמרה של זן מוטציה חזרה מודדיה (כפי שנראה על ידי הגדלת/שוחזר הייצור קילוף פלסטיצידיות) (איור 2ב). התוצאות של אנטי-alginate נוגדן חד שבטיים מבוסס אליסה מיוצגים באיור 3. הנתונים מראה PAO1, PAO1 עם מחיקה in-מסגרת של הגן algd קידוד ביולוגי קילוף פלסטיצידיות האנזים הביוסינתטי מנוז-mandease, ו PAO1 נושאת ביטוי פלבין pHERD20T עם העיקרי קילוף פלסטיצידיות הספציפי סיגמא פקטור algd כאשר גדל על צלחות PIA עם אראבינוז עבור אינדוקציה pbad המקדם ב pHERD20T. נתונים אלה מראים את רמות הלא mucoid של קילוף פלסטיצידיות נמדד עבור PAO1, ו PAO1Δalgd לעומת רמות mucoid של קילוף פלסטיצידיות נמדד עבור PAO1 +pHERD20T-algu. איור 4 משווה את שתי השיטות של מדידות מאלגיאט יחד. התוצאות לא היו משמעותיות מבחינה סטטיסטית בהשוואה לזה באמצעות ANOVA דו כיוון עם p < 0.01. איור 5A משווה את החוצה פעילות מחודשת של אנטי Alginate mab נגד פוליסכדים אחרים כולל עמילופקטין, עמיל, קולגן, ו גליקוגן. איור 5ב מראה את ההשוואה בפירוט וברגישות של החומצה האוריונית בעלת הסדר החדש נגד קילוף פלסטיצידיות נוגדנים מבוססי נוגדן מבוסס-דיאגנוסטיקה עם השליטה ניצול אצות מאוד מטוהרים קילוף פלסטיצידיות (טבלת חומרים). איור 6 מראה בדיקה ישירה של ה-אליסה בדוגמאות לרוק המטופלים שהיו חיוביות עבור mucoid p. aeruginosa וחולים שלא מכילים mucoid p. aeruginosa.
איור 1: תמונות מייצגות של מוטציות הביוסינתזה של דה נובו פירימידין הנובעות scv פניטיפ ב PAO1 ו PAO581. התמונה מציגה PAO1 (שמאל) ו PAO1Δpyrd (מימין) על לוחות pia (A) ו PIA לוחות בתוספת אורציל (ב) גדל ב 37 ° c עבור 48 h. תמונה מראה PAO581 (משמאל) ו PAO581Δpyrd (מימין) על לוחות pia (C) ו-PIA עם אורציל (ד) גדל 48 37 ב איור זה שונה מהעבודה שנעשתה על ידי Al אחמר et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: גרף מייצג של חומצה אוראלה בזותית. (א) התמונה של מmucoid P. aeruginosa זן PAO581 (PAO1mucA25) גדל ב 37 ° c עבור 24 שעות על לוחות pia (שמאל) ולוחות pia עם אורציל (מימין). (ב) alginate הפקה עבור PAO581, PAO581קארה, PAO581פחמימות, ו PAO581pyrd כאשר גדלו על לוחות PIA עם וללא אורציל ב 37 ° c עבור 24 h. alginate נאסף ונמדד באמצעות שיטת בזולה סטנדרטי. ערכים המוצגים הינם משמעות לסטייה של ± סטיית התקן של קריאות שלישיה. (* * * * = p < 0.0001). איור זה שונה מהעבודה שנעשתה על ידי Al אחמר et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: גרף הנציג של אנטי-alginate מבוסס על מבוססי אליסה. Alginate הייצור עבור PAO1, PAO1Δalgd ו PAO1 נושאת את הביטוי וקטור pHERD20T-algu גדל ב-PIA עם 0.1% אראבינוז ב 37 ° צ' עבור 24 h. alginate נאסף ונמדד באמצעות אנטי alginate אליסה עם העכבר נגד alginate נוגדן חד שבטיים. ערכים המוצגים הינם משמעות לסטייה של ± סטיית התקן של קריאות שלישיה. p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואה בין התוצאות שהתקבלו מתוך שיטת החומצה uronic ואנטי alginate mAb מבוססי אליסה. ייצור אלגיאט מחמישה מוצרים שונים P. aeruginosa זנים קנייניים גדל על לוחיות ה-PIA ב 37 ° c עבור 24 h. alginate נאסף ונמדד על ידי שיטת החומצה uronic ואנטי ALGINATE אליסה. ערכים המוצגים הינם משמעות לסטייה של ± סטיית התקן של קריאות שלישיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הספציפיות והרגישות של האנטי-alginate mAb המבוסס אליסה בהשוואה ל חומצה uronic שיטת קרזולה. (א) אליסה היתה לרוץ עם גבוה (800 μg/ml) נמוך (100 μg/ml) שליטה פנימית של האצות alginate. קילוף פלסטיצידיות זה שימש גם כסטנדרט עבור אליסה. אחרים נבדק שעלולים לחצות את התגובה עם אנטי-alginate mAb היו עמילופקטין, עמיפסיד, קולגן, ו גליקוגן (500 μg/mL כל אחד). (ב) חומצה אוראלה בזולה ושיטת אליסה היו מופעל באמצעות אותו טווח של ריכוזים סטנדרטיים עם אצות alginate: 50 μg/ml, 5 μg/ml, 1 Μg/ml, 0.5 Μg/ml, 0.1 Μg/ml, ו0.05 Μg/ml. ערכים המוצגים הינם משמעות לסטייה של ± סטיית התקן של קריאות שלישיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: בדיקות ישירות לדוגמה לחולה. נגד alginate אליסה נבדק על דגימות ליחה של המטופלים ללא הצמיחה הקודמת על צלחות. שלושה דוגמאות לרוק CF כי היה גידול של P. aeruginosa שימשו כמו גם שתי דגימות החולה המטופל שהכיל או לא mucoid P. aeruginosa (שלילי 1) או לא הצמיחה p. aeruginosa (שלילי 2). ערכים המוצגים הינם משמעות לסטייה של ± סטיית התקן של קריאות שלישיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שניהם scv ו קילוף פלסטיצידיות הם סמנים חשובים מחלות מעורבים זיהומים כרוניים מספר. לכן, את היכולת לגדל scv, כמו גם ללמוד את התקנה וייצור של קילוף פלסטיצידיות על ידי P. aeruginosa הוא אינטגרלי לגילוי של טיפולים חדשניים למחלות כרוניות אלה.
