Summary
Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, um die kleine Kolonievariante von Pseudomonas aeruginosazu kulturen. Wir beschreiben auch zwei separate Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung des von P. aeruginosa hergestellten Exopolysaccharidalginats mit einem traditionellen Uronsäure-Carbazol-Assay und einem alginatspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) basierenden ELISA.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa, ein opportunistischer gramnegativer bakterieller Erreger, kann ein Exopolysaccharidalginat überproduzieren, was zu einem einzigartigen Phänotyp namens Schleimhaut führt. Alginat ist mit chronischen Lungeninfektionen verbunden, was zu einer schlechten Prognose bei Patienten mit Mukoviszidose (CF) führt. Das Verständnis der Wege, die die Produktion von Alginat regulieren, kann bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien helfen, die auf die Alginatbildung abzielen. Ein weiterer krankheitsbedingter Phänotyp ist die kleine Kolonievariante (SCV). SCV ist auf das langsame Wachstum von Bakterien zurückzuführen und oft mit einer erhöhten Resistenz gegen antimikrobielle Mittel verbunden. In diesem Beitrag zeigen wir zunächst eine Methode zur Kultivierung einer genetisch definierten Form von P. aeruginosa SCV aufgrund von Pyrimidin-Biosynthesemutationen. Ergänzung der stickstoffhaltigen Basen, Uracil oder Cytosin, gibt das normale Wachstum zu diesen Mutanten, zeigt das Vorhandensein eines Bergungsweges, der freie Basen aus der Umwelt auffängt. Als nächstes diskutieren wir zwei Methoden zur Messung von bakteriellem Alginat. Das erste Verfahren beruht auf der Hydrolyse des Polysaccharids auf sein Uronsäuremonomer, gefolgt von der Derivatisierung mit einem chromogenen Reagenz, Carbazol, während das zweite Verfahren einen ELISA verwendet, der auf einem kommerziell erhältlichen, alginatspezifischen mAb basiert. Beide Methoden erfordern eine Standardkurve für die Quantifizierung. Wir zeigen auch, dass die immunologische Methode spezifisch für die Alginatquantifizierung ist und für die Messung von Alginat in den klinischen Proben verwendet werden kann.
Introduction
Chronische Lungeninfektionen mit Pseudomonas aeruginosa sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit Mukoviszidose (CF). In der frühen Kindheit werden die Patienten von mehreren bakteriellen Krankheitserregern besiedelt, einschließlich nichtmucoiden Isolaten von P. aeruginosa1,2. Die Entstehung der kleinen Kolonievariante (SCV) Isolate sowie Schleimhautisolate ist ein Marker für den Beginn chronischer Infektionen. SCV-Isolate sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsratenhochresistent3 , was sie zu einer schweren Abschreckung in den Behandlungsregimentern und anderen chronischen Infektionen5 von P. aeruginosamacht. Arbeiten von Al Ahmar et al.6 zeigten einen Zusammenhang zwischen SCV und Schleimhaut, der durch de novo pyrimidin Biosynthese verbunden ist. Pyrimidin-Hunger aufgrund von Mutationen in Genen, die an der Pyrimidinproduktion beteiligt waren, führte zu Einem SCV-Phänotyp im Nichtmucoid-Referenzstamm PAO1 und dem Schleimhautderivat PAO581 (PAO1mucA25).
Obwohl Alginat-Überproduktion ein wichtiger Krankheitsmarker für chronische Lungeninfektionen bei CF ist, ist es nicht klar, ob es einen direkten Zusammenhang zwischen der Menge an Alginat und Lungenpathologie gibt, und es ist unklar, ob Alginat als Prognosemarker fürdieBehandlung 7 verwendet werden kann. Die Alginatproduktion wird hauptsächlich durch zwei Operonen reguliert, einen regulatorischen Operon (algUmucABCD)8,9 und den biosynthetischen Operon (algD operon)10,11. Die Alginatproduktion wird durch den Sigma-Faktor AlgU9,12 (auch bekannt als AlgT) und den Abbau des Anti-Sigma-Faktors MucA13streng reguliert. Die Fähigkeit, die Produktion von Alginat vor Ort aus den Sputumproben der Patienten zu überwachen, kann bei der Entwicklung neuer therapeutischer Optionen helfen.
Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, der das Vorhandensein von SCV erkennt, das durch Mutanten verursacht wird, die pyrimidin de novo nicht synthetisieren können. Die Ergänzung von Uracil und/oder Cytosin, der stickstoffhaltigen Basis von Pyrimidinnukleotid, zum Medium aktiviert den Bergungsweg und stellt so das normale Wachstum von Mutanten wieder her. Diese Wachstumsmethode für diese spezifischen SCV-Mutationen kann als Screening-Methode zur Identifizierung von Pyrimidin-Mutationen in Patientenproben verwendet werden. Darüber hinaus diskutieren wir zwei Methoden zum Nachweis und zur Messung von Alginat, das von P. aeruginosahergestellt und abgesondert wurde. Die erste ist die traditionelle Methode14,15,16 der Abbau des Polysaccharids mit einer hohen Konzentration von Säure und dann Hinzufügen eines kolorimetrischen Indikators, um die Konzentration in der Probe zu quantitieren. Die zweite Methode, die in unserem Labor entwickelt wurde, nutzt den Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) mit einem von QED Biosciences entwickelten monoklonalen Antialginat-Antikörper (mAb). Die ELISA-Methode erweist sich als spezifischer und empfindlicher als der Uronsäure-Assay und ermöglicht eine sicherere Anwendung durch die Vermeidung der hochkonzentrierten Schwefelsäure. Mit der Fähigkeit des ELISA, direkt auf Patientensputumproben verwendet zu werden, um Alginat zu messen, kann es als Überwachungs-Diagnose-Tool entwickelt werden, um die Menge an Alginat in der Lunge in verschiedenen Perioden der Infektion zu verfolgen.
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Protocol
1. SCV-Wachstumsbedingungen und physiologische Aktivierung des Bergungsweges
- Erkennung von SCV.
- Streichen Sie die P. aeruginosa-Stämme PAO1,PAO1-PyrD, PAO581 und PAO581-pyrD auf vorgewärmten Pseudomonas-Isolationsagarplatten (PIA) und wachsen bei 37 °C für 48 h. Auf der Wachstumsplatte ein einzelnes Kolonieisolat mit dem SCV-Phänotyp (Koloniegröße von 1 x 3 mm im Gegensatz zur normalen Koloniegröße von 3 x 5 mm) zu identifizieren.
- Wiederholen Sie Schritt 1.1.1, um ein reines Isolat des SCV zu erhalten.
HINWEIS: Das Wachstum kann aufgrund der langsamen Wachstumsrate der SCV-Kolonien bis zu 72 h erfordern.
- Physiologische Aktivierung des Bergungsweges.
- Mit einer sterilen Impfschleife, pflücken Sie die SCV-Kolonie von der PIA-Platte und streifen auf einer vorgewärmten PIA mit 0,1 mM Uracil ergänzt. Anbauplatte bei 37 °C für 24 x 48 h.
HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten PIA-Platten enthalten 20 ml/L Glycerin, die der Mischung vor dem Autoklavieren zugesetzt werden. Nach dem Autoklavieren und nach dem Mischen liegt die Temperatur unter 55 °C, bevor die Platten 11,21 mg/L Uracil (0,1 mM) in die flüssigen Medien gegossen werden. Diese Methode würde helfen, Pyrimidin-Mutationen zu identifizieren, die SCV-Phänotyp in P. aeruginosaverursachen. Wenn der SCV-Phänotyp ein Ergebnis dieser Mutation ist, dann würde ein normales Koloniewachstum und eine normale Größe (3-5 mm) auf den uracil ergänzten PIA-Platten beobachtet werden. Wenn Stämme die Fähigkeit hatten, Alginat zu produzieren, dann wird der Mukoid-Phänotyp auch nach Uracil-Supplementierung zurückkehren.
- Mit einer sterilen Impfschleife, pflücken Sie die SCV-Kolonie von der PIA-Platte und streifen auf einer vorgewärmten PIA mit 0,1 mM Uracil ergänzt. Anbauplatte bei 37 °C für 24 x 48 h.
2. Uronsäure Carbazol Assay
- Aus einer reinen Kultur der gewünschten Sorte getestet werden, identifizieren Sie eine einzelne Kolonie. Mit einem sterilen Zahnstocher, wählen Sie die Kolonie, und legen Sie den Zahnstocher in einem Kultur-Reagenzglas mit 5 ml Pseudomonas Isolationbrühe (PIB). Wachsen Sie in einem Shaker-Inkubator bei 37 °C für 24 h.
HINWEIS: Die folgenden Stämme PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carBund PAO581pyrD wurden auf PIA-Platten oder PIA-Platten angebaut, die mit 0,1 mM Uracil ergänzt wurden, um Alginat zur Messung zu ernten. - Auf eine vorgewärmte PIA-Platte 150 l kultivierte PIB-Brühe (für 15 mm x 100 mm Platten) oder 450 l Brühe (für 15 mm x 150 mm Platten) geben. Mit einem sterilen Zellstreuer die Brühe über die Platte verteilen. Wachsen Sie die Platte bei 37 °C für 24 h.
