Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling av Mikrotubulinettverket Dynamics ved spinning disk mikroskopi i Monopolar mitotisk aksling

Published: November 15, 2019 doi: 10.3791/60478
Automatic Translation
1,2, 1
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

Her presenterer vi en robust og detaljert metode for mikrotubulinettverket dynamikk analyse i celler synkronisert i prometaphase ved hjelp av Live-celle spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi og MATLAB-basert bildebehandling.

Abstract

Vi beskriver en modifikasjon av en etablert metode for å fastslå mikrotubulinettverket dynamikk i levende celler. Protokollen er basert på uttrykk for en genetisk kodet markør for de positive endene av mikrotubuli (EB3 merket med tdTomato fluorescerende protein) og høy hastighet, høy oppløsning, Live-celle Imaging bruker spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi. Celle syklus synkronisering og økt tetthet av mikrotubuli oppnås ved å hemme centrosomal separasjon i mitotisk celler, og analyse av veksten utføres ved hjelp av åpen kildekode-U-Track programvare. Bruken av en lys og rød-forskjøvet fluorescerende protein, i kombinasjon med lavere laser kraft og redusert eksponeringstid som kreves for spinning disk mikroskopi redusere Phototoksisitet og sannsynligheten for lys-indusert gjenstander. Dette gjør det mulig for Imaging et større antall celler i samme forberedelse og samtidig opprettholde cellene i et vekstmedium under standard kultur forhold. Fordi analysen er utført i en veiledet automatisk måte, er resultatene statistisk robust og reproduserbar.

Introduction

Mikrotubuli (MTs) er svært dynamiske strukturer som finnes i nesten alle eukaryote celler og i noen bakterier1. Sammen med utgangen og middels filamenter, forme de cytoskeleton2,3. Cell Division4, molekyl transport5, flagellar slo6, følelsen av omgivelsene gjennom primær Flimmerhår7, hørsel (kinocilium)8,9, embryogenesis10,11,12, invasjon og metastasering13,14, og til og med minne formasjon15,16,17,18, og mange andre prosesser bruker først og fremst MTs. deltakelse av MTs i alle disse hendelsene ville være umulig uten deres bemerkelsesverdige evne til å raskt bytte mellom vekst (polymerisering) og krymping (depolymerisering). Denne egenskapen er beskrevet som dynamisk ustabilitet19. MT dynamicity er endret i mange patologiske tilstander20,21,22. Derfor kan fastsettelse av arten av denne eiendommen bidra til å forstå sykdoms mekanismer og senere deres behandling.

En lang liste av metoder er utviklet for MT dynamikk analyse, hvorav de fleste er basert på Imaging teknikker23. I utgangspunktet ble bredt felt lys mikroskop brukt for å observere dannelsen av tubulin polymerer i vitro24. Oppdagelsen av end-binding (EB)-proteiner som samler på Mt Plus-ender og utvikling av metoder for å fluorescensmerkete etikett proteiner gjorde det mulig å observere atferden til MTS direkte i levende celler med bredt felt og konfokalmikroskopi fluorescens mikroskop25,26,27. En EB-protein er ende-bindende protein 3 (EB3)28; ved overexpressing og sporing EB3 smeltet til et fluorescerende protein, MT Plus-end montering priser kan fastsettes29,30.

