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Immunology and Infection

स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के स्मॉल कॉलोनी संस्करण की संस्कृति और इसके अल्गिनेट की मात्रा

Published: February 22, 2020 doi: 10.3791/60466
Automatic Translation
*1, *2, 1,2,3
1Department of Biomedical Sciences, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University, 2Progenesis Technologies LLC, Robert C. Byrd Biotechnology Science Center, 3Department of Pediatrics, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम स्यूडोमोनास एरुजिनोसाके छोटे कॉलोनी संस्करण को संस्कृति के लिए एक विकास की स्थिति का वर्णन करते हैं। हम एक पारंपरिक मूत्र एसिड कार्बाजोल परख और एक अल्गिनेट-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) आधारित एलिसा का उपयोग करके पी एरुगिनोसा द्वारा उत्पादित एक्सोपोलिसाकहारीड अल्गिनेट का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए दो अलग-अलग तरीकों का भी वर्णन करते हैं।

Abstract

एक अवसरवादी ग्राम-नकारात्मक जीवाणु रोगजनक, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,एक एक्सोपोलिसारिड अल्गिनेट का उत्पादन कर सकता है जिसके परिणामस्वरूप म्यूकोइडी नामक एक अद्वितीय फेनोटाइप होता है। अल्जिनेट को पुराने फेफड़ों के संक्रमण से जोड़ा जाता है जिसके परिणामस्वरूप सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) के रोगियों में खराब पूर्वानुमान होता है। अल्जीनेट के उत्पादन को विनियमित करने वाले रास्तों को समझना अल्जीनेट गठन को लक्षित करने वाली उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में सहायता कर सकता है। एक अन्य रोग से संबंधित फेनोटाइप स्मॉल कॉलोनी वैरिएंट (एससीवी) है। एससीवी बैक्टीरिया की धीमी वृद्धि के कारण है और अक्सर रोगाणुरोधी के प्रतिरोध में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है। इस पेपर में, हम पहले पाइरिमिडीन बायोसिंथेसिस म्यूटेशन के कारण पी एरुजिनोसा एससीवी के आनुवंशिक रूप से परिभाषित रूप को समेटा करने की एक विधि दिखाते हैं। नाइट्रोजनवाले ठिकानों, यूसिल या साइटोसाइन का पूरक, इन म्यूटेंट को सामान्य विकास देता है, जो पर्यावरण से मुक्त ठिकानों की सफाई करने वाले एक उबार मार्ग की उपस्थिति का प्रदर्शन करता है। इसके बाद, हम बैक्टीरियल अल्गिनेट के माप के लिए दो तरीकों पर चर्चा करते हैं। पहली विधि पॉलीसैकराइड के हाइड्रोलिसिस पर निर्भर करती है, जिसके बाद क्रोमोजेनिक रिएजेंट, कार्बाजोल के साथ व्युत्पन्न होता है, जबकि दूसरी विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, अल्गिनेट-विशिष्ट मैब के आधार पर एलिसा का उपयोग करती है। दोनों तरीकों को मात्रा के लिए एक मानक वक्र की आवश्यकता होती है। हम यह भी बताते हैं कि इम्यूनोलॉजिकल विधि अल्जिनेट क्वांटिफिकेशन के लिए विशिष्ट है और इसका उपयोग नैदानिक नमूनों में अल्जीनेट की माप के लिए किया जा सकता है।

Introduction

स्यूडोमोनास एरुजिनोसा के साथ क्रोनिक फेफड़ों के संक्रमण सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) के रोगियों में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण हैं। बचपन के दौरान, रोगियों को कई जीवाणु रोगजनकों द्वारा उपनिवेश किया जाता है जिसमें पी एरुजिनोसा1,2के नॉनम्यूकोइड आइसोलेट्स शामिल होते हैं। छोटे कॉलोनी संस्करण (एससीवी) का उद्भव अलग-थलग होजाता है और साथ ही म्यूकोइड आइसोलेट्स पुराने संक्रमणों की शुरुआत के लिए एक मार्कर है। एससीवी आइसोलेट्स उनकी धीमी वृद्धि दर4के कारण अत्यधिक दवा प्रतिरोधी3 हैं, जो उन्हें उपचार रेजिमेंटों और अन्य पुराने संक्रमणों में गंभीर निवारक प्रदान करता है5 पी एरुजिनोसाद्वारा। अल अहमर एट अल.6 द्वारा काम ने डी नोवो पायरिमिडीन बायोसिंथेसिस से जुड़े एससीवी और म्यूकोइडी के बीच एक लिंक दिखाया। पाइरिमिडीन भुखमरी, पाइरिमिडीन उत्पादन के साथ शामिल जीन में उत्परिवर्तन के कारण, नॉनम्यूकोइड संदर्भ तनाव PAO1 और म्यूकोइड डेरिवेटिव, PAO581 (PAO1mucA25) में एससीवी फेनोटाइप के परिणामस्वरूप ।