זנים SCV הם לשמצה קשה לגדול עקב שיעור הצמיחה האיטית שלהם4 לעומת זנים אחרים P. aeruginosa , אשר מסייע התנגדות מיקרוביאלית שלהם3. העבודה שלנו מזהה צורה מסוימת של P. aeruginosa scv כי הם תוצאה של מוטציות בביוסינתזה דה נובו פירימידין. כאן, אנו דנים מצב גדילה עבור scv כזה כדי לחזור לפנוטיפ הצמיחה נורמלי כאשר נוקלאוטיל אורציל מסופק. עם זאת, כאשר התווספה שופט/UTP למדיום, הגדילה הפגומה לא שוחזרה (הנתונים אינם מוצגים). את הporin (s) אחראי על הסלקטיביות הזאת צריך ללמוד עוד. תוספי התקשורת הצמיחה עם אורציל בסיוע להקלה על הלחץ הנגרם מרעב פירימידין (איור 1). באופן דומה, הוספת ציטוסינוס חופשי לתקשורת באותה שיטה של תוספת של uracil, סייעה בהקלה של הרעבה פירימידין (נתונים לא מוצגים). שניהם אורציל חינם, ציטוסין חינם במדיה להיכנס לתאים ולעזור להחזיר את הרמות הנורמליות של uridine (שופט) ו uridine tri-פוספט (utp)6 בתא, אשר כיצד scv מבודד להחזירה חזרה לצמיחה נורמלית.
מספר שלבים קריטיים עבור מדידות קילוף פלסטיצידיות קיימים שעשויים לסייע ביכולת התוכונות של התוצאות. בתחילה את הדגימות, לאחר הגרט מן הצלחות, חייב להישאר על הקרח כדי לעזור לחסום את ההשפלה של קילוף פלסטיצידיות במדגם ולגרום לריכוזים נמוכים יותר. בנוסף, לפני OD600 מדידות, חשוב לערבב ביסודיות את המדגם כדי לקבל פתרון הומוגנית כמו הגושים לעשות בדגימות כי ישבו זמן מה, כי עלול להפריע למדידה OD ובכך עם חישובי הריכוז הסופי. בעת שימוש בשיטה אליסה, דגימות מלוחות הצמיחה עשוי להיות מדולל במיוחד בעת שימוש בזנים המייצרים כמות גדולה של קילוף פלסטיצידיות מאז התוצאות עשויות להיות מחוץ לטווח עקום רגיל. בעת שימוש בחומצה uronic, מערבולת ביסודיות את צינורות התרבות לאחר תוספת של קרזולה ואחרי הדגירה כדי להבטיח דגימה הומוגנית. כשעובדים עם שיטת החומצה האוריונית, חשוב לנהוג בזהירות בעת טיפול בתערובת החומצה ולהיפטר מהדגימות כראוי.
השיטה המסורתית של מדידה הדורשת הידרוליזה חומצה של קילוף פלסטיצידיות תיאר לעיל הראו פוטנציאל גדול כבר מנוצל על ידי חוקרים רבים במשך כמה שנים. בעבודה זו, אנו מראים את ההליך של הטיפול המסורתי יחד עם מפתח ב-הבית אליסה באמצעות נוגדן אנטי-alginate מונבטיים. נוגדנים אלה פותחו בעכברים והוא יכול לזהות קילוף פלסטיצידיות ב עדיין להיות מזוהה אפירופה. הספציפיות של שיטת ה-אליסה נבדקה ביסודיות כנגד אלגיאט מ -P. aerginosa וכן מאצות ים. יתר על כן, אליסה היתה דומה לתוך שיטת החומצה האוריונית בקוונט קילוף פלסטיצידיות בדגימות חיידקי נבדק (איור 3). בנוסף, הוא נבדק נגד פוליסכדים אחרים שעלולים לגרום לתוצאות חיוביות כוזבות. העבודה שלנו הראתה ספציפיות גבוה של הנוגדן כדי קילוף פלסטיצידיות ואת היכולת שלה להבחין בין קילוף פלסטיצידיות ושאר פוליסכדים נבדק (איור 5א). הפרוטוקול אליסה יש רגישות גבוהה יותר לעומת הטיפול האויוני חומצה (איור 5ב) מאז הצלחנו לזהות רמות מעקב של קילוף פלסטיצידיות באמצעות אליסה כי לא זוהו באמצעות שיטת חומצה uronic כאשר בדיקת החולה לבדוק דגימות (איור 6). השיטה אליסה ניתן להתאים עבור במדידה vivo של קילוף פלסטיצידיות של המטופלים (איור 6). הן תנאי הצמיחה באמצעות תוספת אורציל, כמו גם אליסה שפותחה לאחרונה יהיה כלים רבי עוצמה בהבנה טובה יותר P. aeruginosa פתוגנזה ב CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר Hongwei D. Yu הוא קצין המדע הראשי ומייסד שותף של Progenesis טכנולוגיות, LLC.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקים R44GM113545 ו P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C.
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