Konfokalmikroskopi laserskanning fluorescens mikroskopi (CLSM) brukes ofte til å følge MT dynamikk. Imidlertid, denne tenkelig teknikk oppstiller en høy risk av Phototoksisitet og photobleaching, to uønsket prosesser for bo cellen og svak eksemplar tenkelig31. For å oppnå et bedre signal-til-støy-forhold, bør laseren makt og eksponerings varighet være høy nok, mens ikke skade prøvene, og dette krever ofre oppløsning i bytte for hastighet. Et egnet alternativ til CLSM er spinning disk mikroskopi32. Dette Imaging modalitet er basert på bruk av en Nipkow disk33, som består av en bevegelig disk bærer en rekke pinholes, og arbeider ekvivalent til mange CLS mikroskop Imaging samme prøve samtidig34. Derfor vil lyset fra laseren belyse flere regioner i prøven samtidig, men beholde den konfokalmikroskopi naturen. Den Nipkow disken, derfor tillater innhenting av bilder som ligner på CLSM men raskere og bruker mindre laser kraft. Den Nipkow disken ble ytterligere forbedret ved Yokogawa Electric, som introduserte en andre disk med en rekke mikrolinser på det som individuelt direkte lys inn i en respektive pinhole, ytterligere redusere Phototoksisitet og photobleaching35. Således, spinning disk laserskanning mikroskopi ble en metode for valg for Live celle Imaging, og det gjør det mulig å få bilder med høy signal-til-støy-forhold ved en høy hastighet31,36, som er avgjørende for å løse signaler som de fra den raskt voksende Mt ender.

MT dynamikk avvike midlertidig. Mitotisk MTS er for eksempel mer dynamiske enn Interphase de37,38. På samme måte har det blitt observert forskjeller i vekstraten og krymping selv innenfor den samme celle syklus fasen, for eksempel mitose39,40. Derfor, for å unngå falske datainnsamling, bør målingen av MT dynamikk begrenses til et smalt tidsvindu under cellesyklusen. For eksempel kan måling av MT Dynamics i prometaphase oppnås ved å behandle cellene med dimethylenastron (DME), en monastrol analog som hemmer motoren kinesin Eg541 og hindrer dannelsen av bipolar mitotisk spindel42. Hemming av celler ved prometaphase med Eg5 inhibitor DME og andre monastrol derivater påvirker ikke Mt Dynamics43,44,45, som gjør DME et nyttig verktøy for å studere Mt Dynamics både i faste og levende celler44.

Her kombinerer vi metoden for MT dynamikk analyse i prometaphase celler beskrevet av Ertych et al.44 med dual spinning disk Imaging. Denne metoden tillater måling av MT dynamikk i prometaphase celler samlet inn fra en enkelt fokal plan med høyere bildefrekvens, men uten photobleaching og minimal Phototoksisitet. Videre, som en fluorescerende reporter, bruker vi tandem dimer tomat fluorescerende protein (tdTomato) som har forbedret lysstyrke og photostability i forhold til det grønne fluorescerende proteinet (EGFP) og er spent med lavere energi lys46. Derfor krever tdTomato mindre laser kraft for eksitasjon og er mindre fototoksisk. Alt i alt forbedrer vi metoden ytterligere ved å redusere Phototoksisitet og forbedre oppløsningen og post prosessering som kreves for MT dynamikk analyse. I tillegg oppretter vi et grunnlag for fremtidige endringer av metoden ved å kombinere den med andre synkroniserings teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. seeding av HeLa Cells

  1. Klargjør 2 mL 5 μg/mL fibronektin oppløsning i fosfat bufret Saline (PBS) og tilsett 450 μL av den i hver brønn av en 4 brønn kamret dekkglass (#1.5). Ruge lysbildet i 15 minutter ved 37 ° c og 5% CO2.
  2. Skyll asynkront voksende HeLa celler med Dulbecco ' s fosfat bufret Saline (DPBS) og ruge med Trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) i 5 min ved 37 ° c. Stopp enzymatisk reaksjon ved tilsetning av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplert med 10% varme-deaktivert fosterets kalv serum (FCS) ved 3:1 (v:v) ratio av lagt Trypsin-EDTA.
    Merk: Jakten celler ble opprettholdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-deaktivert FCS ved 37 ° c og 5% CO2 og ble rutinemessig passert når de nådde 80-90% confluency som beskrevet ovenfor.
  3. Bestem celle konsentrasjonen ved hjelp av et Neubauer kammer. Bland en 50 μL alikvot av celle fjæringen med trypan blå ved 1:1 (v:v) ratio, resuspend, og overføring 10 μL av suspensjonen inn i kammeret. Tell bare de trypan blå-negative cellene i de fire store rutene (for detaljer se Phelan et al.47). Utlede celle konsentrasjonen fra det telte celle nummeret ved hjelp av følgende formel:
    Equation 1
  4. Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 x g for 2 min. Resuspend med fersk RPMI 1640 for å oppnå 1 x 106 celler/ml.
  5. Fjern fibronektin fra kamret dekkglass, vask brønnene to ganger med DPBS, og frø 50 000 celler per brønn.
  6. Returner kamret dekkglass med cellene til inkubator og dyrke dem i 24 timer ved 37 ° c og 5% CO2.