हालांकि अल्जीनेट ओवरप्रोडक्शन सीएफ में पुराने फेफड़ों के संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण रोग मार्कर है, यह स्पष्ट नहीं है कि अल्जीनेट और फेफड़ों की विकृति की मात्रा के बीच सीधा संबंध है या नहीं, और यह स्पष्ट नहीं है कि अल्जीनेट का उपयोग उपचार7के लिए पूर्वानुमान मार्कर के रूप में किया जा सकता है या नहीं। अल्जिनेट उत्पादन मुख्य रूप से दो ऑपरन, एक नियामक ऑपरन(एल्गुमुक्कएबीसीड)8,9 और बायोसिंथेटिक ऑपरन(एल्गडी ऑपरन)10,11द्वारा विनियमित किया जाता है। अल्गिनेट उत्पादन को सिग्मा फैक्टर अल्ग्लू9,12 (जिसे एल्गटी के नाम से भी जाना जाता है) और सिग्मा विरोधी कारक मुका13के क्षरण द्वारा कसकर विनियमित किया जाता है। रोगियों के थूक नमूनों से सीटू में अल्गिनेट के उत्पादन की निगरानी करने की क्षमता उपन्यास चिकित्सीय विकल्पों के विकास में सहायता कर सकती है ।

यहां, हम एक विकास की स्थिति का वर्णन करते हैं जो म्यूटेंट के कारण एससीवी की उपस्थिति का पता लगाता है जो पाइरिमिडीन डी नोवो को संश्लेषित नहीं कर सकता है। यूसिल और/या साइटोसाइन का पूरकीकरण, पाइरिमिडीन न्यूक्लियोटाइड का नाइट्रोजनबेस, मध्यम करने के लिए उबार मार्ग को सक्रिय करता है, इस प्रकार म्यूटेंट में सामान्य वृद्धि को बहाल करता है। इन विशिष्ट एससीवी म्यूटेंट के लिए इस विकास विधि का उपयोग रोगी नमूनों में पाइरिमिडिन म्यूटेशन की पहचान करने के लिए स्क्रीनिंग विधि के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, हम पी एरुगिनोसाद्वारा उत्पादित और स्रावित अल्गिनेट का पता लगाने और मापन के लिए दो तरीकों पर चर्चा करते हैं। पहला पारंपरिक विधि14,15,16 एसिड की उच्च एकाग्रता का उपयोग करके पॉलीसैकराइड को अपमानजनक और फिर नमूने में एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए एक रंगीन संकेतक जोड़ना है। हमारी प्रयोगशाला में विकसित दूसरी विधि, क्यूईडी बायोसाइंसेज द्वारा विकसित एंटी-अल्जिनेट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb) का उपयोग करके एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) का उपयोग करती है। एलिसा विधि मूत्र एसिड परख की तुलना में अधिक विशिष्ट और संवेदनशील साबित होती है और अत्यधिक केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड से बचने के कारण सुरक्षित उपयोग की अनुमति देती है। एलिसा की क्षमता के साथ सीधे रोगी थूक नमूनों पर इस्तेमाल करने के लिए अल्जीनेट को मापने के लिए, यह संक्रमण के विभिन्न अवधियों में फेफड़ों में मौजूद अल्गिनेट की मात्रा का पालन करने के लिए एक निगरानी नैदानिक उपकरण के रूप में विकसित किया जा सकता है।

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Protocol

1. एससीवी विकास की स्थिति और उबार मार्ग की शारीरिक सक्रियण

  1. एससीवी का पता लगाना।
    1. लकीर पी aeruginosa उपभेदों PAO1, PAO111pyrD,PAO581, और PAO5811pyrD prewarmed स्यूडोमोनास अलगाव आगर (पिया) प्लेटों पर और ४८ घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस से बढ़ते हैं । विकास प्लेट पर एक एकल कॉलोनी अलग-थलग होती है जिसमें एससीवी फेनोटाइप (सामान्य 3−5 मिमी कॉलोनी आकार के विपरीत 1−3 मिमी का कॉलोनी आकार) है।
    2. एससीवी के शुद्ध अलग-अलग प्राप्त करने के लिए चरण 1.1.1 दोहराएं।
      नोट: एससीवी कॉलोनियों की धीमी वृद्धि दर के कारण विकास दर 72 घंटे तक की आवश्यकता हो सकती है।
  2. निस्तारी मार्ग की शारीरिक सक्रियता।
    1. बाँझ टीका पाश का उपयोग करना, पिया प्लेट से एससीवी कॉलोनी चुनें और 0.1 एमएम यूरासिल के साथ पूरक एक प्रीवार्म्ड पीआईए पर लकीर। 24−48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट उगाएं।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी पिया प्लेटों में ऑटोक्लेविंग से पहले मिश्रण में 20 mL/L ग्लाइसेरोल जोड़ा जाता है । ऑटोक्लेव करने के बाद और मिश्रण के बाद तापमान 55 डिग्री सेल्सियस से नीचे होता है, प्लेटडालने से पहले तरल मीडिया में 11.21 मिलीग्राम/एल यूरासिल (0.1 एमएम) जोड़ता है। यह विधि पाइरिमिडीन म्यूटेशन की पहचान करने में मदद करेगी जो पी एरुजिनोसामें एससीवी फेनोटाइप का कारण बनती हैं। यदि एससीवी फेनोटाइप उक्त उत्परिवर्तन का परिणाम है, तो सामान्य कॉलोनी वृद्धि और आकार (3−5 मिमी) यूसिल पूरक पीआईए प्लेटों पर देखा जाएगा। यदि उपभेदों में अल्जीनेट का उत्पादन करने की क्षमता थी, तो म्यूकोइड फेनोटाइप भी यूसिल पूरकता पर वापस आ जाएगा।