HINWEIS: Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit, falls vorhanden, von der Platte mit einer Pipette, indem Sie die Platte auf eine Seite kippen. Sowohl PIB- als auch PIA-Platten, die im Protokoll verwendet werden, enthalten 20 ml/L Glycerin, die von Zellen als Kohlenstoffquelle zur Unterstützung der Alginatproduktion verwendet werden. - Mit einem Pipettenregler und einer sterilen 50 ml Pipette, fügen Sie 0,85% NaCl auf den Rasen gewachsen wachsen und proben durch Verschrottung der Platte mit einem Zellstreuer zu sammeln. Die Probe mit einer frischen 50 ml Pipette in ein 50 ml Sammelrohr ansaugen. Wirbeln Sie die Probe auf hoch zu mischen und legen Sie die Proben auf Eis.
HINWEIS: Das Volumen der hinzugefügten 0.85% NaCl variiert je nach Größe der Platte. Verwenden Sie für 15 mm x 100 mm Platten 10 x 30 ml und für 15 mm x 150 mm Platten 20 x 50 ml. - Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) der Proben, indem Sie 1 ml der Probe zu einer Einwegküvette hinzufügen und die OD mit einem Spektralphotometer lesen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um eine Dreifache der Lesevorgänge für jedes Beispiel zu erhalten.
- 3 ml der Schwefelsäure/Borat-Lösung in Kulturröhren geben und auf Eis sitzen lassen. Fügen Sie 350 l der gesammelten Probe SLOWLY in die Säuremischung in den Reagenzgläsern und Wirbel auf niedrig kurz.
- Bereiten Sie Boratbrühe vor, indem Sie 10,099 g Kaliumhydroxid (KOH)-Pulver zu 45 ml Wasser hinzufügen. 24,74 g Borsäure (H3BO3) in das Gemisch geben und Volumen auf 100 ml bringen.
- 1 L Flasche in ein Waschbecken mit Eis geben und Flasche mit 500 ml konzentrierter Schwefelsäure füllen. SLOWLY 15 ml des vorbereiteten Boratbestandes hinzufügen. Die Flasche abkühlen lassen.
- Fügen Sie weitere 10 ml Borat-Lager für insgesamt 25 ml hinzu. Sobald die Flasche abgekühlt ist, bringen Sie das Volumen auf 1 L.
VORSICHT: Diese Methode beruht auf der Verwendung von hochkonzentrierter Schwefelsäure. Es sollten geeignete persönliche Schutzausrüstungen verwendet werden, um die Sicherheit zu gewährleisten, und das ordnungsgemäße Entsorgungsprotokoll der Probe sollte eingehalten werden.
HINWEIS: Für eine Positivkontrolle eine bekannte Konzentration von D-Mannuronsäure und/oder einer bekannten bakteriellen Alginatproben, die durch Alginat produzierende Stämme von P. aeruginosa geerntet und gereinigt werden (z. B.: PAO581-PAO1mucA25). Für eine negative Kontrolle verwenden 0.85% NaCl-Lösung und/oderPAO1-algD (In-Frame-Deletion des AlgD-Gens, das die Bakterien völlig unfähig macht, Alginat zu produzieren). Aus jeder Probe können mehrere Rohre hergestellt werden, um die Anzahl der technischen Wiederholungen zu erhöhen, um die statistische Analyse zu unterstützen. Bereiten Sie 3-5 Tuben jeder Probe vor.
- Fügen Sie 100 l 0,1% Carbazol in Ethanollösung in die Säure-/Probenmischung ein. Kappen Sie das Rohr und den Wirbel auf mittlerer Einstellung für 5 s. Legen Sie in einem trockenen Bad bei 55 °C für 30 min.
- Nach der Inkubation die Rohre und den Wirbel kurz auf hoch entfernen und 5 min abkühlen lassen.
HINWEIS: Farbe zu sehen wäre ein Farbton von lila. Die Farbe bleibt für die Messung für 1 x 2 h stabil. - Lesen Sie die OD530 jedes Rohres, indem Sie 1 ml des Gemischs zu einer sauberen Küvette hinzufügen und die OD der Proben bei 530 nm auf einem Spektralphotometer lesen. Verwenden Sie das Rohr mit 0,85% NaCl als Leerling zum Spektralphotometer.
- Bereiten Sie eine Standardkurve vor, indem Sie die OD530 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von D-Mannuronsäure (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml und 8 g/ml) messen. 2x wiederholen. Extrahieren Sie eine lineare Gleichung aus diesen Messwerten.
HINWEIS: Die Standardkurve muss nur einmal durchgeführt werden. Die daraus extrahierte lineare Gleichung kann für spätere Tests verwendet werden.- Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe mit der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600zu erhalten.
3. ELISA für Alginat-Quantitation
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.4, um Proben für die Alginatmessung zu erhalten.