2. uttrykk for pEB3-tdTomato i HeLa celler

  1. Klargjør en 1,5 mL mikrosentrifugen slange. For hvert rør, fortynne 2 mikrogram pEB3-tdTomato48 med transfeksjoner buffer (syntetisk produkt i vandig oppløsning) til et endelig volum på 396 μL.
  2. Tilsett 4 μL av transfeksjoner reagens (ikke-lipidic, inneholdende polyethylenimine) til det første røret, og Vortex blandingen umiddelbart for nøyaktig 10 s.
  3. Snurr kort ned i røret med en mikrosentrifugen og ruge ved romtemperatur (RT) i 10 minutter.
  4. Fjern jakten cellene fra inkubator. Dråpevis, tilsett 100 μL av transfeksjoner blandingen til hver brønn av en 4 brønn kamret dekkglass, og returnere cellene til inkubator.
  5. Etter 4 h av inkubasjons ved 37 ° c og 5% CO2, supplere cellene med frisk vekstmedium og ruge i minst 24 timer ved 37 ° c og 5% co2.
    Merk: Det er nødvendig å optimalisere transfeksjoner forhold for hver celle type. Uttrykket nivåer må være lav nok til å tillate identifisering av enkelt MT voksende ender. Alternativt kan en cellelinje stabilt uttrykker EB3-tdTomato brukes i eksperimenter; Dette vil redusere variasjon i uttrykket nivåer av EB3-tdTomato mellom preparater og mellom celler fra samme forberedelse49.

3. synkronisering og live-Cell Imaging av pEB3-tdTomato-uttrykke jakten celler

  1. Forbered en 2,5 μM løsning av dimethylenastron (DME) i fenol-rød fri Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) supplert med 10% FCS og 2 mM L-glutamin eller en alternativ glutamin forsyning.
  2. Erstatt vekst mediet i den kamret dekkglass med 500 μL av vekst mediet som inneholder 2,5 μM DME og ruge cellene ved 37 ° c og 5% CO2.
  3. Etter 3,5 h av inkubasjons med DME, Overfør cellene til mikroskopet, Monter kamret dekkglass i et miljøkammer med mørke paneler for bildebehandling ved 37 ° c og 5% CO2, og videre ruge til den totale inkubasjonstiden er 4 timer.
    Merk: Vedlikehold av temperatur ved 37 ° c uten svingninger er avgjørende for eksperimentet.
  4. Utfør time-lapse Imaging på en invertert mikroskop utstyrt med en 100 N.A. 1,49 olje nedsenking mål, en dual spinning disk konfokalmikroskopi system, og en pålitelig autofokus system for kontinuerlig vedlikehold av fokalplanet. Definer bilde parametrene som følger.
    Merk: Vi bruk en elektron multiplisere belaste-forente apparat kameraet (EM-CCD).
    1. For EB3-tdTomato eksitasjon, bruk en 561 NM laser linje med 200 MS eksponeringstid. Samle det utsendte lyset gjennom en Quadruple bånd pass (405, 488, 561, 640 NM) dichroic speil og et 600/52 NM utslipps filter.
      Merk: Laser makt kan justeres for hver avbildet celle for å hindre bilde metning. I all tid-lapse filmer gitt her laseren makten ble satt til 5,3 mW.
    2. Finn en celle i profase og fokus i Z-flyet som tilsvarer midten av monopolar mitotisk spindel. Skaff bilder hver 0,5 s over totalt 1 min uten binning og ingen belysning mellom eksponeringer.