2. मूत्र एसिड कार्बाजोल परख

  1. वांछित तनाव की शुद्ध संस्कृति से, एक ही कॉलोनी की पहचान करें। एक बाँझ टूथपिक का उपयोग करना, कॉलोनी चुनें, और टूथपिक को एक संस्कृति परीक्षण ट्यूब में रखें जिसमें स्यूडोमोनास आइसोलेशन शोरबा (पीआईबी) के 5 मिलील होते हैं। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर इनक्यूबेटर में बढ़ें।
    नोट: निम्नलिखित उपभेदों PAO581 (PAO1mucA25),PAO581कारा,PAO581कार्ब,और PAO581pyrD पिया प्लेटों या पिया प्लेटों पर उगाया गया था ०.१ m m उरासिल के साथ पूरक माप के लिए फसल अल्जीनेट ।
  2. एक प्रीवार्म्ड पीआईए प्लेट पर सुसंस्कृत पीआईबी शोरबा (15 मिमी x 100 मिमी प्लेटों के लिए) या शोरबा के 450 माइक्रोन (15 मिमी x 150 मिमी प्लेटों के लिए) के 150 माइक्रोन जोड़ें। बाँझ सेल स्प्रेडर का उपयोग करके, थाली पर शोरबा फैलाएं। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली उगाएं।
    नोट: किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ, यदि कोई हो, थाली से एक तरफ टिपिंग द्वारा एक पाइप का उपयोग कर के लिए एस्पिरेट। प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली पीआईबी और पीआईए प्लेटों दोनों में एल्गिनेट उत्पादन में सहायता के लिए कार्बन स्रोत के रूप में कोशिकाओं द्वारा उपयोग किए जाने वाले ग्लाइसेरोल के 20 mL/L होते हैं ।
  3. एक पिपेट नियंत्रक और एक बाँझ 50 mL पिपेट का उपयोग करना, लॉन में 0.85% NaCl जोड़ें और एक सेल स्प्रेडर का उपयोग कर प्लेट को खत्म करके नमूना इकट्ठा करें। एक 50 mL संग्रह ट्यूब में एक ताजा 50 mL पाइप का उपयोग कर नमूना Aspirate। भंवर उच्च पर नमूना मिश्रण और बर्फ पर नमूनों जगह है ।
    नोट: जोड़ा 0.85% NaCl की मात्रा प्लेट के आकार के आधार पर भिन्न होती है। 15 मिमी x 100 मिमी प्लेटों के लिए, 10−30 मिमी का उपयोग करें, और 15 मिमी x 150 मिमी प्लेटों के लिए, 20−50 मिमी का उपयोग करें।
  4. एक डिस्पोजेबल क्यूवेट में नमूने के 1 मिलील जोड़कर और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके ओडी पढ़कर नमूनों के 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें। प्रत्येक नमूने के लिए पढ़ता है की एक ट्रिपलेट प्राप्त करने के लिए इस चरण 2x दोहराएं।
  5. संस्कृति ट्यूबों में सल्फ्यूरिक एसिड/बोरेट समाधान के 3 मिलील जोड़ें और बर्फ पर बैठते हैं । परीक्षण ट्यूबों में एसिड मिश्रण और कम संक्षेप में भंवर में धीरे से एकत्र नमूने के 350 μL जोड़ें।
    1. 45 मिलीग्राम पानी में 10.099 ग्राम पोटेशियम हाइड्रोक्साइड (कोह) पाउडर डालकर बोरेट स्टॉक तैयार करें। मिश्रण में 24.74 ग्राम बोरिक एसिड (एच3बीओ3)जोड़ें और 100 मीटर तक वॉल्यूम लाएं।
    2. बर्फ के साथ एक सिंक में 1 एल बोतल रखें और एकाग्र सल्फ्यूरिक एसिड के 500 मिली0 के साथ बोतल भरें। धीरे-धीरे तैयार बोरेट स्टॉक का 15 मिलील जोड़ें। बोतल को ठंडा होने दें।
    3. कुल 25 मिलील के लिए बोरेट स्टॉक का एक और 10 मिलील जोड़ें। एक बार बोतल ठंडा हो जाने के बाद वॉल्यूम को 1 एल पर लाएं।
      सावधानी: यह विधि अत्यधिक केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड के उपयोग पर निर्भर करती है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि नमूने की सुरक्षा और उचित निपटान प्रोटोकॉल का पालन किया जाना चाहिए ।
      नोट: एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए डीकी एक ज्ञात एकाग्रता-mannuronic एसिड और/या एक ज्ञात जीवाणु अल्गिनेट नमूनों काटा और एल्गिनेट के माध्यम से शुद्ध पी aeruginosa के उपभेदों का उत्पादन (जैसे: PAO581-PAO1mucA25)। नकारात्मक नियंत्रण के लिए 0.85% नैल समाधान और/याPAO111aalgD (algD जीन का इन-फ्रेम विलोपन जो बैक्टीरिया को पूरी तरह से अल्जीनेट का उत्पादन करने में असमर्थ बनाता है)। सांख्यिकीय विश्लेषण में सहायता के लिए तकनीकी दोहराता की संख्या बढ़ाने के लिए प्रत्येक नमूने से कई ट्यूब बनाए जा सकते हैं। प्रत्येक नमूने की 3−5 ट्यूब तैयार करें।
  6. एसिड/नमूना मिश्रण के लिए इथेनॉल समाधान में 0.1% कार्बाजोल के 100 माइक्रोन जोड़ें। 30 मिन के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर सूखे स्नान में 5 एस के लिए मध्यम सेटिंग पर ट्यूब और भंवर कैप करें।
  7. ऊष्मायन के बाद, ट्यूबऔर भंवर को उच्च पर संक्षेप में हटा दें और 5 मिन के लिए ठंडा होने दें।
    नोट: रंग देखा जा करने के लिए बैंगनी की छाया होगी । रंग 1−2 घंटे के लिए माप के लिए स्थिर रहेगा।
  8. प्रत्येक ट्यूब का ओडी530 एक साफ क्यूवेट में मिश्रण का 1 मिलील जोड़कर और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 530 एनएम पर नमूनों की ओडी पढ़कर पढ़ें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लिए एक खाली के रूप में 0.85% NaCl के साथ ट्यूब का उपयोग करें।
  9. डी-मैनन्यूनिक एसिड (१,०२४ μg/mL, ५१२ μg/mL, २५६ μg/mL, १२८ μg/mL, ६४ μg/mL, ३२ μg/mL, 16 μg/mL, और 8 μg/mL) की ज्ञात सांद्रता के धारावाहिक कमजोरियों के ओडी५३० को मापने के द्वारा एक मानक वक्र तैयार करें । 2x दोहराएं। इन रीडिंग से एक रैखिक समीकरण निकालें।
    नोट: मानक वक्र केवल एक बार किया जाना चाहिए । इससे निकाले गए रैखिक समीकरण का उपयोग बाद में परीक्षण के लिए किया जा सकता है।
    1. मानक वक्र का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में अल्गिनेट की एकाग्रता की गणना करें और ओडी600 द्वारा रैखिक समीकरण से अल्जिनेट एकाग्रता को विभाजित करें ताकि प्रति ओडी600की कुल मात्रा प्राप्त की जा सके।

