Summary
Här beskriver vi en tillväxt villkor för att kultur den lilla kolonivarianten av Pseudomonas aeruginosa. Vi beskriver också två separata metoder för detektion och mängder av exopolysackarideralginate som produceras av P. aeruginosa med hjälp av en traditionell urinsyra karbazolanalys och en alginate-specifik monoklonal antikropp (mAb) baserad ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk Gram-negativ bakteriell patogen, kan överproducera en exopolysackarider alginate resulterar i en unik fenotyp som kallas mucoidy. Alginate är kopplat till kroniska lunginfektioner som resulterar i dålig prognos hos patienter med cystisk fibros (CF). Förstå de vägar som reglerar produktionen av alginate kan bidra till utvecklingen av nya terapeutiska strategier som riktar sig till alginate bildning. En annan sjukdomsrelaterad fenotyp är den lilla kolonivarianten (SCV). SCV beror på den långsamma tillväxten av bakterier och ofta förknippas med ökad resistens mot antimikrobiella medel. I detta dokument visar vi först en metod för att odla en genetiskt definierad form av P. aeruginosa SCV på grund av pyrimidin biosyntesmutationer. Tillskott av kvävehaltiga baser, uracil eller cytosin, returnerar den normala tillväxten till dessa mutanter, vilket visar närvaron av en bärgning sytningsväg som rensar fria baser från miljön. Därefter diskuterar vi två metoder för mätning av bakteriell alginat. Den första metoden bygger på hydrolysav av polysackarider till dess urinsyra monomer följt av härledning med en kromogen reagens, carbazole, medan den andra metoden använder en ELISA baserad på en kommersiellt tillgänglig, alginate-specifika mAb. Båda metoderna kräver en standardkurva för mängdering. Vi visar också att den immunologiska metoden är specifik för alginatekvantifiering och kan användas för mätning av alginat i de kliniska proverna.
Introduction
Kroniska lunginfektioner med Pseudomonas aeruginosa är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet hos patienter med cystisk fibros (CF). Under tidig barndom koloniseras patienter av flera bakteriella patogener, inklusive nonmucoid isolat av P. aeruginosa1,2. Uppkomsten av den lilla kolonivarianten (SCV) isolat samt slemhinnor isolat är en markör för uppkomsten av kroniska infektioner. SCV isolat är mycket resistenta3 på grund av deras långsamma tillväxttakt4, vilket gör dem en allvarlig avskräckande i behandlingsregementen och andra kroniska infektioner5 av P. aeruginosa. Arbete av Al Ahmar et al.6 visade en koppling mellan SCV och slemhinnor kopplade av de novo pyrimidin biosyntes. Pyrimidinsvält, på grund av mutationer i gener som var involverade i pyrimidinproduktion, resulterade i SCV fenotyp i nonmucoid referensstam PAO1 och slemhinnederivatet PAO581 (PAO1mucA25).
Även om alginate överproduktion är en viktig sjukdom markör för kroniska lunginfektioner i CF, är det inte klart om det finns ett direkt samband mellan mängden alginate och lungpatologi, och det är oklart om alginate kan användas som en prognos markör för behandling7. Alginate produktionen regleras huvudsakligen av två operons, en reglerande operon(algUmucABCD)8,9 och biosyntetisk operon(algD operon)10,11. Alginate produktionen är hårt reglerad av sigma faktor AlgU9,12 (även känd som AlgT) och nedbrytningen av anti-sigma faktor MucA13. Förmågan att övervaka produktionen av alginate på plats från patienternas slemprover kan bidra till utvecklingen av nya terapeutiska alternativ.