4. analyse av MT Dynamics bruke U-Track v 2.2.0

  1. Å analysere MT dynamikk en numerisk datamiljø programvare er nødvendig (f. eks, MATLAB).
    Merk: Grunnleggende forståelse av programvaren er tilstrekkelig for analysen. Omfattende hjelp materiale og opplæring er tilgjengelig på utviklerens nettsted (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
  2. Dataoverføre (https://GitHub.com/DanuserLab/u-Track) og installere det åpen-kilde u-bane v 2.2.0 programvare fulgte det detaljert instruksjoner gitt inne det "Readme_u-Track. pdf" arkiv50,51,52.
  3. Innlede det numerisk-analyseprogramvare og sammenlegge U-spor v 2.2.0 brosjyre med undermapper inn i programvare søke sti.
  4. Fra kommandoen vinduet kaller "movieSelectorGUI". Dette åpner et dialogvindu der RAW-filer som genereres av programvaren for bildeinnhenting ved mikroskopet, kan importeres (supplerende figur 1, figur 2, Figur 3, figur 4).
    Merk: U-Track-programvaren er kompatibel med andre bildedata formater. Den bruker bio-formater, som anerkjenner ulike Life Science dataformater53.
  5. Størrelsen på hvert bilde leses automatisk fra metadataene. Manuelt angi den numeriske blenderåpningen for målet (i dette tilfellet 1,49) og tidsintervallet (0,5 s) som brukes for bildebehandling (supplerende figur 1B). I tillegg kan informasjon om eksitasjon bølgelengde, fluoroforen og eksponeringstid også gis, men de er ikke avgjørende for videre analyse.
  6. Når alle bildene er lastet, lagre den angitte time-lapse serien som en filmliste ved å velge "Lagre som filmliste". På høyre side av dialogvinduet velger du "U-Track" alternativet og trykk "Continue" (supplerende figur 1C).
    Merk: Verdiene er optimalisert for HeLa celler. Hvis du bytter til en annen cellelinje, skal verdiene defineres på nytt. Du kan også bruke innstillingene som er anbefalt av programvareutviklere. Den detaljerte forklaringen på hver av parametrene og hvordan de skal defineres finnes i den tekniske rapporten som følger med den forrige versjonen av programvaren, plusTipTracker50.
  7. Fra popup-vinduet velger du "Mikrotubulinettverket Plus-ender" og trykker "OK" (supplerende figur 1C). Det nye dialogvinduet kan bestemme parametrene for de tre trinnene i analysen (supplerende figur 1d), som er deteksjon, sporing og spor analyse.
  8. I trinn 1 velger du "innstillinger", og fra en rullegardinmeny velger du "Comet Detection" som en gjenkjennings metode (supplerende figur 2b).
    1. Fra den nye dialogvinduet definerer parametrene for forskjellen av Gaussians filter og vannskille segmentering som følger (supplerende figur 2C): maske prosessen som skal brukes for deteksjon = none; Low-pass Gaussian standardavvik = 1 piksel; Høy pass Gaussian standardavvik = 3 piksler; Minste terskel = 3 standardavvik; Terskel trinn størrelse = 0,25 standardavvik. Velg «Bruk innstillinger på alle filmer» og «Bruk».
  9. I trinn 2 er parametrene for kobling, gap lukking, sammenslåing og splitting og Kalman filter funksjoner definert i tre trinn, som uthevet i rosa, grønt og blått, i henhold til dette (supplerende figur 3b). For disse trinnene velger du "Mikrotubulinettverket Plus-end Dynamics" og fra "setting"-alternativet definerer verdiene som angitt i supplerende figur 3c – E, henholdsvis.
    1. Hvis du har problemer med dimensionality, velger du «2» fra rullegardinmenyen. Bruk maksimal gap til å lukke = 5 rammer; Minimum lengde på spor segmenter fra første trinn = 3 bilder. Som før, velg "Bruk innstillinger på alle filmer" og klikk på "Apply".
  10. I trinn 3 i analysen klassifiseres de oppdagede MT-sporene (supplerende figur 4). Som en bane analysemetode, velg "Mikrotubulinettverket Dynamics klassifisering" og definere parametrene gjennom "setting"-knappen som angitt i supplerende figur 4b, C. Etter det, foretrekker det "søke innfatningene for alle film" bokse med og falle i staver opp på "søke".
  11. Når alle parametrene er definert, fra "kontroll panel-U-Track"-vinduet (supplerende figur 1d) Velg "Apply sjekk/uncheck til alle filmer" og "Kjør alle filmer" boksene og trykk "Run". Dette vil starte MT analyse av time-lapse serien.
  12. En gang filmen bearbeiding er fullført, en beskjed "din film () ha blitt bearbeidet med hell" er vist. Trykk "OK", deretter "Lagre".
  13. Nå er det trygt å avslutte numerisk analyseprogramvare. Resultatene fra film behandlingen lagres i undermappe strukturer som m-filer i mappen der RAW-filene er lagret.