3. अल्जिनेट क्वांटिटेशन के लिए एलिसा

  1. अल्जिनेट माप के लिए नमूने प्राप्त करने के लिए चरण 2.1−2.4 दोहराएं।
    नोट: इस्तेमाल किए जाने वाले उपभेदों में PAO1, PAO11AaalgD,और PAO1 pHERD20T-algU ले जा रहे थे ।
  2. एक माइक्रोपाइपेट का उपयोग एक अनुपचारित 96-अच्छी तरह से प्लेट में एकत्र नमूने के 50 μL जोड़ें। कुओं में कोटिंग बफर (कार्बोनेट/बाइकार्बोनेट बफर पीएच 9.6) के 50 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कर लें।
    नोट: एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, डीकी एक ज्ञात एकाग्रता-Mannuronic एसिड और/या एक ज्ञात स्थिर अल्गिनेट तनाव का उत्पादन (जैसे: PAO581-PAO1mucA25)इस्तेमाल किया जा सकता है । नकारात्मक नियंत्रण के लिए 0.85% नैल समाधान और/याPAO111aalgD (algD जीन के इन-फ्रेम हटाने से बैक्टीरिया पूरी तरह से किसी भी अल्जीनेट का उत्पादन करने में असमर्थ हो जाता है)। सांख्यिकीय विश्लेषण में सहायता के लिए तकनीकी दोहराता की संख्या बढ़ाने के लिए प्रत्येक नमूने से कई कुओं बनाया जा सकता है। प्रत्येक नमूने के 3−5 कुएं तैयार करें।
  3. एक धार की बोतल का उपयोग करके, प्लेट कुओं को 1x फॉस्फेट बफर लवण (पीबीएस) के साथ 0.05% ट्वीन 20 (पीबीएस-टी) के साथ धोएं, और फिर प्लेट को फ्लिप करके उन्हें निकाल लें।
  4. माइक्रोपाइपेट का उपयोग करने से कुओं में बफर (पीबीएस-टी में 10% स्किम दूध) को अवरुद्ध करने का 200 माइक्रोन जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: पैराफिन फिल्म में प्लेट लपेटें या रेफ्रिजरेटर में किसी भी वाष्पीकरण से बचने में मदद करने के लिए लपेटें हटना।
  5. एक धार की बोतल का उपयोग कर के कुओं को भरने के द्वारा PBS-टी के साथ प्लेट कुओं 2x धोने, और फिर उंहें प्लेट फ्लिपिंग द्वारा draining ।
  6. माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके कुओं में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस एंटी-एल्जिनेट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) का 100 माइक्रोन जोड़ें और 1−2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी (माउस एंटी-एल्जिनेट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) एंटीबॉडी डिल्यूंट सॉल्यूशन (1x पीबीएस में 1% स्किम मिल्क) में 0.5 μg/mL (1:2,000 के 1:2,000 की कमजोर पड़ने) की एकाग्रता पर प्रदान किया गया था।
  7. एक धार की बोतल का उपयोग कर के कुओं को भरने के द्वारा PBS-टी के साथ प्लेट कुओं 3x धोने, और फिर उंहें प्लेट फ्लिपिंग द्वारा draining ।
  8. माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके कुओं में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी का 100 माइक्रोन जोड़ें और 1−2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया था पियर्स बकरी विरोधी माउस पाली-HRP एंटीबॉडी ०.२५ μg/mL की एकाग्रता के लिए (०.५ मिलीग्राम/mL स्टॉक के 1:2,000 की कमजोर पड़ने) एंटीबॉडी डिल्यूंट समाधान में ।
  9. एक धार की बोतल का उपयोग कर के कुओं को भरने के द्वारा PBS-टी के साथ प्लेट कुओं 3x धोने, और फिर उंहें प्लेट फ्लिपिंग द्वारा draining ।
  10. माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके, टीएमबी-एलिसा समाधान(सामग्री की तालिका)के 100 माइक्रोन जोड़ें और अंधेरे में 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: एक सकारात्मक प्रतिक्रिया का रंग नीले रंग की छाया होगा।
  11. माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके, स्टॉप समाधान (2 एन सल्फ्यूरिक एसिड) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: जब स्टॉप समाधान जोड़ा जाता है तो रंग नीले से पीले रंग में बदल जाएगा। प्रतिक्रिया बंद होने के बाद 30 सीन तक के लिए रंग स्थिर है।
  12. एक प्लेट रीडर का उपयोग करना, 450 एनएम पर ओडी पढ़ें।
  13. डी-मैनन्यूनिक एसिड (१,०२४ μg/mL, ५१२ μg/mL, २५६ μg/mL, १२८ μg/mL, ६४ μg/mL, ३२ μg/mL, 16 μg/mL, और 8 μg/mL) की ज्ञात सांद्रता के धारावाहिक कमजोरियों के ओडी४५० को मापने के द्वारा एक मानक वक्र का उत्पादन, और 8 μg/mL) । 2x दोहराएं। इन रीडिंग से एक रैखिक समीकरण निकालते हैं।
    नोट: मानक वक्र केवल एक बार किया जाना चाहिए । इससे निकाले गए रैखिक समीकरण का उपयोग बाद में परीक्षण के लिए किया जा सकता है।
    1. मानक वक्र का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में अल्गिनेट की एकाग्रता की गणना करें और ओडी600 द्वारा रैखिक समीकरण से अल्जिनेट एकाग्रता को विभाजित करें ताकि प्रति ओडी600की कुल मात्रा प्राप्त की जा सके।

4. अल्गिनेट माप नप का सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. एक ग्राफिकल सॉफ्टवेयर शीट में, मानक वक्र से प्राप्त रैखिक समीकरण के साथ एक कॉलम सेट करें। प्रत्येक नमूने में अल्जीनेट सांद्रता प्राप्त करने के लिए एलिसा के लिए मूत्र एसिड परख और ओडी450 के लिए ओडी530 के रूप में अल्जीनेट एकाग्रता और एक्स-एक्सिस परिणाम के रूप में वाई-एक्सिस परिणाम सेट करें।
  2. प्रत्येक नमूने में अल्गिनेट की मात्रा को 5.5 x108 सीएफयू/mL (1 OD600)के अनुसार सामान्य करने के लिए, अपने संबंधित ओडी600 मूल्य द्वारा ऊपर प्राप्त प्रत्येक नमूने की एकाग्रता को विभाजित करें। यदि प्रत्येक नमूने के लिए कई ओडी600 मापा गया था, तो मतलब ओडी600से विभाजित करें।
  3. पसंदीदा सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर (जैसे, ग्राफपैड चश्मे 7.02) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
  4. सॉफ्टवेयर खोलें। नई टेबल और ग्राफ के तहत कॉलम चुनें और वन-वे एनोवा डेटा सेट चुनें।
  5. परीक्षण किए गए तनाव के साथ प्रत्येक कॉलम का नाम दें और नीचे अल्जीनेट सांद्रता जोड़ें।
  6. सभी डेटा इनपुट करने के बाद शीर्ष मेनू में विश्लेषण पर क्लिक करें। इससे एनालिसिस सेटिंग विंडो खुलेगी। परीक्षण के लिए उपयुक्त मापदंडों का चयन करें और इंगित करें कि क्या किसी भी कई तुलना को चलाने की आवश्यकता है।
    नोट: विश्लेषण के बाद डेटा सेट में एक पी-वैल्यू होगी जो डेटा के सांख्यिकीय महत्व को निर्धारित करने में मदद करेगा। यदि पी-वैल्यू सेट α मूल्य से कम है तो डेटा को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाएगा (सामान्य रूप से α मूल्य पी एंड एलटी; 0.01 के लिए निर्धारित है)।
  7. ग्राफ टैब के नीचे बार ग्राफ प्रकार चुनें। इससे इनपुट डाटा शीट से संकेतित टाइटल वाले डाटा को अपने आप चार्ट कर दिया जाएगा। ब्याज की सलाखों के बीच संयोजी लाइनों के ऊपर * प्रतीक दिखाकर आवश्यक डेटा के सांख्यिकीय महत्व को इंगित करें।

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Representative Results

चित्रा 1 PYO1 और PAO581 की प्लेटों के साथ या पाइर्ड जीन में फ्रेम हटाने के बिना (पाइरिमिडीन बायोसिंथेसिस मार्ग में एक जीन) से पता चलता है कि SCV6में परिणाम है । पीएओ1 एससीवी उत्परिवर्ती को यूरासिल पूरकता(चित्रा 1ए, बी)के जवाब में सामान्य वृद्धि के लिए बहाल किया गया था। इसके अलावा, PAO58111pyrDSCV उत्परिवर्ती एक ही उरासिल उपचार के साथ म्यूकोइडी में वापस आ गया था, क्योंकि माता पिता तनाव PAO581 एक अतिरिक्त mucA25 उत्परिवर्तन(चित्रा 1सी, डी)है । मूत्र एसिड कार्बाजोल परख के परिणाम चित्रा 26में दिखाए गए हैं । डेटा पीआईए और पीआईए पर उगाए जाने वाले पायरिमिडीन डी नोवो बायोसिंथेसिस को विनियमित करने वाले जीन में उत्परिवर्तनके साथ PAO581 और PAO581 के नमूनों का प्रतिनिधित्व करता है जो 0.1 m m यूरासिल(चित्रा 2ए)के साथ पूरक है। आंकड़ों से पता चलता है कि मीडिया में यूसिल की उपस्थिति के परिणामस्वरूप उत्परिवर्ती तनाव को वापस म्यूकोइडी में बदल दिया जाता है (जैसा कि वृद्धि/बहाल अल्गिनेट उत्पादन द्वारा देखा जाता है)(चित्रा 2बी)। एंटी-अल्जिनेट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आधारित एलिसा के परिणाम ों का प्रतिनिधित्व चित्र 3में किया जाता है। डेटा में पीएओ1, पीएओ1 को प्रमुख अल्गिनेट बायोसिंथेटिक एंजाइम जीडीपी-मैननोज डिहाइड्रोजनेज एन्कोडिंग करने वाले एल्ग्ड जीन के इन-फ्रेम विलोपन के साथ दिखाया गया है, और पीएओ1 मुख्य अल्गिनेट-विशिष्ट सिग्मा फैक्टर algU के साथ एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड pHERD20T ले जा रहा है जब पीHERD20T में pBAD प्रमोटर को शामिल करने के लिए अरबी के साथ पिया प्लेटों पर उगाया जाता है । यह डेटा PAO1 के लिए मापा एल्गिनेट के गैर-म्यूकोइड स्तर को दर्शाता है, और PAO1 +पीHERD20T-algU के लिए मापा एल्गिनेट के म्यूकोइड स्तरबनाम PAO1AAaaaaaad । चित्रा 4 अल्जिनेट माप के दो तरीकों की तुलना एक साथ करता है। पी एंड एलटी; 0.01 के साथ दो तरह के एनोवा का उपयोग करते हुए एक दूसरे की तुलना में परिणाम सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे। चित्रा 5ए एमिलोपेक्टिन, एमिलोज, कोलेजन और ग्लाइकोजन सहित अन्य पॉलीसैकराइड्स के खिलाफ एंटी-एल्जिनेट एमएबी की क्रॉस रिएक्टिविटी की तुलना करता है। चित्रा 5बी अत्यधिक शुद्ध समुद्री शैवाल एल्गिनेट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करने वाले नियंत्रण के साथ नव विकसित एंटी-एल्जिनेट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी-आधारित एलिसा को मूत्र ाल एसिड कार्बाजोल परख की विशिष्टता और संवेदनशीलता में तुलना दिखाता है। चित्रा 6 रोगी थूक नमूनों पर एलिसा का सीधा परीक्षण दिखाता है जो म्यूकोइड पी एरुजिनोसा और रोगियों के लिए सकारात्मक थे जिनमें म्यूकोइड पी एरुजिनोसानहीं था।

Figure 1
चित्र 1: डी नोवो पायरिमिडीन बायोसिंथेसिस म्यूटेशन की प्रतिनिधि छवियां जो पीएओ 1 और पीएओ581 में एससीवी फेनोटाइप में परिणामी हैं। छवि से पता चलता है PAO1(बाएं)और PAO11pyrd(दाएं)पिया प्लेटों पर(ए)और पिया प्लेटें यूरासिल(बी)के साथ पूरक ४८ घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर उगाया । छवि से पता चलता है PAO581(बाएं) और PAO5811pypyrd(दाएं)पिया प्लेटों पर(सी)और पिया प्लेटें uracil के साथ पूरक(डी)४८ घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर उगाया । इस आंकड़े को अल अहमर एट अल6द्वारा किए गए काम से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मूत्र एसिड कार्बाजोल परख का प्रतिनिधि ग्राफ। (A)म्यूकोइड पी aeruginosa तनाव PAO581 (PAO1mucA25)की छवि पिया प्लेटों पर 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया(बाएं)और उरासिल के साथ पिया प्लेटें(दाएं)। (ख)PAO581, PAO581कारा,PAO581कार्ब,और PAO581pyrD के लिए अल्गिनेट उत्पादन जब पिया प्लेटों पर उगाया जाता है और बिना यूसिल पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए अल्गिनेट एकत्र किया गया था और मानक कार्बाजोल परख का उपयोग करमापा गया था। दिखाए गए मूल्यों का मतलब है एल्गिनेट ± ट्रिपलेट पढ़ता है के मानक विचलन । (****= पी एंड एलटी; 0.0001)। इस आंकड़े को अल अहमर एट अल6द्वारा किए गए काम से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एंटी-अल्जीनेट एमएबी-आधारित एलिसा का प्रतिनिधि ग्राफ। PAO1, PAO11aalgD और PAO1 के लिए अल्गिनेट उत्पादन अभिव्यक्ति वेक्टर pHERDD20T-algU पिया पर 0.1% अरबीनोज के साथ 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के साथ उगाया गया अल्गिनेट एकत्र किया गया था और माउस एंटी अल्जीनेट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एंटी-अल्गिनेट एलिसा का उपयोग करके मापा गया था। दिखाए गए मूल्यों का मतलब है एल्गिनेट ± ट्रिपलेट पढ़ता है के मानक विचलन । पी एंड एलटी; 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मूत्र एसिड परख और एंटी-अल्जीनेट एमएबी-आधारित एलिसा से प्राप्त परिणामों के बीच तुलना। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पिया प्लेटों पर उगाए गए पांच अलग-अलग म्यूकोइड पी एरुगिनोसा मालिकाना उपभेदों से अल्गिनेट उत्पादन को यूरोनिक एसिड परख और एंटी-अल्गिनेट एलिसा द्वारा एकत्र और मापा गया था। दिखाए गए मूल्यों का मतलब है एल्गिनेट ± ट्रिपलेट पढ़ता है के मानक विचलन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: मूत्र एसिड कार्बाजोल परख की तुलना में एंटी-अल्जीनेट एमएबी आधारित एलिसा की विशिष्टता और संवेदनशीलता। (A)एलिसा को समुद्री शैवाल के उच्च (८०० μg/mL) और कम (१०० μg/mL) आंतरिक परख नियंत्रण के साथ चलाया गया था । इस अल्जीनेट का उपयोग एलिसा के लिए एक मानक के रूप में भी किया जाता था। अन्य पॉलीसैकराइड्स का परीक्षण किया गया जो एंटी-अल्जिनेट एमएबी के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, एमिलोपेपेक्टिन, एमिलोज, कोलेजन, और ग्लाइकोजेन (500 μg/mL प्रत्येक) थे। (ख)यूरोनिक एसिड कार्बाजोल परख और एलिसा को समुद्री शैवाल अल्गिनेट के साथ मानक सांद्रता की एक ही श्रृंखला का उपयोग करके चलाया गया था: ५० μg/mL, 5 μg/mL, 1 μg/mL, ०.५ g/mL, ०.१ μg/mL, और ०.०५ μg/mL । दिखाए गए मूल्यों का मतलब है एल्गिनेट ± ट्रिपलेट पढ़ता है के मानक विचलन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: सीधे रोगी नमूना परीक्षण। एंटी-अल्जिनेट एलिसा प्लेटों पर पूर्व वृद्धि के बिना रोगियों के थूक नमूनों पर परीक्षण किया गया था । तीन सीएफ थूक नमूनों कि म्यूकोइड पी aeruginosa के विकास के साथ ही दो रोगी थूक नमूने कि या तो गैर मुकोद पी aeruginosa (Neg 1) या कोई पी aeruginosa विकास (Neg 2) निहित इस्तेमाल किया गया । दिखाए गए मूल्यों का मतलब है एल्गिनेट ± ट्रिपलेट पढ़ता है के मानक विचलन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एससीवी और अल्गिनेट दोनों कई पुराने संक्रमणों में फंसाए गए महत्वपूर्ण रोग मार्कर हैं। इसलिए, एससीवी को विकसित करने की क्षमता के साथ-साथ पी एरुगिनोसा द्वारा एल्गिनेट के नियमन और उत्पादन का अध्ययन करना इन पुरानी बीमारियों के लिए उपन्यास उपचार की खोज का अभिन्न अंग है।