Här beskriver vi ett tillväxttillstånd som upptäcker förekomsten av SCV orsakad av mutanter som inte kan syntetisera pyrimidinde novo. Tillskott av uracil och/eller cytosin, den kvävehaltiga basen av pyrimidinnucleotide, till mediet aktiverar bärgningsvägen och återställer därmed den normala tillväxten i mutanter. Denna tillväxtmetod för dessa specifika SCV mutanter kan användas som en screening metod för att identifiera pyrimidin mutationer i patientprover. Dessutom diskuterar vi två metoder för upptäckt och mätning av alginate produceras och utsöndras av P. aeruginosa. Den första är den traditionella metoden14,15,16 för att försämra polysackaridermed en hög koncentration av syra och sedan lägga till en kolorimetrisk indikator för att kvantifiera koncentrationen i provet. Den andra metoden, som utvecklats i vårt laboratorium, använder Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) med hjälp av en anti-alginate monoklonal antikropp (mAb) som utvecklats av QED Biosciences. ELISA-metoden visar sig vara mer specifik och känslig än urinsyraanalysen och möjliggör säkrare användning på grund av undvikande av den högkoncentrerade svavelsyran. Med elisas förmåga att användas direkt på patientslemprover för att mäta alginat kan det utvecklas som ett övervakningsdiagnostiskt verktyg för att följa mängden alginate som finns i lungorna vid olika perioder av infektionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SCV tillväxtförhållanden och fysiologisk aktivering av bärgningsvägen
- Detektion av SCV.
- Streak P. aeruginosa stammar PAO1, PAO1ΔpyrD, PAO581 och PAO581ΔpyrD på förvärmda Pseudomonas isolering agar (PIA) plattor och växa på 37 ° C för 48 h. På tillväxtplattan identifiera en enda koloni isolera som har SCV fenotyp (kolonistorlek 1−3 mm i motsats till den normala 3−5 mm koloni storlek).
- Upprepa steg 1.1.1 för att få ett rent isolerat av SCV.
OBS: Tillväxt kan kräva upp till 72 timmar på grund av den långsamma tillväxttakten i SCV kolonier.
- Fysiologisk aktivering av bärgningsvägen.
- Med hjälp av en steril inokuleringslinga, välj SCV-kolonin från PIA-plattan och strimma på en förwarmed PIA kompletterad med 0,1 mM uracil. Odla plattan vid 37 °C för 24−48 h.
OBS: Alla PIA plattor som används i detta protokoll innehåller 20 ml /L av glycerol läggas till blandningen innan autoklaving. Efter autoklavering och efter blandningstemperaturen är under 55 °C tillsätt 11,21 mg/L uracil (0,1 mM) till vätskemediet innan plattorna hälls. Denna metod skulle bidra till att identifiera pyrimidin mutationer som orsakar SCV fenotyp i P. aeruginosa. Om SCV fenotyp är ett resultat av nämnda mutation, då normal koloni tillväxt och storlek (3−5 mm) skulle observeras på uracil kompletterade PIA plattor. Om stammar hade förmågan att producera alginate, kommer mucoid fenotyp också tillbaka vid uracil tillskott.
- Med hjälp av en steril inokuleringslinga, välj SCV-kolonin från PIA-plattan och strimma på en förwarmed PIA kompletterad med 0,1 mM uracil. Odla plattan vid 37 °C för 24−48 h.
2. Urinsyra Carbazole Analys
- Från en ren kultur av önskad stam som ska testas, identifiera en enda koloni. Med hjälp av en steril tandpetare, välj kolonin och placera tandpetare i ett kulturprovrör som innehåller 5 ml Pseudomonas isoleringbuljong (PIB). Odla i en shaker inkubator vid 37 °C för 24 h.
OBS: Följande stammar PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB, och PAO581pyrd odlades på PIA plattor eller PIA plattor kompletteras med 0,1 mM uracil att skörda alginate för mätning. - På en förwarmed PIA platta tillsätt 150 μl odlade PIB buljong (för 15 mm x 100 mm plattor) eller 450 μL buljong (för 15 mm x 150 mm plattor). Använd en steril cellspridare, sprid buljongen över plattan. Odla plattan vid 37 °C för 24 h.
OBS: Sug upp eventuell aextravätska, om sådan finns, från plattan med hjälp av en rörledning genom att tippa plattan på ena sidan. Både PIB- och PIA-plattor som används i protokollet innehåller 20 ml/L av glycerol som ska användas av celler som kolkälla för att underlätta alginateproduktionen. - Använd en pipettstyrenhet och en steril 50 ml-pipett, tillsätt 0,85% NaCl till gräsmattan odlas och samla prov genom att skrota plattan med hjälp av en cellspridare. Sug upp provet med en ny 50 ml-rör i ett 50 ml-uppsamlingsrör. Vortex provet på hög för att blanda och placera proverna på is.
OBS: Volymen av tillsatt 0,85% NaCl varierar beroende på storleken på plattan. För 15 mm x 100 mm plattor, använd 10−30 ml och för 15 mm x 150 mm plattor, använd 20−50 ml. - Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600)av proverna genom att lägga till 1 ml av provet till en engångscuvette och läsa OD med hjälp av en spektrofotometer. Upprepa detta steg 2x för att få en triplicate av läsningar för varje prov.
- Tillsätt 3 ml av svavelsyra/borate-lösningen i kulturrör och låt sitta på is. Tillsätt 350 μl av det insamlade provet LÅNGSAMT till syrablandningen i provrören och virveln på låg kort tid.
- Förbered borate lager genom att lägga till 10.099 g kaliumhydroxid (KOH) pulver till 45 ml vatten. Tillsätt 24,74 g borsyra (H3BO3)till blandningen och ge volymen till 100 ml.
- Placera 1 L flaska i diskbänk med is och fyll flaska med 500 ml koncentrerad svavelsyra. Tillsätt långsamt 15 ml av den beredda borate lager. Låt flaskan svalna.
- Lägg till ytterligare 10 ml borate lager för totalt 25 ml. När flaskan är kyld, ta med volymen till 1 L.
VARNING: Denna metod är beroende av användning av högkoncentrerad svavelsyra. Lämplig personlig skyddsutrustning bör användas för att säkerställa att provets säkerhetsprotokoll är säkra och korrekt kassering bör följas.
OBS: För en positiv kontroll skördas och renas en känd koncentration av D-mannuronsyra och/eller kända bakteriealginateprover som skördats och renats genom alginatproducerande stammar av P. aeruginosa (t.ex. PAO581-PAO1mucA25). För en negativ kontroll användning 0,85% NaCl lösning och / eller PAO1ΔalgD (In-frame borttagning av algD gen som gör bakterierna helt oförmögen att producera alginate). Flera rör kan tillverkas av varje prov för att öka antalet tekniska upprepningar till stöd i statistisk analys. Förbered 3−5 rör för varje prov.
- Tillsätt 100 μl 0,1 % karbazol i etanollösning till syra/provmixen. Täck röret och virveln på medelmiljö i 5 s. Placera i ett torrt bad vid 55 °C i 30 minuter.
- Efter inkubation, ta bort rören och virveln kort på hög och låt svalna i 5 min.
OBS: Färg som ska ses skulle vara en nyans av lila. Färgen förblir stabil för mätning för 1−2 h. - Läs OD530 av varje rör genom att lägga till 1 ml av blandningen till en ren cuvette och läsa OD av proverna på 530 nm på en spektrophotometer. Använd röret med 0,85% NaCl som en tom till spektrofotometern.
- Bered en standardkurva genom mätning av OD530 av seriella utspädningar av kända koncentrationer av D-Mannuronsyra (1 024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/mL och 8 μg/mL). Upprepa 2x. Extrahera en linjär ekvation från dessa avläsningar.
Standardkurva behöver bara göras en gång. Den linjära ekvation som extraheras från den kan användas för senare testning.- Beräkna koncentrationen av alginat en i varje prov med hjälp av standardkurvan och dela alginatekoncentrationen från linjär ekvation med OD600 för att erhålla den totala alginaten per OD600.
3. ELISA för Alginate-mängder
- Upprepa steg 2.1−2.4 för att få prover för alginatmätning.
OBS: De stammar som användes var PAO1, PAO1ΔalgDoch PAO1 med pHERD20T-algU. - Med hjälp av ett mikropipett tillsätt 50 μl av det insamlade provet till en obehandlad 96-brunnsplatta. Tillsätt 50 μl beläggningsbuffert (karbonat/bikarbonatbuffert pH 9.6) till brunnarna. Inkubera plattan vid 37 °C för 2 h.
OBS: För en positiv kontroll kan en känd koncentration av D-Mannuronsyra och/eller en känd stabil alginatproducerande stam (t.ex. PAO581-PAO1mucA25) användas. För en negativ kontroll använder du 0,85% NaCl-lösning och/eller PAO1ΔalgD (borttagning av algD-gen gör att bakterierna helt oförmögen att producera någon alginate). Flera brunnar kan göras från varje prov för att öka antalet tekniska upprepningar till stöd i statistisk analys. Förbered 3−5 brunnar för varje prov. - Tvätta plåtbrunnarna 2x med 1x fosfatbuffertkoks (PBS) med 0,05 % Interpol20 (PBS-T) genom att fylla brunnarna och töm sedan på dem genom att vända på plattan.
- Med hjälp av en micropipett tillsätt 200 μl blockbuffert (10 % skummjölk i PBS-T) till brunnarna. Inkubera vid 4 °C över natten.
OBS: Wrap plate i paraffin film eller krympa wrap för att undvika avdunstning i kylskåpet. - Med hjälp av en spruta flaska tvätta plattan brunnar 2x med PBS-T genom att fylla brunnarna, och sedan tömma dem genom att vända plattan över.
- Med hjälp av ett mikropipett tillsätt 100 μl utspädd primär antikropp (musantialginat monoklonal antikropp) till brunnarna och inkubera vid 37 °C för 1−2 h.
ANMÄRKNING: Primär antikropp (musantialginatmonoklonal antikropp) tillhandahölls vid en koncentration av 0,5 μg/ml (utspädning av 1:2 000 av 1 mg/mL-lager) i antikroppsspädningslösning (1% skummjölk i 1 x PBS). - Med hjälp av en spruta flaska tvätta plattan brunnar 3x med PBS-T genom att fylla brunnarna, och sedan tömma dem genom att vända plattan över.
- Med hjälp av ett mikropipett tillsätt 100 μl utspädd sekundär antikropp till brunnarna och inkubera vid 37 °C för 1−2 h.
OBS: Sekundär antikropp som användes var genomborrande getanti-mus poly-HRP antikroppar till en koncentration av 0,25 μg/ml (utspädning av 1:2,000 av 0,5 mg/ml lager) i antikroppsspädningslösning. - Med hjälp av en spruta flaska tvätta plattan brunnar 3x med PBS-T genom att fylla brunnarna, och sedan tömma dem genom att vända plattan över.
- Tillsätt 100 μL TMB-ELISA-lösning (Materialbord)och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter i mörker.
OBS: Färgen på en positiv reaktion skulle vara en nyans av blått. - Tillsätt 100 μl stopplösning (2 N svavelsyra).
Färgen kommer att förvandlas från blått till gult när stopplösningen läggs till. Färgen är stabil i upp till 30 min efter att reaktionen har stoppats. - Med hjälp av en plattläsare, läs OD på 450 nm.
- Producera en standardkurva genom mätning av OD450 av seriella utspädningar av kända koncentrationer av D-Mannuronsyra (1 024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/mL och 8 μg/mL). Upprepa 2x. Från dessa avläsningar extrahera en linjär ekvation.
Standardkurvan behöver bara göras en gång. Den linjära ekvation som extraheras från den kan användas för senare testning.- Beräkna koncentrationen av alginat en i varje prov med hjälp av standardkurvan och dela alginatekoncentrationen från linjär ekvation med OD600 för att erhålla den totala alginaten per OD600.
4. Statistisk analys av Alginate-mätning
- I ett grafiskt programvarublad anger du en kolumn med den linjära ekvationen som härleds från standardkurvan. Ställ in y-axelns resultat som alginatkoncentration och x-axelns resultat som OD530 för urinsyraanalys och OD450 för ELISA för att erhålla alginatkoncentrationerna i varje prov.
- För att normalisera mängden alginate i varje prov till beloppet per 5,5 x108 CFU/ml (1 OD600)delar du koncentrationen av varje prov som erhålls ovan med respektive OD600-värde. Om flera OD600 mättes för varje prov, dividera med medelvärdet OD600.
- Utför statistisk analys med hjälp av önskad statistisk programvara (t.ex. GraphPad Prism 7.02).
- Öppna programvaran. Välj Kolumn under Ny tabell och diagram och välj den enkelriktade ANOVA-datauppsättningen.
- Namnge varje kolumn med den stam som testats och tillsätt alginatkoncentrationerna under.
- Efter att ha lagt in alla data klicka på Analysera i den övre menyn. Då öppnas ett analysinställningsfönster. Välj lämpliga parametrar för testning och ange om flera jämförelser behöver köras.
Obs: Efter analys kommer datauppsättningen att innehålla ett p-värde som skulle bidra till att fastställa datas statistiska betydelse. Uppgifterna skulle anses vara statistiskt signifikanta om p-värdet är mindre än det inställda α-värdet (normalt satt sibett värdet för p < 0,01). - Välj typen Stapeldiagram under diagramfliken. Detta kommer automatiskt att kartlägga data med den angivna titeln från indatabladet. Ange statistisk signifikans av data efter behov genom att visa * symbolen ovanför bindlinor mellan de räntestaplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar plattor av PAO1 och PAO581 med eller utan in-frame borttagning i pyrd genen (en gen i pyrimidin biosyntesen väg) som resulterar i SCV6. PAO1 SCV mutant återställdes till normal tillväxt som svar på uracil tillskott(figur 1A,B). Dessutom återlämnades PAO581ΔpyrDSCV-mutanten till slemhinnan med samma uracilbehandling, eftersom föräldrastammen PAO581 har ytterligare en mucA25-mutation (figur 1C,D). Resultaten för urinsyrakarbazolanalysen visas i figur 26. Uppgifterna representerar prover av PAO581 och PAO581 med mutationer i gener som reglerar pyrimidin de novo biosyntes odlas på PIA och PIA kompletteras med 0,1 mM uracil(figur 2A). Uppgifterna visar att förekomsten av uracil i media resulterar i omvandlingen av den muterade stammen tillbaka till slemhinnan (som framgår av den ökade/ återställda alginatproduktionen) (figur 2B). Resultaten för antialginat monoklonala antikroppsbaserade ELISA representeras i figur 3. Uppgifterna visar PAO1, PAO1 med en in-frame borttagning av algD genen kodning nyckeln alginate biosyntetiskt enzym BNP-mannose dehydrogenas, och PAO1 bär ett uttryck plasmid pHERD20T med de viktigaste alginate-specifika sigma faktor algU när odlas på PIA plattor med arabinose för induktion pBAD promotorn i pHERD20T. Dessa data visar icke-slemhinnor nivåer av alginate mätt för PAO1, och PAO1ΔalgD jämfört med slemhinnor nivåer av alginate mätt för PAO1 +pHERD20T-algU. Figur 4 jämför de två metoderna för alginatemätningar tillsammans. Resultaten var inte statistiskt signifikanta jämfört med varandra med hjälp av en tvåvägs ANOVA med p < 0,01. Figur 5A jämför antialginate mAb:s korsreaktivitet mot andra polysackarider, inklusive amylopectin, amylosa, kollagen och glykogen. Figur 5B visar jämförelsen i specificitet och känslighet hos urinsyrakarbazolanalysen till den nyutvecklade antialginatmonoklonala antikroppenbaserade ELISA med kontrollen med hjälp av den mycket renade havsginaten(Table of Materials). Figur 6 visar direkt testning av ELISA på patientslemprover som var positiva för slemhinnor P. aeruginosa och patienter som inte innehöll slemhinnor P. aeruginosa.