5. statistisk analyse av MT Dynamics

  1. Importer m-filene til et foretrukket statistisk analyse program.
    Merk: I vårt tilfelle importerer vi først filene i et standard regneark for å gjøre dem lesbare. M-filene inneholder statistisk informasjon (median, gjennomsnitt og standardavvik) på forskjellige parametre (f.eks. vekst hastighet, MT-dynamicity). Den detaljerte listen over parametrene er gitt i den tekniske rapporten som følger med den forrige versjonen av programvaren, plusTipTracker50,52. De genererte m-filer kan også importeres til annen databehandling programvare.
  2. Velg "vekst hastighet gjennomsnittlig" parameter og importere den til en tabell for statistikk og visning. Skriv inn informasjon om andre parametere (for eksempel "dynamicity") i en ny tabell eller i en ny kolonne i samme grupperte tabell og plott.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter den gitte protokollen skissert i figur 1a, den PEB3-tdTomato plasmider ble midlertidig uttrykt i asynkront voksende HeLa celler. Cellene ble synkronisert 48 h etter transfeksjoner ved prometaphase gjennom DME behandling (figur 1B). Dette trinnet sørget for at målingen av MT dynamikk ble alltid gjort i samme fase av celle syklus. Tidsforløp filmene ble videre behandlet og analysert med U-Track v 2.2.0 som beskrevet i tilleggs dokumentasjonen50,51,52. Selv om pluss-end bindende proteiner sporer bare MT vekstfaser, U-Track v 2.2.0 extrapolates informasjonen på pause og krymping hendelser ved å koble sekvensiell vekstfaser og rekonstruere full baner26,50. Algoritmen er basert på det romlig og timelig globale sporings rammeverket beskrevet av Jaqaman et al.51.