HINWEIS: Die verwendeten Stämme waren PAO1,PAO1-algDund PAO1 mit pHERD20T-algU. - Mit einer Mikropipette 50 l der gesammelten Probe zu einer unbehandelten 96-Well-Platte hinzufügen. Fügen Sie den Bohrbrunnen 50 l Beschichtungspuffer (Carbonat/Bicarbonatpuffer pH 9.6) hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h.
HINWEIS: Für eine Positivkontrolle kann eine bekannte Konzentration von D-Mannuronsäure und/oder einem bekannten stabilen Alginat produzierenden Stamm (z. B.: PAO581-PAO1mucA25) verwendet werden. Für eine negative Kontrolle verwenden 0.85% NaCl-Lösung und/oderPAO1-algD (in-Frame-Deletion des AlgD-Gens macht die Bakterien völlig unfähig, alginat zu produzieren). Aus jeder Stichprobe können mehrere Bohrungen hergestellt werden, um die Anzahl der technischen Wiederholungen zu erhöhen, um die statistische Analyse zu unterstützen. Bereiten Sie 3-5 Brunnen jeder Probe vor. - Mit einer Spritzflasche die Plattenbrunnen 2x mit 1x Phosphatpufferkochin (PBS) mit 0,05% Tween 20 (PBS-T) waschen, indem Sie die Brunnen füllen und dann entleeren, indem Sie die Platte umdrehen.
- Mit einer Mikropipette fügen Sie den Brunnen 200 l Blockierpuffer (10% Magermilch in PBS-T) hinzu. Bei 4 °C über Nacht inkubieren.
HINWEIS: Wrap Platte in Paraffinfolie oder Schrumpffolie, um Verdunstung im Kühlschrank zu vermeiden. - Mit einer Spritzflasche waschen Sie die Plattenbrunnen 2x mit PBS-T, indem Sie die Brunnen füllen und dann durch Umklappen der Platte entleeren.
- Mit einer Mikropipette 100 l verdünnten Primärantikörper (Mausantialginat monoklonaler Antikörper) in die Brunnen geben und bei 37 °C für 1 x 2 h brüten.
HINWEIS: Primärer Antikörper (Maus-Anti-Alginat-Monoklonaler Antikörper) wurde in einer Konzentration von 0,5 g/ml (Verdünnung von 1:2.000 von 1 mg/ml-Lager) in einer Verdünnungsmittellösung für Antikörper (1% Magermilch in 1x PBS) bereitgestellt. - Mit einer Spritzflasche waschen Sie die Plattenbrunnen 3x mit PBS-T, indem Sie die Brunnen füllen und dann durch Umklappen der Platte entleeren.
- Mit einer Mikropipette 100 l verdünnten Sekundärantikörper in die Brunnen geben und bei 37 °C für 1 x 2 h brüten.
HINWEIS: Sekundärer Antikörper wurde verwendet, um Ziegen-Anti-Maus-Poly-HRP-Antikörper mit einer Konzentration von 0,25 g/ml (Verdünnung von 1:2.000 von 0,5 mg/ml) in einer Verdünnungslösung für Antikörper zu bohren. - Mit einer Spritzflasche waschen Sie die Plattenbrunnen 3x mit PBS-T, indem Sie die Brunnen füllen und dann durch Umklappen der Platte entleeren.
- Mit einer Mikropipette 100 L TMB-ELISA-Lösung (Materialtabelle) hinzufügen und bei Raumtemperatur 30 min im Dunkeln brüten.
HINWEIS: Die Farbe einer positiven Reaktion wäre ein Blauton. - Mit einer Mikropipette 100 l Stop-Lösung (2 N Schwefelsäure) hinzufügen.
HINWEIS: Die Farbe wird von blau zu gelb, wenn die Stop-Lösung hinzugefügt wird. Die Farbe ist für bis zu 30 min stabil, nachdem die Reaktion gestoppt wurde. - Lesen Sie den OD mit einem Plattenleser bei 450 nm.
- Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die OD450 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von D-Mannuronsäure (1.024 g/ml, 512 g/ml, 256 g/ml, 128 g/ml, 64 g/ml, 32 g/ml, 16 g/ml und 8 g/ml) messen. 2x wiederholen. Aus diesen Messwerten wird eine lineare Gleichung extrahiert.
HINWEIS: Die Standardkurve muss nur einmal durchgeführt werden. Die daraus extrahierte lineare Gleichung kann für spätere Tests verwendet werden.- Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe mit der Standardkurve und teilen Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 auf, um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600zu erhalten.
4. Statistische Analyse der Alginatmessung
- Legen Sie in einem grafischen Softwareblatt eine Spalte mit der linearen Gleichung fest, die von der Standardkurve abgeleitet ist. Legen Sie die Y-Achsenergebnisse als Alginatkonzentration und die x-Achse als OD530 für Uronsäure-Assay und OD450 für ELISA fest, um die Alginatkonzentrationen in jeder Probe zu erhalten.
- Um die Alginatmenge in jeder Probe auf die Menge pro 5,5 x108 KBE/ml (1 OD600)zu normalisieren, dividieren Sie die Konzentration jeder oben erhaltenen Probe durch ihren jeweiligen OD600-Wert. Wenn für jede Probe mehrere OD600 gemessen wurden, dividieren Sie durch den mittleren OD600.
- Führen Sie statistische Analysen mit bevorzugter statistischer Software (z. B. GraphPad Prism 7.02) durch.
- Öffnen Sie die Software. Wählen Sie Spalte unter Neue Tabelle & Diagramm und wählen Sie den einwegs aNOVA-Datensatz.
- Benennen Sie jede Spalte mit der getesteten Sorte und fügen Sie die Alginatkonzentrationen darunter hinzu.
- Nachdem Sie alle Daten ein- und eingeteilt haben, klicken Sie im oberen Menü auf Analysieren. Dadurch wird ein Analyseeinstellungsfenster geöffnet. Wählen Sie die entsprechenden Parameter für Tests aus, und geben Sie an, ob mehrere Vergleiche ausgeführt werden müssen.
HINWEIS: Nach der Analyse enthält der Datensatz einen p-Wert, der helfen würde, die statistische Signifikanz der Daten zu bestimmen. Die Daten würden als statistisch signifikant angesehen, wenn der p-Wert kleiner als der festgelegte Wert ist (normalerweise wird der Wert für p < 0,01 festgelegt). - Wählen Sie unter der Registerkarte Diagramm den Bar-Graph-Typ aus. Dadurch werden die Daten mit dem angegebenen Titel aus dem Eingabedatenblatt automatisch dargestellt. Geben Sie die statistische Signifikanz der Daten nach Bedarf an, indem Sie das *-Symbol über Verbindungslinien zwischen den Balken von Interesse anzeigen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt Platten von PAO1 und PAO581 mit oder ohne Inframe-Deletion im PyrD-Gen (ein Gen im Pyrimidin-Biosyntheseweg), das zu SCV6führt. Die PAO1 SCV Mutante wurde auf normales Wachstum als Reaktion auf Uracil-Supplementierung wiederhergestellt (Abbildung 1A,B). Darüber hinaus wurde die PAO581-pyrD-SCV-Mutation mit der gleichen Uracil-Behandlung in die Schleimhaut zurückgeführt, da der Stamm PAO581 eine zusätzliche MucA25-Mutation hat (Abbildung 1C,D). Die Ergebnisse für den Uronsäure-Carbazol-Assay sind in Abbildung 26dargestellt. Die Daten stellen Proben von PAO581 und PAO581 mit Mutationen in Genen dar, die Pyrimidin de Novo Biosynthese regulieren, die auf PIA angebaut werden, und PIA, ergänzt mit 0,1 mM Uracil (Abbildung 2A). Die Daten zeigen, dass das Vorhandensein von Uracil in den Medien zur Umwandlung des mutierten Stammes zurück in die Schleimhaut führt (wie durch die Zunahme/wiederhergestellte Alginatproduktion gesehen) (Abbildung 2B). Die Ergebnisse für den monoklonalen Antikörper-basierten ELISA mit Antialginat sind in Abbildung 3dargestellt. Die Daten zeigen PAO1, PAO1 mit einer In-Frame-Deletion des AlgD-Gens, das das schlüsselliche Alginat-Biosyntheseenzym GDP-Mannose-Dehydrogenase kodiert, und PAO1 mit einem Expressionplasmid pHERD20T mit dem Hauptalginat-spezifischen Sigma-Faktor algU, wenn es auf PIA-Platten mit Arabinose für die Induktion des pBAD-Promoters in pHERD20T angebaut wird. Diese Daten zeigen die Nicht-Mukoid-Spiegel von Alginat gemessen für PAO1, und PAO1-algD im Vergleich zu den Mukoid-Spiegel von Alginat gemessen für PAO1+pHERD20T-algU. Abbildung 4 vergleicht die beiden Methoden der Alginatmessungen zusammen. Die Ergebnisse waren statistisch nicht signifikant, wenn man sie unter Verwendung einer zweiseitig gehenden ANOVA mit p < 0,01 untereinander betrachtete. Abbildung 5A vergleicht die Kreuzreaktivität des AntialginatmAb mit anderen Polysacchariden wie Amylopectin, Amylose, Kollagen und Glykogen. Abbildung 5B zeigt den Vergleich in Spezifität und Empfindlichkeit des Uronsäure-Carbazol-Assays mit dem neu entwickelten monoklonalen Anti-Alginat-Antikörper-ELISA mit der Kontrolle unter Verwendung des hochgereinigten Algenalginats (Materialtabelle). Abbildung 6 zeigt direkte Tests des ELISA an Patientensputumproben, die positiv auf Mukoid P. aeruginosa und Patienten waren, die keine Schleimhaut P. aeruginosaenthielten.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder der De-Novo-Pyrimidin-Biosynthesemutationen, die zu SCV-Phänotyp in PAO1 und PAO581 führen. Das Bild zeigt PAO1 (links) und PAO1'pyrD (rechts) auf PIA-Platten (A) und PIA-Platten, ergänzt mit Uracil (B) bei 37 °C für 48 h. Das Bild zeigt PAO581 (links) und PAO581'pyrD (rechts) auf PIA-Platten (C) und PIA-Platten, ergänzt mit Uracil (D) bei 37 °C für 48 h. Diese Zahl wurde von der Arbeit von Al Ahmar et al.6geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentativer Graph des Uronsäure-Carbazol-Assays. (A) Das Bild der Schleimhaut P. aeruginosa Stamm PAO581(PAO1mucA25) gewachsen bei 37 °C für 24 h auf PIA-Platten (links) und PIA-Platten mit Uracil (rechts). (B) Alginat-Produktion für PAO581, PAO581carA, PAO581carBund PAO581pyrD, wenn sie auf PIA-Platten mit und ohne Uracil bei 37 °C für 24 h angebaut wird. Alginat wurde mit dem Standard-Carbazol-Test gesammelt und gemessen. Die angezeigten Werte sind mittlere alginat - Standardabweichung von dreifachen Lesevorgängen. (**** = p < 0,0001). Diese Zahl wurde von der Arbeit von Al Ahmar et al.6geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentatives Diagramm des Antialginat mAb-basierten ELISA. Alginat-Produktion für PAO1,PAO1-AlgD und PAO1 mit dem Expressionsvektor pHERD20T-algU, der auf PIA mit 0,1% Arabinose bei 37 °C für 24 h angebaut wird. Alginat wurde mit dem Antialginat-ELISA mit dem monoklonalen Antikörper gegen die Maus anti-alginat erhoben und gemessen. Die angezeigten Werte sind mittlere alginat - Standardabweichung von dreifachen Lesevorgängen. p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vergleich der Ergebnisse des Uronsäure-Assays und des Antialginat-mAb-basierten ELISA. Alginatproduktion aus fünf verschiedenen Mukoid P. aeruginosa proprietären Stämmen, die auf PIA-Platten bei 37 °C für 24 h angebaut werden. Alginat wurde mit dem Uronsäure-Assay und dem Antialginat-ELISA gesammelt und gemessen. Die angezeigten Werte sind mittlere alginat - Standardabweichung von dreifachen Lesevorgängen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Spezifität und Empfindlichkeit des Antialginat mAb-basierten ELISA im Vergleich zum Uronsäure-Carbazol-Assay. (A) ELISA wurde mit hohen (800 g/ml) und niedrigen (100 g/ml) internen Assay-Kontrollen des Algenalginats ausgeführt. Dieses Alginat wurde auch als Standard für den ELISA verwendet. Andere polysaccharide, die mit Antialginat mAb kreuzreagieren können, waren Amylopectin, Amylose, Kollagen und Glykogen (jeweils 500 g/ml). (B) Uronsäure-Carbazol-Assay und ELISA wurden mit dem gleichen Bereich von Standardkonzentrationen mit Algenalginat durchgeführt: 50 g/ml, 5 g/ml, 1 g/ml, 0,5 g/ml, 0,1 g/ml und 0,05 g/ml. Die angezeigten Werte sind mittlere alginat - Standardabweichung von dreifachen Lesevorgängen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Direkte Testderjahre für Patientenproben. Antialginat-ELISA wurde an Sputumproben der Patienten ohne vorheriges Wachstum auf Denplates getestet. Es wurden drei CF-Sputumproben mit Einem Wachstum von Mukoid P. aeruginosa sowie zwei Patienten-Sputumproben verwendet, die entweder Nicht-Mukoid P. aeruginosa (Neg 1) oder kein P. aeruginosa Wachstum (Neg 2) enthielten. Die angezeigten Werte sind mittlere alginat - Standardabweichung von dreifachen Lesevorgängen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Sowohl SCV als auch Alginat sind wichtige Krankheitsmarker, die an mehreren chronischen Infektionen beteiligt sind. Daher ist die Fähigkeit, SCV zu züchten sowie die Regulation und Produktion von Alginat durch P. aeruginosa zu untersuchen, ein wesentlicher Bestandteil der Entdeckung neuartiger Behandlungen für diese chronischen Krankheiten.
SCV-Stämme sind aufgrund ihrer langsamen Wachstumsrate4 im Vergleich zu anderen P. aeruginosa-Stämmen, die in ihrer antimikrobiellen Resistenzhilft,bekanntlich schwer zu wachsen 3 . Unsere Arbeit identifiziert eine spezifische Form von P. aeruginosa SCV, die das Ergebnis von Mutationen in der de novo pyrimidin Biosynthese sind. Hier diskutieren wir eine Wachstumsbedingung für solche SCV zu einem normalen Wachstum Phänotyp zurückkehren, wenn Nukleosid Uracil geliefert wird. Wenn jedoch UMP/UTP dem Medium hinzugefügt wurde, wurde das fehlerhafte Wachstum nicht wiederhergestellt (Daten wurden nicht angezeigt). Die für diese Selektivität verantwortlichen Porine müssen weiter untersucht werden. Supplementierung der Wachstumsmedien mit Uracil zur Linderung des durch Pyrimidin-Hunger verursachten Stresses (Abbildung 1). Ebenso wird die Zugabe von freiem Cytosin zu den Medien in der gleichen Methode der Zugabe von Uracil, unterstützt bei der Linderung des Pyrimidin-Hungers (Daten nicht gezeigt). Sowohl freies Uracil als auch freies Zytosin in den Medien gelangen in die Zellen und helfen, die normalen Konzentrationen von Uridinmonophosphat (UMP) und Uridintriphosphat (UTP)6 in der Zelle zurückzugeben, wodurch die SCV-Isolate wieder zu normalem Wachstum zurückkehren.
Es gibt mehrere kritische Schritte für die Alginatmessungen, die zur Reproduzierbarkeit der Ergebnisse helfen könnten. Zunächst müssen die Proben, nachdem sie von den Platten verschrottet wurden, auf Eis bleiben, um den Abbau von Alginat in der Probe zu blockieren und zu niedrigeren gemessenen Konzentrationen zu führen. Darüber hinaus ist es vor DEN OD600-Messungen wichtig, die Probe gründlich zu mischen, um eine homogene Lösung zu erhalten, da sich Klumpen in Proben bilden, die schon eine Weile sitzen und die die OD-Messung und damit die abschließenden Konzentrationsberechnungen stören könnten. Bei Verwendung der ELISA-Methode müssen Proben von Wachstumsplatten möglicherweise verdünnt werden, insbesondere wenn Stämme verwendet werden, die eine große Menge alginat erzeugen, da die Ergebnisse möglicherweise außerhalb des Standardkurvenbereichs liegen. Bei Verwendung der Uronsäure die Kulturröhren nach Zugabe des Carbazols und nach der Inkubation gründlich wirbeln, um eine homogene Probe zu gewährleisten. Bei der Arbeit mit dem Uronsäure-Assay ist es wichtig, beim Umgang mit dem Säuregemisch vorsichtig zu sein und die Proben ordnungsgemäß zu entsorgen.
Die oben beschriebene traditionelle Messmethode, die eine säurehaltige Hydrolyse von Alginat erfordert, hat großes Potenzial gezeigt und wird seit mehreren Jahren von vielen Forschern genutzt. In dieser Arbeit zeigen wir das Verfahren für den traditionellen Assay zusammen mit einem hauseigenen eLISA mit einem antialginat monoklonalen Antikörper. Diese Antikörper wurden bei Mäusen entwickelt und können Alginat an einem noch zu identifizierenden Epitop erkennen. Die Spezifität der ELISA-Methode wurde gründlich gegen Alginat aus P. aeruginosa sowie gegen Algen getestet. Darüber hinaus war der ELISA mit dem Uronsäure-Assay bei der Quantifizierung von Alginat in getesteten Bakterienproben vergleichbar (Abbildung 3). Darüber hinaus wurde es mit anderen Polysacchariden getestet, die zu falsch positiven Ergebnissen führen könnten. Unsere Arbeit zeigte eine hohe Spezifität des Antikörpers gegen Alginat und seine Fähigkeit, zwischen Alginat und den anderen getesteten Polysacchariden zu unterscheiden (Abbildung 5A). Das ELISA-Protokoll hat eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zum Uronsäuretest (Abbildung 5B), da wir in der Lage waren, Spuren von Alginat mit ELISA zu erkennen, die nicht mit dem Uronsäure-Assay bei der Prüfung von Patientensputumproben nachgewiesen wurden (Abbildung 6). Die ELISA-Methode kann für die In-vivo-Messung von Alginat aus dem Sputum der Patienten angepasst werden (Abbildung 6). Sowohl die Wachstumsbedingungen mit Uracil-Supplementierung als auch der neu entwickelte ELISA wären leistungsfähige Werkzeuge, um P. aeruginosa pathogenese bei CF besser zu verstehen.
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Disclosures
Der Autor Hongwei D. Yu ist Chief Science Officer und Mitbegründer von Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den Nationalen Instituten für Gesundheit (NIH) Stipendien R44GM1113545 und P20GM103434 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | via Fisher Scientific |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Bio-grade |
| Accu Block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Assay Plates 96-well | CoStar | 2021-12-20 | |
| Bench Top Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | G560 | |
| Boric Acid | Research Products International Corp. | 10043-35-3 | |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbazole | Sigma | C-5132 | |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma | C3041 | |
| Centrifuge Tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Culture Test Tubes | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Cuvette Polystyrene (1.5 mL) | Fisher Scientific | 14955127 | via Fisher Scientific |
| Cytosine | Acros Organics | 71-30-7 | |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| D-Mannuronic Acid Sodium | Sigma Aldrich | SMB00280 | |
| FMC Alginate | FMC | 2133 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP906-5 | For Molecular Biology |
| Mouse Anti-Alginate Monoclonal Antibody | QED Biosciences | N/A | Lot # :15725/15726 |
| Phosphate Buffered Saline Powder (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Pierce Goat Anti-Mouse Poly-HRP Antibody | Thermo Scientific | 32230 | via Fisher Scientific |
| Potassium Hydroxide | Fisher Scientific | 1310-58-3 | via Fisher Scientific |
| Prism 7 | GraphPad | ||
| Pseudomonas Isolation Agar (PIA) | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Isolation Broth (PIB) | Alpha Biosciences | P16-115 | via Fisher Scientific |
| Round Toothpicks | Diamond | Any brand | |
| Seaweed alginate (Protanal CR 8133) | FMC Corporation | ||
| Skim Milk | Difco | 232100 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | BioRad | 170-2525 | or preferred vendor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S-5886 | |
| SpectraMax i3x Multi-mode MicroPlate Reader | Molecular Devices | i3x | or preferred vendor |
| Sterile Petri Dish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713 | via Fisher Scientific |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A298-212 | Technical Grade |
| Sulfuric Acid (2 Normal -Stop Solution) | R&D Systems | DY994 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Uracil | Acros Organics | 66-22-8 |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiological Reviews. 60 (3), 539-574 (1996).
- Hogardt, M., Heesemann, J. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa during persistence in the cystic fibrosis lung. International Journal of Medical Microbiology. 300 (8), 557-562 (2010).
- Evans, T. J. Small colony variants of Pseudomonas aeruginosa in chronic bacterial infection of the lung in cystic fibrosis. Future Microbiology. 10 (2), 231-239 (2015).
- Johns, B. E., Purdy, K. J., Tucker, N. P., Maddocks, S. E. Phenotypic and Genotypic Characteristics of Small Colony Variants and Their Role in Chronic Infection. Microbiology Insights. 8, 15-23 (2015).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogones. 14 (2), e1006842 (2018).
- Al Ahmar, R., Kirby, B. D., Yu, H. D. Pyrimidine Biosynthesis Regulates Small Colony Variant and Mucoidy in Pseudomonas aeruginosa Through Sigma Factor Competition. Journal of Bacteriology. 201 (1), e00575-e00618 (2019).
- Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Molecular Microbiology. 56 (2), 309-322 (2005).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). Journal of Bacteriology. 179 (11), 3711-3720 (1997).
- Schurr, M. J., Yu, H., Martinez-Salazar, J. M., Boucher, J. C., Deretic, V. Control of AlgU, a member of the sigma E-like family of stress sigma factors, by the negative regulators MucA and MucB and Pseudomonas aeruginosa conversion to mucoidy in cystic fibrosis. Journal of Bacteriology. 178 (16), 4997-5004 (1996).
- Rehm, B. H. A. Alginate Production: Precursor Biosynthesis, Polymerization and Secretion. Alginates: Biology and Applications. Rehm, B. H. A. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. 55-71 (2009).
- Remminghorst, U., Rehm, B. H. Bacterial alginates: from biosynthesis to applications. Biotechnology Letters. 28 (21), 1701-1712 (2006).
- Potvin, E., Sanschagrin, F., Levesque, R. C.
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 84 (4), 595-607 (2012).
- Bowness, J. M. Application of the carbazole reaction to the estimation of glucuronic acid and flucose in some acidic polysaccharides and in urine. The Biochemical Journal. 67 (2), 295-300 (1957).
- Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Applied Environmental Microbiology. 43 (5), 1151-1159 (1982).
- Knutson, C. A., Jeanes, A. A new modification of the carbazole analysis: application to heteropolysaccharides. Analytical Biochemistry. 24 (3), 470-481 (1968).