Figur 1: Representativa bilder av de novo pyrimidin biosyntes mutationer som resulterar i SCV fenotyp i PAO1 och PAO581. Bilden visar PAO1 (vänster) och PAO1ΔpyrD (höger) på PIA plattor (A) och PIA plattor kompletteras med uracil (B)odlas vid 37 ° C för 48 h. Bild visar PAO581(vänster)och PAO581ΔpyrD (höger) på PIA plattor (C) och PIA plattor kompletteras med uracil(D)odlas på 37 °C för 48 h. Denna siffra har ändrats från arbete som utförts av Al Ahmar et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativt diagram över urinsyra karbazolanalys. A) Bilden av mucoid P. aeruginosa stam PAO581 (PAO1mucA25)odlas vid 37 °C för 24 h på PIA plattor(vänster)och PIA plattor med uracil(höger). (B)Alginateproduktion för PAO581, PAO581carA,PAO581carBoch PAO581 pyrd när deodlas på PIA-plattor med och utan uracil vid 37 °C för 24 h. Alginate samlades in och mättes med hjälp av standardkarbazoleanalysen. Värden som visas är genomsnittliga alginate ± standardavvikelse av triplicate läsningar. (**** = p < 0.0001). Denna siffra har ändrats från arbete som utförts av Al Ahmar et al.6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Representativgraf av anti-alginate mAb-baserade ELISA. Alginate produktion för PAO1, PAO1ΔalgD och PAO1 bär uttrycket vektor pHERD20T-algU odlas på PIA med 0,1% arabinose vid 37 °C för 24 h. Alginate samlades in och mättes med hjälp av anti-alginate ELISA med musen anti-alginate monoklonal antikropp. Värden som visas är genomsnittliga alginate ± standardavvikelse av triplicate läsningar. p < 0.0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Jämförelse mellan resultaten från urinsyraanalys och antialginate mAb-baserade ELISA. Alginate produktion från fem olika slemhinnor P. aeruginosa egna stammar odlas på PIA plattor vid 37 ° C för 24 h. Alginate samlades in och mättes med urinsyra analys och anti-alginate ELISA. Värden som visas är genomsnittliga alginate ± standardavvikelse av triplicate läsningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Specificitet och känslighet hos antialginat mAb-baserade ELISA i jämförelse med urinsyrakarbazolanalysen. (A)ELISA kördes med hög (800 μg/ml) och låg (100 μg/ml) inre analyskontroller av tångalginaten. Denna alginate användes också som standard för ELISA. Andra polysackarider testade som kan korsreagera med anti-alginate mAb var amylopectin, amylosa, kollagen och glykogen (500 μg/mL vardera). (B)Karbazolanalys och ELISA ursaltsyra och ELISA kördes med samma spektrum av standardkoncentrationer med tångalginat: 50 μg/mL, 5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,1 μg/ml, och 0,05 μg/ml. Värden som visas är genomsnittliga alginate ± standardavvikelse av triplicate läsningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Direkt testning av patientprov. Antialginat ELISA testades på patienternas slemprover utan tidigare tillväxt på plattor. Tre CF sputum prover som hade tillväxt av slemhinnor P. aeruginosa användes samt två patienten sputum prover som innehöll antingen icke-mucoid P. aeruginosa (Neg 1) eller nr P. aeruginosa tillväxt (Neg 2). Värden som visas är genomsnittliga alginate ± standardavvikelse av triplicate läsningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Både SCV och alginate är viktiga sjukdomsmarkörer inblandade i flera kroniska infektioner. Därför är förmågan att växa SCV samt studera reglering och produktion av alginate av P. aeruginosa integrerad i upptäckten av nya behandlingar för dessa kroniska sjukdomar.
SCV stammar är notoriskt svårt att växa på grund av deras långsamma tillväxttakt4 jämfört med andra P. aeruginosa stammar, som hjälper till i deras antimikrobiell resistens3. Vårt arbete identifierar en specifik form av P. aeruginosa SCV som är ett resultat av mutationer i de novo pyrimidin biosyntes. Här diskuterar vi en tillväxt förutsättning för en sådan SCV att återgå till en normal tillväxt fenotyp när nukleoside uracil levereras. När UMP/UTP lades till på mediet återställdes dock inte den defekta tillväxten (data visades inte). Porinerna som ansvarar för denna selektivitet måste undersökas ytterligare. Tillskott av tillväxtmedier med uracil med hjälp av att lindra den stress som orsakas av pyrimidinsvält (figur 1). På samma sätt, tillägg av fri cytosin till media i samma metod för tillsats av uracil, med hjälp av lindring av pyrimidin svält (uppgifter som inte visas). Både gratis uracil och fri cytosin i media in i cellerna och bidra till att returnera de normala nivåerna av uridin monofosfat (UMP) och uridin tri-fosfat (UTP)6 i cellen, vilket är hur SCV-isolaterna återgick till normal tillväxt.
Det finns flera kritiska steg för alginatmätningarna som kan bidra till att resultaten kan återges. Inledningsvis måste proverna, efter att ha skrotats från plattorna, finnas kvar på isför att blockera nedbrytningen av alginat i provet och resultera i lägre uppmätta koncentrationer. Dessutom är det, före MÄTNINGARna av OD600, viktigt att noggrant blanda provet för att få en homogen lösning som klumpar bildar i prover som har suttit ett tag och som kan störa OD-mätningen och därmed med de slutliga koncentrationsberäkningarna. När du använder ELISA-metoden kan prover från tillväxtplattor behöva spädas särskilt när du använder stammar som producerar en stor mängd alginat eftersom resultaten kan vara utanför standardkurvanintervallet. Vid användning av urinsyran, noggrant virvla kulturrören efter tillsats av karbazol och efter inkubationsen för att säkerställa ett homogent prov. När du arbetar med urinsyra analysen, Är det viktigt att vara försiktig vid hantering av syra blandningen och att göra sig av med proverna ordentligt.
Den traditionella mätmetoden som kräver syrahydrolys av alginate som beskrivs ovan har visat stor potential och har utnyttjats av många forskare i flera år. I detta arbete visar vi proceduren för den traditionella analysen tillsammans med en egen utvecklad ELISA med hjälp av en anti-alginate monoklonal antikropp. Dessa antikroppar har utvecklats hos möss och kan känna igen alginate vid en ännu inte identifierade epitop. Specificiteten hos ELISA-metoden testades noggrant mot alginate från P. aeruginosa samt från tång. Dessutom var ELISA jämförbar med urinsyraanalysen vid kvantifierande alginat i testade bakterieprover (figur 3). Dessutom testades det mot andra polysackarider som kan resultera i falska positiva resultat. Vårt arbete visade en hög specificitet av antikroppen att alginate och dess förmåga att skilja mellan alginate och de andra testade polysackarider(figur 5A). ELISA-protokollet har högre känslighet jämfört med urinsyraanalysen (figur 5B)eftersom vi kunde upptäcka spårnivåer av alginat med ELISA som inte upptäcktes med urinsyraanalysen vid testning av patientslemprover (figur 6). ELISA-metoden kan anpassas för in vivo-mätning av alginat från patienternas sputum (figur 6). Både tillväxtförhållandena med uraciltillskott samt det nyutvecklade ELISA skulle vara kraftfulla verktyg för att bättre förstå P. aeruginosa patogenes i CF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren Hongwei D. Yu är Chief Science Officer och en av grundarna av Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) beviljar R44GM113545 och P20GM103434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C. Sigma factors in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology Reviews. 32 (1), 38-55 (2008).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