Det er viktig å merke seg at følsomheten og nøyaktigheten av analysen er sterkt avhengig av flere analyse parametere. Som et eksempel ble tidsforløp filmene analysert som beskrevet i protokollen (figur 1C, video 1 "før", og video 2 "etter" analysen), og den resulterende vekst hastigheten og dynamicity (kollektiv forskyvning av gap-inneholdende spor over hele levetiden) er plottet i figur 1E, F, henholdsvis (svarte sirkler). Parameterne som beskrives for å påvirke analysen50, for eksempel "maksimal gap lengde" og "maksimal svinn faktor", ble endret for det samme settet med tidsforløp filmer (henholdsvis video 3 og 4). Tilsvarende verdier for vekst hastighet og dynamicity er gitt i figur 1E, F som henholdsvis røde firkanter og blå trekanter. Den resulterende veksten fart var ikke dypt berørt. Men verdiene innhentet for dynamicity var signifikant annerledes når "maksimal gap lengde" ble endret, mens det forble uendret ved å endre "maksimal krymping Factor". Som vist i figur 1d, i alle tre tilfeller var oppdagelsen av Mt-subtracks tilsvarende robust. Likevel, gjenoppbyggingen av den fulle MT baner ble stort sett påvirket når "maksimal gap lengde" ble satt til 15 (figur 1d, innfelt bilder). Videre, for å vurdere om bilde forholdene forstyrret av MT atferd, den første (1-61 rammer) og den andre (61-121 rammer) halvdelene av tidsforløp serien ble analysert separat og tilsvarende vekst hastighet og dynamicity verdier ble sammenlignet (figur 1G, H, henholdsvis). Som forventet ble det ikke oppdaget noen signifikante forskjeller mellom de to delene av tidsforløp serien. I videoer 1-8 tidsforløpbilder av en mitotisk celle synkronisert i profase og uttrykke EB3-tdTomato er gitt (Varighet = 1 min.; intervall = 0,5 s).