एससीवी उपभेदों को अन्य पी एरुजिनोसा उपभेदों की तुलना में उनकी धीमी वृद्धि दर4 के कारण विकसित करना बेहद मुश्किल है, जो उनके रोगाणुरोधी प्रतिरोध3में सहायक होता है । हमारा काम पी एरुजिनोसा एससीवी के एक विशिष्ट रूप की पहचान करता है जो डी नोवो पायरिमिडीन बायोसिंथेसिस में म्यूटेशन का परिणाम है। यहां, हम इस तरह के एससीवी के लिए एक सामान्य विकास फेनोटाइप पर वापस जाने के लिए विकास की स्थिति पर चर्चा करते हैं जब न्यूक्लियोसाइड यूरासिल की आपूर्ति की जाती है। हालांकि, जब यूएमपी/यूटीपी को माध्यम में जोड़ा गया था, तो दोषपूर्ण वृद्धि बहाल नहीं की गई (डेटा नहीं दिखाया गया था)। इस चयनात्मकता के लिए जिम्मेदार पोरिन (एस) का आगे अध्ययन करने की आवश्यकता है। पाइरिमिडीन भुखमरी से प्रेरित तनाव से राहत दिलाने में सहायता प्राप्त यूरासिल के साथ विकास मीडिया का पूरकीकरण(चित्रा 1)। इसी तरह, यूरासिल के अलावा की एक ही विधि में मीडिया के लिए मुफ्त साइटोसाइन के अलावा, पाइरिमिडीन भुखमरी की राहत में सहायता प्राप्त (डेटा नहीं दिखाया गया है)। मीडिया में मुफ्त यूसिल और मुफ्त साइटोसाइन दोनों कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं और कोशिका में यूडीन मोनोफॉस्फेट (यूएमपी) और यूडीन ट्राई-फॉस्फेट (यूटीपी)6 के सामान्य स्तर को वापस करने में मदद करते हैं, जिससे एससीवी सामान्य विकास के लिए वापस लौट जाता है।

अल्जिनेट मापन के लिए कई महत्वपूर्ण कदम मौजूद हैं जो परिणामों की प्रजनन क्षमता में सहायता कर सकते हैं। शुरू में नमूने, प्लेटों से खत्म होने के बाद, बर्फ पर रहने में मदद करने के लिए नमूना में अल्जीनेट के क्षरण ब्लॉक और कम मापा सांद्रता में परिणाम चाहिए । इसके अलावा, ओडी600 माप से पहले, एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए नमूना को अच्छी तरह से मिलाना महत्वपूर्ण है क्योंकि झुरमुट कुछ समय से बैठे नमूनों में बनते हैं और जो ओडी माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं और इस तरह अंतिम एकाग्रता गणना के साथ। एलिसा विधि का उपयोग करते समय, विकास प्लेटों के नमूनों को पतला करने की आवश्यकता हो सकती है, खासकर उन उपभेदों का उपयोग करते समय जो बड़ी मात्रा में अल्जीनेट का उत्पादन करते हैं क्योंकि परिणाम मानक वक्र सीमा के बाहर हो सकते हैं। मूत्र एसिड का उपयोग करते समय, कार्बाजोल के अलावा और ऊष्मायन के बाद संस्कृति ट्यूबों को अच्छी तरह से भंवर में एक सजातीय नमूना सुनिश्चित करने के लिए। मूत्र एसिड परख के साथ काम करते समय एसिड मिश्रण को संभालते समय और नमूनों को ठीक से निपटाना जरूरी है।

ऊपर वर्णित अल्गिनेट के एसिड हाइड्रोलिस की आवश्यकता माप की पारंपरिक विधि ने महान क्षमता दिखाई है और कई वर्षों तक कई शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया गया है। इस काम में, हम एक एंटी-अल्जिनेट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके एक इन-हाउस विकसित एलिसा के साथ पारंपरिक परख के लिए प्रक्रिया दिखाते हैं। इन एंटीबॉडी चूहों में विकसित किए गए थे और अभी तक पहचाने जाने वाले एपिटोप में अल्जीनेट को पहचान सकते हैं। एलिसा विधि की विशिष्टता को पी एरुगिनोसा के साथ-साथ समुद्री शैवाल से अल्गिनेट के खिलाफ अच्छी तरह से परीक्षण किया गया था। इसके अलावा, एलिसा परीक्षण बैक्टीरियल नमूनों में अल्गिनेट की मात्रा में मूत्र एसिड परख के बराबर था(चित्रा 3)। इसके अलावा, यह अन्य पॉलीसैकराइडके खिलाफ परीक्षण किया गया था जिसके परिणामस्वरूप झूठे सकारात्मक परिणाम हो सकते हैं। हमारे काम ने अल्जिनेट के लिए एंटीबॉडी की एक उच्च विशिष्टता दिखाई और अल्गिनेट और अन्य परीक्षण पॉलीसैकराइड्स(चित्रा 5ए)के बीच अंतर करने की इसकी क्षमता दिखाई । एलिसा प्रोटोकॉल में मूत्र एसिड परख(चित्रा 5बी)की तुलना में उच्च संवेदनशीलता है क्योंकि हम एलिसा का उपयोग करके अल्जिनेट के स्तर का पता लगाने में सक्षम थे, जिसका परीक्षण रोगी थूक नमूनों(चित्रा 6)का परीक्षण करते समय मूत्र एसिड परख का उपयोग करके नहीं किया गया था। एलिसा विधि रोगियों के थूक(चित्र6)से अल्गिनेट के वीवो माप में अनुकूलित किया जा सकता है । यूसिल पूरकता के साथ-साथ नव विकसित एलिसा का उपयोग करने वाली विकास स्थितियां सीएफ में पी एरुजिनोसा रोगजनन को बेहतर ढंग से समझने में शक्तिशाली उपकरण होंगी।

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Disclosures

लेखक होंगवेई डी यू मुख्य विज्ञान अधिकारी और प्रोजेनेसिस टेक्नोलॉजीज, एलएलसी के सह-संस्थापक हैं ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान R44GM113545 और P20GM103434 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA Thermo Scientific 34028 via Fisher Scientific
Absolute Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-4 Molecular Bio-grade
Accu Block Digital Dry Bath Labnet NC0205808 via Fisher Scientific
Assay Plates 96-well CoStar 2021-12-20
Bench Top Vortex-Genie 2 Scientific Industries G560
Boric Acid Research Products International Corp. 10043-35-3
Cabinet Incubator VWR 1540
Carbazole Sigma C-5132
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma C3041
Centrifuge Tubes (50 mL) Fisher Scientific 05-539-13 via Fisher Scientific
Culture Test Tubes Fisher Scientific 14-956-6D via Fisher Scientific
Cuvette Polystyrene (1.5 mL) Fisher Scientific 14955127 via Fisher Scientific
Cytosine Acros Organics 71-30-7
Diposable Inoculation Loops Fisher Scientific 22-363-597
D-Mannuronic Acid Sodium Sigma Aldrich SMB00280
FMC Alginate FMC 2133
Glycerol Fisher Scientific BP906-5 For Molecular Biology
Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody QED Biosciences N/A Lot # :15725/15726
Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) Sigma P3813
Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody Thermo Scientific 32230 via Fisher Scientific
Potassium Hydroxide Fisher Scientific 1310-58-3 via Fisher Scientific
Prism 7 GraphPad
Pseudomonas Isolation Agar (PIA) Difco 292710 via Fisher Scientific
Pseudomonas Isolation Broth (PIB) Alpha Biosciences P16-115 via Fisher Scientific
Round Toothpicks Diamond Any brand
Seaweed alginate (Protanal CR 8133) FMC Corporation
Skim Milk Difco 232100 via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer BioRad 170-2525 or preferred vendor
Sodium Chloride (NaCl) Sigma S-5886
SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader Molecular Devices i3x or preferred vendor
Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875713 via Fisher Scientific
Sulfuric Acid Fisher Scientific A298-212 Technical Grade
Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) R&D Systems DY994
Tween 20 Sigma P2287
Uracil Acros Organics 66-22-8

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 156 स्यूडोमोनास एरुगिनोसा,सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) स्मॉल कॉलोनी वैरिएंट (एससीवी) पाइरिमिडीन बायोसिंथेसिस ग्रोथ म्यूकोइडी एल्गिनेट यूरोनिक एसिड कार्बाजोल परख एल्गिनेट-स्पेसिफिक मैब एलिसा
<em>स्यूडोमोनास एरुगिनोसा</em> के स्मॉल कॉलोनी संस्करण की संस्कृति और इसके अल्गिनेट की मात्रा
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Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate. J. Vis. Exp. (156), e60466, doi:10.3791/60466 (2020).

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