Figure 1
Figur 1: analyse av Mt dynamikk i jakten celler synkronisert i prometaphase. (A) en disposisjon av trinnene i protokollen. (B) den skjematisk representasjon av mekanismen av DME mediert dannelse av en monopolar mitotisk spindel. (C) en montasje av de første 10 rammene av tidsforløp filmen behandlet med U-Track programvare med hver andre ramme vist. Den oppdagede baner av MT veksten er merket med rødt. (D) tidsserien projeksjon av RAW image filen og etter Mt sporing ved hjelp av innstillingene som er beskrevet i protokollen ("optimal"), og når du endrer enten "maksimal gap lengde" eller "maksimal krymping Factor" er gitt. De setter inn hele MT baner, som består av veksten (rød), pause (lys blå), krymping (gul), fgap reklassifisert som vekst (grønn) og bgap reklassifisert som pause (mørkeblå) hendelser. Vekst hastigheten betyr (E) og Dynamicity (F) verdiene vises, og resultatene ved hjelp av en av de foreslåtte optimale kriterier (sorte sirkler), maksimal gap lengde satt til 15 (røde firkanter), eller maksimal krymping faktor satt til 1,0 (blå trekanter) er plottet (n = 45 celler; Mean ± SEM; enveis Anova analyse med Tukey post hoc test for flere sammenligning). Veksten hastighet betyr (G) og Dynamicity (H) verdiene vises for første (1-61 rammer) og andre (61-121 rammer) halvdeler av tidsforløp filmer (n = 45 celler; Mean ± SEM; sammenkoblet t-test med Welch korreksjon). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1: en representativ tidsforløp RAW-bilde av en prometaphase celle før analysen. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 2: påvisning og sporing av MTS i en celle i video 1 ved hjelp av de foreslåtte innstillingene for U-Track-programvare. Det samme tidsforløp bildet i video 1 behandlet med U-Track v 2.2.0 programvare ved hjelp av de beskrevne innstillingene, og de oppdagede vekst sporene er merket med rødt. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 3: deteksjon og sporing av MTS i en celle i video 1 ved hjelp av en nonoptimal verdi for "maksimal gap lengde". Det samme tidsforløp bildet i video 1 behandlet med U-Track v 2.2.0 programvare som bruker de samme innstillingene som før, men med "maksimal gap lengde" satt til 15. Resten av parametrene ble ikke endret. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 4: påvisning og sporing av MTS i en celle i video 1 ved hjelp av en nonoptimal verdi for "maksimal svinn faktor". Det samme tidsforløp bildet i video 1 behandlet med U-Track v 2.2.0 programvare som bruker de samme innstillingene som før, men med "maksimal svinn faktor" satt til 1. Resten av parametrene ble ikke endret. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 5: et eksempel på en tidsforløp serie av en celle med celle rusk. Etter analysen, ble noen celle rusk også oppdaget av programvaren under MT sporing. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 6: rådata som tilsvarer video 5. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 7: et eksempel på en tidsforløp serie av en celle med et høyt uttrykk for EB3-tdTomato som resulterer i dårlig definisjon av voksende tips. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 8: rådata som tilsvarer video 7. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: arbeidsflyten av analysen ved hjelp av U-Track programvare. (A) en skjematisk av trinnene ansatt av programvaren. (B) et skjermbilde av import av bio-formater som viser hvordan du importerer tidsforløp filer. (C) etter å ha lastet opp filene, er U-Track med Mt pluss-ender modulen valgt. (D) et skjermbilde av kontrollpanelet av U-spor der innstillingene for komet deteksjon, sporing og spor analyse er definert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: beskrivelse av det første trinnet i analysen, den komet deteksjon. (A) en disposisjon av de store hendelsene som utføres av algoritmen. (B, C) Skjermbilder fra programvaren er gitt med de optimale verdiene indikert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 3
Supplerende figur 3: beskrivelse av det andre trinnet i analysen, den komet sporing. (A) de viktigste trinnene som utføres av algoritmen er skissert. (B) et skjermbilde av "Tracking" panelet er gitt. Maksimal gap lukking tilsvarer den maksimale gap lengden og er satt til 5. Sporingen av tre substeps uthevet med røde, grønne og blå rektangler. (C,D,E) De numeriske verdiene som er nødvendige for hver deltrinn, angis her. Den maksimale svinnfaktoren er satt til 1,5 som angitt i (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 4
Supplerende figur 4: beskrivelse av siste trinn i analysen, spor analyse. (A) Mt Dynamics klassifisering og av de sammensatte sporene utføres i dette trinnet. (B, C) Skjermbilder av sporet analyse og tilsvarende innstillinger vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en modifikasjon av en metode som først ble etablert av Ertych et al.44. Sammen med flere andre modifikasjoner, kombinerer vi denne teknikken av MT dynamikk analyse med dual spinning disk konfokalmikroskopi Imaging. Bruken av dual spinning disken forbedrer oppløsningen av voksende MTs samtidig redusere Phototoksisitet36. Vi redusere photobleaching og laser lys-indusert skade av cellene ved å bytte til en lengre bølgelengde fluorescerende reporter. TdTomato fluorescerende protein har en høyere koeffisient av photostability og lysstyrke sammenlignet med en EGFP46. Endelig er målingen av MT dynamikk begrenset til bare ett Z-fly på grunn av begrensningene i oppfølgings analysen med U-Track. U-Track-programvaren er utformet for å detektere de fluorescensmerkete Mt-proppene i en XYZ-akse50,51. Derfor, ta en Z-stack time-lapse serien og skape maksimal projeksjon time-lapse serien er tilbøyelig til å generere falske resultater. Signaler oppdaget i forskjellige Z-fly og ikke tilhører den samme voksende MT er samlet i maksimal projeksjon, og dermed skape en falsk bane av MT vekst.

Synkroniserings protokollen som brukes her, medfører en høy tetthet av MTs ved å begrense mitotisk spindel til en monopolar struktur. Mitotisk MTS er svært dynamiske strukturer med faser av vekst og krymping, med en pause på overgangen mellom dem19,54,55. På grunn av den høye tettheten av den voksende MTs, er påvisning av pause hendelser etterfulgt av enten krymping eller vekst utsatt for falske resultater hvis sporings parametrene er innstilt feil. U-Track programvare sporing moduler oppdage såkalte subtracks (episoder av kontinuerlig vekst) og deretter klassifiserer dem som sammensatte spor med pause hendelser kalt "hull". Applegate et al. Diskuter to parametre avgjørende for sporing og subtrack linking50. Disse er "maksimal gap lengde" og "maksimal svinn faktor". Hvis subtrack blir fulgt dukker opp igjen i den økende retningen av MT i den påfølgende tid-trinn, så er det klassifisert som en frem gap. På den annen side, hvis subtrack dukker opp på motsatt side av veksten retning, vil det bli klassifisert som et tilbakegang gap. Maksimal gap lengde definerer antall del bilder som skal søkes etter hullene fremover og bakover. Som nevnt, den høye tettheten og av natur høy dynamicity av mitotisk MTs setter begrensningen, og mindre verdier bør defineres. Som vist i figur 1e er dynamicity påvirket mest. Dynamicity beregnes som kollektiv forskyvning av alle gap-inneholdende spor over deres globale lifespans. Den andre parameteren, maksimal svinn faktor, har liten eller ingen effekt på enten dynamicity eller vekst hastighet (figur 1D, E).

Generelt, når man studerer MT vekst egenskaper, bør nøye oppmerksomhet rettes mot tenkelig forhold. For det første er MTS svært følsomme for temperatur-og depolymerize når de utsettes for middels56,57,58,59. Derfor, for å unngå innsamling av falske resultater, bør temperaturen være strengt kontrollert gjennom hele eksperimentet. For det andre, den joniske sammensetningen av mediet som brukes under eksperimentene kan påvirke Mt vekst58,60. For eksempel påvirker eksponering for kalsium ioner Mt Dynamics på forskjellige måter61,62. Derfor bør sammensetningen av vekstmedium som brukes i alle eksperimenter være den samme. Tilsvarende bør parametrene av analysen defineres en gang og vedlikeholdes konstant for alle repetisjoner. I tillegg tidsforløp filmer som genereres etter analysen skal inspiseres visuelt, og enhver film med bakgrunnsstøy som gir opphav til falske positiver (videoer 5 og 6) eller med høy uttrykk for tdTomato resulterer i dårlig oppløsning av MT voksende tips (videoer 7 og 8) bør utelukkes fra videre statistisk analyse.

Nylig, kombinasjonen av gitteret lys-ark mikroskopi av en mitotisk aksling ved subsecond intervaller, sammen med sofistikert bildebehandling gjør at analysen av Mt forsamlingen priser i tre dimensjoner63,64. Dette har åpenbare fordeler fremfor CLSM, men ytterligere forbedringer vil være nødvendig før metoden blir av generell bruk, slik som utvidelse av strategier som brukes i U-spor til den tredje dimensjonen26,50,63.

Protokollen av MT dynamikk deteksjon vi beskriver her kan være en metode for valg for narkotika screening. Metoden er robust, og den fjerner den menneskelige bias i forhold til analysen som utføres manuelt. Automatisering av filmen prosessering gjør at analyse av tusenvis av MT spor innenfor hver celle, og dermed øke den statistiske kraften i analysen. Videre kan metoden endres ved å endre for eksempel synkroniserings protokollen og få celler fra forskjellige faser av cellesyklusen. Dette kan for eksempel være et nyttig verktøy for screening MT målretting kjemoterapeutiske narkotika når effekten på Interphase og dele celler skal skilles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmene av Light mikroskopi Facility, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, for deres faglige råd og støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100xC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Elektrisches teleskop. Germany patent. Nipkow, P. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. Tanaami, T., Kenta, M. , EP92114750A (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Tags

Biologi mikrotubulinettverket dynamikk mikrotubulinettverket vekst pluss-end mikrotubulinettverket sporing prometaphase Live-celle Imaging spinning disk konfokalmikroskopi mikroskopi
Måling av Mikrotubulinettverket Dynamics ved spinning disk mikroskopi i Monopolar mitotisk aksling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Movsisyan, N., Pardo, L. A.… More

Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter