Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mätning av mikrotubuli dynamik genom spinning disk mikroskopi i monopolär mitotiska spindlar

Published: November 15, 2019 doi: 10.3791/60478
Automatic Translation
1,2, 1
1AG Oncophysiology, Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

Här presenterar vi en robust och detaljerad metod för mikrotubuli Dynamics analys i celler synkroniserade i av med Live-cell spinning disk konfokalmikroskopi och MATLAB-baserad bildbehandling.

Abstract

Vi beskriver en modifiering av en etablerad metod för att bestämma mikrotubuldynamik i levande celler. Protokollet är baserat på uttrycket av en genetiskt kodad markör för de positiva ändarna av mikrotubuli (EB3 märkt med tdTomato fluorescerande protein) och hög hastighet, högupplöst, Live-cell Imaging med spinning disk konfokal mikroskopi. Cell cykel synkronisering och ökad densitet av mikrotubuli uppnås genom att hämma centrosomal separation i mitotiska celler, och analys av tillväxt utförs med hjälp av öppen källkod U-Track programvara. Användningen av en ljus och rödskiftad fluorescerande protein, i kombination med den lägre lasereffekt och minskad exponeringstid som krävs för spinning disk mikroskopi minska fototoxicitet och sannolikheten för ljus-inducerad artefakter. Detta gör det möjligt att avbilda ett större antal celler i samma beredning samtidigt som cellerna bibehålls i ett odlingsmedium under standard odlingsförhållanden. Eftersom analysen utförs i en övervakad automatisk mode, resultaten är statistiskt robust och reproducerbara.

Introduction

Mikrotubuli (MTs) är mycket dynamiska strukturer som finns i nästan alla eukaryotiska celler och i vissa bakterier1. Tillsammans med aktin och mellanliggande glödtrådar skulpterar de cytoskelettet2,3. Cell Division4, molekyl transport5, flagellar slog6, känslan av den omgivande miljön genom primära cilium7, hörsel (kinocilium)8,9, embryogenes10,11,12, invasion och metastaser13,14, och även minnesbildning15,16,17,18, och många andra processer förlitar sig i första hand på MTs. medverkan av MTs i alla dessa händelser skulle vara omöjligt utan deras anmärkningsvärda förmåga att snabbt växla mellan tillväxt (polymerisation) och krympning (depolymerization). Den här egenskapen beskrivs som dynamisk instabilitet19. MT dynamicity ändras i många sjukdomstillstånd20,21,22. Därför, att fastställa arten av denna fastighet kan bidra till att förstå sjukdomsmekanismer och därefter deras behandling.

En lång lista med metoder har utvecklats för MT Dynamics analys, varav de flesta är baserade på Imaging tekniker23. Inledningsvis, brett fält ljusmikroskop användes för att observera bildandet av tubulin polymerer in vitro-24. Upptäckten av slutbindande (EB)-proteiner som samlar på Mt plus-Ends och utvecklingen av metoder för att Fluorescent etikett proteiner gjorde det möjligt att observera beteendet hos MTS direkt i levande celler med brett fält och konfokala fluorescens Mikroskop25,26,27. En EB-protein är avsluta-bindande protein 3 (EB3)28; genom att överuttrycka och spåra EB3 smält till ett fluorescerande protein, MT plus-end monteringssatser kan bestämmas29,30.

Confocal laserscanning fluorescens mikroskopi (clsm) används ofta för att följa MT dynamik. Denna bildteknik innebär dock en hög risk för fototoxicitet och foto blekning, två oönskade processer för levande cell och dim prov avbildning31. För att få en bättre signal-brus-förhållande, lasereffekt och exponeringstid bör vara tillräckligt hög medan inte skadar proverna, och detta kräver att offra upplösning i utbyte mot hastighet. Ett passande alternativ till clsm är spinning disk mikroskopi32. Denna avbildning modalitet bygger på användningen av en Nipkow disk33, som består av en rörlig disk som bär en array av hål, och fungerar ekvivalenta till många CLS Mikroskop Imaging samma prov samtidigt34. Därför ljus från lasern kommer att belysa flera regioner i provet samtidigt men behåller konfokala natur. Den Nipkow disk, därför, gör det möjligt att få bilder som liknar CLSM men snabbare och med mindre lasereffekt. Den Nipkow disk förbättrades ytterligare av Yokogawa Electric, som introducerade en andra skiva med en rad mikrolinser på den som individuellt direkt ljus i ett respektive hål, ytterligare minska fototoxicitet och photoblekning35. Sålunda, spinning disk laserskanning mikroskopi blev en metod för val för levande cell avbildning, och det gör det möjligt att få bilder med hög signal-brus-förhållande vid en hög hastighet31,36, vilket är avgörande för att lösa signaler som de från den snabbt växande MT ändar.

MT Dynamics skiljer sig tillfälligt. Till exempel är den mitotiska MTS mer dynamisk än Interphase Ones37,38. Likaså har skillnader i tillväxttakt och krympning observerats även inom samma cell cykel fas, såsom Mitos39,40. För att undvika falsk datainsamling bör mätningen av MT-dynamiken därför begränsas till ett smalt tidsintervall under cellcykeln. Till exempel, mätning av Mt dynamik i av kan uppnås genom att behandla cellerna med dimethylenastron (DME), en monastrol analog som hämmar motorn kinesinet Eg541 och förhindrar bildandet av bipolär mitotisk spindel42. Hämning av celler vid av med Eg5 hämmare DME och andra monastrol derivat påverkar inte MT Dynamics43,44,45, vilket gör DME ett användbart verktyg för att studera MT dynamik både i fasta och levande celler44.

Här kombinerar vi metoden för MT Dynamics analys i av celler som beskrivs av ertych et al.44 med Dual spinning diskavbildning. Denna metod möjliggör mätning av Mt-dynamiken i av-celler som samlats in från ett enda fokalplan med en högre bildfrekvens, men utan foto blekning och minimal fototoxicitet. Dessutom, som en fluorescerande reporter, använder vi tandem dimer tomat fluorescerande protein (tdTomato) som har förbättrat ljusstyrka och foto stabilitet i jämförelse med den gröna fluorescerande protein (EGFP) och är upphetsad med lägre energi ljus46. Därför kräver tdTomato mindre lasereffekt för excitation och är mindre fototoxisk. Sammantaget förbättrar vi ytterligare metoden genom att minska fototoxicitet och förbättra den upplösning och postprocessing som krävs för MT Dynamics analys. Dessutom skapar vi en grund för framtida ändringar av metoden genom att kombinera den med andra synkroniseringstekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sådd av HeLa celler

  1. Bered 2 ml av 5 μg/ml Fibronektin-lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och tillsätt 450 μl av det i varje brunn i en 4 väl kamrar täckslip (#1.5). Inkubera bilden i 15 min vid 37 ° c och 5% CO2.
  2. Spola asynkront växande HeLa celler med Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) och inkubera med trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) i 5 min vid 37 ° c. Stoppa den enzymatiska reaktionen genom tillsats av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium kompletterat med 10% Värmeinaktiverade fetalt kalv serum (FCS) vid 3:1 (v:v) förhållande av tillsatt trypsin-EDTA.
    Anmärkning: HeLa cells bibehölls i RPMI 1640 medium kompletterat med 10% Värmeinaktiverade FCS vid 37 ° c och 5% Co2 och var rutinmässigt blint när de nådde 80-90% confluency som beskrivs ovan.
  3. Bestäm cellkoncentrationen med en Neubauer-kammare. Blanda en 50 μL alikvot av cellsuspensionen med trypan Blue vid 1:1 (v:v) förhållande, Omsuspendera och överför 10 μL av suspensionen till kammaren. Räkna endast trypans blå-negativa celler inuti de fyra stora torgen (för detaljer se Phelan et al.47). Härleda cellkoncentrationen från det räknade cellnumret med hjälp av följande formel:
    Equation 1
  4. Pelleten cellerna genom centrifugering vid 300 x g för 2 min. Omsuspendera med färska rpmi 1640 för att få 1 x 106 celler/ml.
  5. Ta bort Fibronektin från den kamrar täckslip, Tvätta brunnarna två gånger med dpbs, och utsäde 50 000 celler per brunn.
  6. Returnera den kamrar täckslip med cellerna till inkubatorn och odla dem för 24 h vid 37 ° c och 5% Co2.

2. uttryck för pEB3-tdTomato i HeLa Cells

  1. Förbered en 1,5 mL microcentrifug tub. Späd ut 2 μg pEB3-tdTomato48 med transfektionbuffert (syntetisk produkt i vattenlösning) till en slutlig volym på 396 μl för varje tub.
  2. Tillsätt 4 μL transfektionsreagens (icke-lipidic, innehållande Polyethylenimine) till det första röret, och Vortexblanda blandningen omedelbart för exakt 10 s.
  3. Snurra snabbt ner röret med en mikrocentrifug och inkubera i rumstemperatur (RT) i 10 minuter.
  4. Ta bort hela cellerna från inkubatorn. Dropwise, tillsätt 100 μl av transfektion blandningen till varje brunn av en 4 väl kamrar täckslip, och returnera cellerna till inkubatorn.
  5. Efter 4 h inkubering vid 37 ° c och 5% CO2, komplettera cellerna med färskt odlingsmedium och inkubera i minst 24 h vid 37 ° c och 5% Co2.
    Anmärkning: Det är nödvändigt att optimera transfektion villkor för varje celltyp. Uttrycks nivåer måste vara tillräckligt låg för att möjliggöra identifiering av enda MT växande ändar. Alternativt kan en cell linje som stabilt uttrycker EB3-tdTomato användas i experimenten; Detta skulle minska variationen i uttrycks nivåer av EB3-tdTomato mellan preparat och mellan celler från samma beredning49.

3. synkronisering och Live-cell Imaging av pEB3-tdTomato-uttrycker HeLa celler

  1. Förbered en 2,5 μM lösning av dimethylenastron (DME) i fenol-röd fri Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) kompletteras med 10% FCS och 2 mM L-glutamin eller en alternativ glutamin leverans.
  2. Ersätt odlingsmediet i den kamrade täckslip med 500 μL av odlingsmediet som innehåller 2,5 μM DME och inkubera cellerna vid 37 ° c och 5% CO2.
  3. Efter 3,5 h av inkubering med DME, överför cellerna till mikroskopet, montera den kamrade täckglas i en miljökammare med mörka paneler för avbildning vid 37 ° c och 5% CO2, och ytterligare Inkubera tills den totala inkubationstiden är 4 h.
    Anmärkning: Upprätthållandet av temperaturen vid 37 ° c utan fluktuation är avgörande för experimentet.
  4. Utför tid-lapse Imaging på ett inverterat Mikroskop utrustad med en 100x 1,49 N.A. olja nedsänkning mål, en dual spinning disk konfokalsystem, och ett tillförlitligt autofokussystem för kontinuerlig underhåll av fokalplanet. Definiera avbildnings parametrarna enligt följande.
    Anmärkning: Vi använder en elektron multiplicera laddning-kopplad enhet kamera (EM-CCD).
    1. För EB3-tdTomato excitation, Använd en 561 nm laserlinje med 200 MS exponeringstid. Samla in det avgivna ljuset genom ett fyrdubbla bandpass (405, 488, 561, 640 Nm) Dichroic Mirror och ett 600/52 nm emissions filter.
      Anmärkning: Laser effekt kan justeras för varje avbildad cell för att förhindra bildmättnad. I alla Time-lapse filmer som ges här lasereffekten var inställd på 5,3 mW.
    2. Hitta en cell i profas och fokusera på Z-planet som motsvarar mitten av den monopolär mitotiska spindeln. Förvärva bilder var 0,5 s över totalt 1 min utan Binning och ingen belysning mellan exponeringarna.

4. analys av MT Dynamics med U-Track v 2.2.0

  1. För att kunna analysera MT-dynamiken krävs en numerisk datormiljö programvara (t. ex. MATLAB).
    Anmärkning: Grundläggande förståelse för programvaran är tillräcklig för analysen. Omfattande hjälpmaterial och självstudier finns på utvecklarens webbplats (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
  2. Data överför (https://github.com/DanuserLab/u-Track) och installera den öppen-källa fullständig-spår v 2.2.0 mjukvaran följande den specificerat instruktionerna givit i "Readme_u-spår. pdf" arkivera50,51,52.
  3. Sjösätta den numerisk-analys mjukvaran och tillägga fullständig-spår v 2.2.0 broschyren med undermappar in i mjukvaran söka stig.
  4. Från kommandofönstret kallar "Movieselectorgui". Då öppnas ett dialogfönster från vilket de RAW-filer som genereras av bild insamlingsprogrammet i mikroskopet kan importeras (kompletterande figur 1, figur 2, figur 3, figur 4).
    Anmärkning: U-Track-programvaran är kompatibel med andra bilddataformat. Det använder bio-formaterar, som känner igen olikt Life Science data formaterar53.
  5. Storleken på varje bild läses från metadata automatiskt. Ange manuellt den numeriska bländaren för målet (i det här fallet 1,49) och det tidsintervall (0,5 s) som används för avbildning (tilläggs figur 1b). Dessutom, information om excitation våglängd, fluorophore, och exponeringstiden kan också tillhandahållas, men de är inte kritiska för vidare analys.
  6. När alla bilder är laddade sparar du den inmatade tids fördröjnings serien som en filmlista genom att välja "Spara som filmlista". På höger sida av dialogfönstret väljer du alternativet "U-Track" och trycker på "Fortsätt" (tilläggs siffra 1c).
    Anmärkning: Värdena är optimerade för HeLa celler. Om du byter till en annan cellrad bör värdena definieras igen. Alternativt kan du använda de inställningar som rekommenderas av programutvecklarna. Den detaljerade förklaringen av var och en av parametrarna och hur de bör definieras kan hittas i den tekniska rapporten försedd med den tidigare versionen av programvaran, plusTipTracker50.
  7. I popup-fönstret väljer du "Microtubule plus-Ends" och trycker på "OK" (tilläggs siffra 1c). I det nya dialogfönstret kan du bestämma parametrarna för de tre stegen i analysen (tilläggs siffra 1d), som är detektering, spårning och spåranalys.
  8. I steg 1 väljer du "Inställningar" och från en rullgardinsmeny väljer du "Kometdetektering" som detektionsmetod (kompletterande figur 2b).
    1. Från den nya dialogen fönstret Definiera parametrarna för skillnaden mellan Gaussians filter och vattendelare segmenteringen enligt följande (kompletterande figur 2C): mask process som skall användas för detektion = ingen; Low-pass Gaussian standardavvikelse = 1 pixel; High-pass Gaussian standardavvikelse = 3 pixlar; Minimitröskel = 3 standardavvikelser; Tröskel steg storlek = 0,25 standardavvikelser. Välj "tillämpa inställningar på alla filmer" och "Apply".
  9. I steg 2 definieras parametrarna för länkning, Gap stängning, sammanslagning och delning och Kalman-filterfunktioner i tre steg, vilket markeras i rosa, grönt och blått, följaktligen (tilläggs figur 3b). För dessa steg, välj "Microtubule plus-end Dynamics" och från "Setting" alternativet definierar värdena som anges i kompletterande figur 3c-E, respektive.
    1. För problem med dimensionalitet, välj "2" i rullgardinsmenyn. Använd maximal mellanrum för att stänga = 5 bildrutor; Minsta längd på spår segmenten från första steget = 3 bildrutor. Som tidigare, välj "tillämpa inställningar för alla filmer" och klicka på "Apply".
  10. I steg 3 i analysen klassificeras de upptäckta MT-spåren (kompletterande figur 4). Som en spåranalys metod, välj "Microtubule Dynamics Classification" och definiera parametrarna genom "inställning"-knappen som anges i kompletterande figur 4b, C. Efter det, välj "tillämpa inställningar för alla filmer" rutan och klicka på "Apply".
  11. När alla parametrar är definierade, från "Kontrollpanelen-U-Track" fönster (kompletterande figur 1d) Välj "Apply kontrollera/avmarkera alla filmer" och "Kör alla filmer" lådor och tryck på "Run". Detta kommer att initiera MT analys av Time-lapse serien.
  12. När film bearbetningen är slutförd visas ett meddelande om att "din film (er) har bearbetats korrekt". Tryck på "OK" och sedan "Save".
  13. Nu är det säkert att avsluta den numeriska analysprogram varan. Resultaten från film bearbetningen lagras i undermappsstrukturer som m-filer i mappen där Raw-filerna lagras.

5. statistisk analys av MT-dynamiken

  1. Importera m-filerna till ett önskat statistik analysprogram.
    Anmärkning: I vårt fall importerar vi först filerna i ett standardkalkylblad för att göra dem läsbara. M-filerna innehåller statistisk information (median, medelvärde och standardavvikelse) på olika parametrar (t. ex. tillväxthastighet, MT dynamicity). Den detaljerade listan över parametrarna anges i den tekniska rapporten som medföljer den tidigare versionen av programvaran, plustiptracker50,52. De genererade m-filerna kan också importeras till andra databehandlingsprogram.
  2. Välj parametern "tillväxthastighet medelvärde" och importera den till en tabell för statistik och visning. Ange information om andra parametrar (t. ex. "dynamicity") antingen i en ny tabell eller i en ny kolumn i samma grupperade tabell och tomt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter det givna protokollet som beskrivs i figur 1a, uttrycktes PEB3-tdTomato plasmid transitivt i asynkront växande hela celler. Cellerna synkroniserades 48 h efter transfektion vid av genom DME-behandling (figur 1b). Detta steg säkerställde att mätningen av MT-dynamiken alltid gjordes i samma fas av cellcykeln. De Time-lapse filmer behandlades ytterligare och analyseras med U-Track v 2.2.0 som beskrivs i dess kompletterande dokumentation50,51,52. Även om plus-end bindande proteiner spåra endast MT tillväxtfaser, U-Track v 2.2.0 extrapolerar information om paus och krympning händelser genom att länka sekventiella tillväxtfaser och rekonstruera hela banor26,50. Algoritmen är baserad på det rumsligt och temporally globala spårnings ramverket som beskrivs av Jaqaman et al.51.

Det är viktigt att notera att känsligheten och noggrannheten i analysen är starkt beroende av flera analysparametrar. Som ett exempel analyserades tids fördröjnings filmerna enligt beskrivningen i protokollet (figur 1c, video 1 "före" och video 2 "efter" analysen), och den resulterande tillväxthastigheten och dynamicitet (kollektiv förskjutning av gap-innehållande spår under hela deras livstid) ritas i figur 1E, Frespektive (svarta cirklar). Sedan de parametrar som beskrivs för att kraftigt påverka analysen50, såsom "maximal gap längd" och "maximal krympfaktor" ändrades för samma uppsättning av Time-lapse filmer (video 3 och 4, respektive). Motsvarande värden för tillväxthastighet och dynamicitet anges i figur 1E, F som röda fyrkanter respektive blå trianglar. Den resulterande tillväxthastigheten påverkades inte djupt. De värden som erhölls för dynamicitet var dock signifikant annorlunda när "maximal gap längd" ändrades, medan den förblev oförändrad vid ändring av "maximal Krympfaktor". Som framgår av figur 1dvar DETEKTERINGEN av Mt-subspåren i alla tre fall på samma sätt robust. Men återuppbyggnaden av hela MT banor påverkades mest när "maximal gap längd" var inställd på 15 (figur 1d, infälld bilder). För att kunna bedöma om de avbildnings förhållanden som interfererade med MT-beteendet, de första (1 – 61 bildrutor) och den andra (61 – 121 bildrutor) halvor av tidsförlopp serien analyserades separat och motsvarande tillväxthastighet och dynamicity värden jämfördes (figur 1G, H, respektive). Som väntat upptäcktes inga signifikanta skillnader mellan de två delarna av tids fördröjnings serien. I videor 1-8 tidsfördröjning bilder av en mitotisk cell synkroniseras i profas och uttrycker EB3-tdtomato ges (varaktighet = 1 min; intervall = 0,5 s).

Figure 1
Figur 1: analys av Mt-dynamiken i hela celler synkroniserade i av. A) en översikt över protokollets steg. Bden schematiska representationen av mekanismen för DME-medierad bildning av en monopolär mitotisk spindel. (C) ett montage av de första 10 bildrutorna i Time-lapse filmen bearbetas med U-Track programvara med varannan bildruta visas. De upptäckta trajectorisen av MT-tillväxten markeras med rött. D) tidsserie projektionen av RAW-avbildningsfilen och efter MT-spårning med hjälp av de inställningar som beskrivs i protokollet ("optimalt"), och vid ändring av antingen "maximal gap längd" eller "maximal krympfaktor" ges. Inseten representerar den fullständiga MT Trajectories, som består av tillväxt (röd), paus (ljusblå), krympning (gul), fgap omklassificerat som tillväxt (grön) och bgap omklassificerat som PAUSE (mörkblå) händelser. Tillväxthastigheten innebär att (E) och dynamicity (F)-värdena visas, och resultaten med någon av de föreslagna optimala kriterierna (svarta cirklar), maximal gap längd inställd på 15 (röda fyrkanter), eller den maximala krympnings faktorn som är inställd på 1,0 (blå trianglar) ritas (n = 45 celler; medelvärde ± SEM; enkelriktad ANOVA-analys med Tukey post hoc-test för multipeljämförelse). Tillväxthastigheten (G) och dynamicity (H)-värdena visas för de första (1 – 61 bildrutorna) och andra (61 – 121 bildrutor) halvor av tids fördröjnings filmerna (n = 45-celler; medelvärde ± SEM; ej ihopparad t-test med Welchs korrektion). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1: en representativ tidsfördröjning RAW-bild av en av-cell före analysen. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Video 2: detektering och spårning av MTS i en cell i video 1 med de föreslagna inställningarna för U-Track programvara. Samma tid-lapse bild i video 1 bearbetas med U-Track v 2.2.0 programvara med hjälp av de beskrivna inställningarna, och de identifierade tillväxt spåren är markerade i rött. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Video 3: detektering och spårning av MTS i en cell i video 1 med ett icke-optimalt värde för "maximal gap längd". Den samma tid-förlopp bild i video 1 bearbetat med fullständig-spår v 2.2.0 mjukvaran användande den samma infattningarna så framför, utom med det "maximum gap längd" sätta till 15. Resten av parametrarna ändrades inte. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Video 4: detektering och spårning av MTS i en cell i video 1 med ett icke-optimalt värde för "maximal krympfaktor". Samma tid-lapse bild i video 1 bearbetas med U-Track v 2.2.0 programvara med samma inställningar som tidigare, men med den "maximala Krympnings faktorn" satt till 1. Resten av parametrarna ändrades inte. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Video 5: ett exempel på en tids fördröjnings serie i en cell med cellfragment. Efter analysen upptäcktes även vissa cellfragment av programvaran under MT tracking. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Video 6: RAW-data som motsvarar video 5. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Video 7: ett exempel på en tidsfördröjning serie av en cell med ett högt uttryck för EB3-tdTomato resulterar i dålig definition av växande tips. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Video 8: rådata som motsvarar video 7. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Supplementary Figure 1
Kompletterande figur 1: arbetsflödet för analysen med U-Track programvara. (A) en schematisk av de steg som används av programvaran. (B) en skärmdump av bio-format importör som visar hur du importerar filer tidsfördröjd. (C) när du har laddat upp filerna väljs U-Track med modulen MT plus-Ends. (D) en skärmdump av Kontrollpanelen för U-Track där inställningarna för kometdetektering, spårning och spåranalys definieras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 2
Kompletterande figur 2: Beskrivning av det första steget i analysen, kometen upptäckt. (A) en översikt över de viktigaste händelserna som utförs av algoritmen. (B, C) Skärmdumpar från programvaran ges med de optimala värden som anges. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 3
Kompletterande figur 3: Beskrivning av det andra steget i analysen, kometen spårning. (A) de viktigaste stegen som algoritmen utför beskrivs. (B) en skärmdump av "tracking"-panelen ges. Den maximala gapet nära motsvarar den maximala gap längd och är inställd på 5. Spårning av tre under steg markerade med röda, gröna och blå rektanglar. (C,D,E) De numeriska värden som krävs för varje delsteg anges här. Den maximala Krympfaktorn är inställd på 1,5 enligt vad som anges i (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 4
Kompletterande figur 4: Beskrivning av det sista steget i analysen, spåranalys. (A) MT Dynamics klassificering och omklassificering av sammansatta spår utförs under detta steg. (B, C) Skärmdumpar av spår analysen och motsvarande inställningar visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi en modifiering av en metod som först upprättades av Ertych et al.44. Tillsammans med flera andra modifieringar kombinerar vi denna teknik av MT Dynamics analys med Dual spinning disk konfokal Imaging. Användningen av Dual spinning disk förbättrar upplösningen av växande MTs samtidigt minska fototoxicitet36. Vi minskar ytterligare photoblekning och laserljus-inducerad skada av cellerna genom att byta till en längre våglängd fluorescerande reporter. Den tdTomato fluorescerande protein har en högre koefficient av foto stabilitet och ljusstyrka i jämförelse med en EGFP46. Slutligen är mätningen av MT-dynamik begränsad till endast ett Z-plan på grund av begränsningarna i uppföljningsanalysen med U-Track. U-Track programvara är utformad för att upptäcka fluorescerande-märkta MT tips i en XYZ-axel50,51. Därför, med en Z-stack Time-lapse serien och skapa maximal projektion Time-lapse serien är benägna att generera falska resultat. Signaler som upptäcks i olika Z-plan och inte tillhör samma växande MT förs samman i maximal projektion, vilket skapar en falsk bana av MT tillväxt.

Det synkroniseringsprotokoll som används här inducerar en hög densitet av MTs genom att begränsa den mitotiska spindeln till en monopolär struktur. Den mitotiska MTS är mycket dynamiska strukturer med faser av tillväxt och krympning, med en paus vid övergången mellan dem19,54,55. På grund av den höga densiteten hos den växande MTs, detektering av pausa händelser följt av antingen krympning eller tillväxt är benägna att falskt resultat om spårnings parametrarna är felaktigt inställda. U-Track programvara spårningsmoduler upptäcka så kallade subtracks (episoder av kontinuerlig tillväxt) och sedan klassificerar dem som sammansatta spår med pausa händelser kallas "luckor". Applegate et al. diskutera två parametrar kritisk för spårning och subtrack länkning50. Dessa är "maximal gap längd" och "maximal Krympfaktor". Om del spåret som följs återkommer i den växande riktningen av MT i efterföljande tid-steg, då det klassificeras som en framåt gap. Å andra sidan, om subtrack visas i motsats till tillväxt riktningen, kommer det att klassificeras som en bakåt gap. Den maximala mellanrum längden definierar antalet ramar som ska sökas efter framåt och bakåt luckor. Som nämnts, hög densitet och av naturen hög dynamicity av den mitotiska MTs sätter begränsningen, och mindre värden bör definieras. Som framgår av figur 1e påverkas dynamicity mest. Dynamicity beräknas som kollektiv förskjutning av alla gap-innehållande spår över deras globala livslängder. Den andra parametern, den maximala Krympfaktorn, har liten eller ingen effekt på vare sig dynamicitet eller tillväxthastighet (figur 1D, E).

I allmänhet, när man studerar MT tillväxt egenskaper, noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt avbildnings förhållanden. Först MTS är mycket känsliga för temperatur och depolymerize när de utsätts för kall tillväxtmedium56,57,58,59. Därför, för att undvika insamling av falska resultat, bör temperaturen kontrolleras strikt under hela experimentet. För det andra kan den joniska sammansättningen av mediet som används under experimenten påverka MT tillväxt58,60. Till exempel påverkar exponering för kalciumjoner MT dynamiken på olika sätt61,62. Därför bör sammansättningen av odlingsmediet som används i alla experiment vara densamma. På samma sätt bör parametrarna för analysen definieras en gång och underhållas konstant för alla repetitioner. Dessutom bör tidsfördröjning filmer som genereras efter analysen inspekteras visuellt, och alla filmer med bakgrundsljud ger upphov till falska positiva (videor 5 och 6) eller med högt uttryck för tdTomato resulterar i dålig upplösning av MT växande tips (video 7 och 8) bör uteslutas från ytterligare statistisk analys.

Nyligen, kombinationen av gitter ljus-Sheet mikroskopi av en mitotisk spindlar i subsekundintervaller, tillsammans med sofistikerad bildbehandling möjliggör analys av Mt monteringssatser i tre dimensioner63,64. Detta har uppenbara fördelar jämfört med clsm, men ytterligare förbättringar kommer att krävas innan metoden blir av allmänt bruk, såsom utbyggnaden av strategier som används i U-Track till den tredje dimensionen26,50,63.

Protokollet för MT Dynamics upptäckt vi beskriver här kan vara en metod för val för Drug screening. Metoden är robust och tar bort mänsklig bias jämfört med den analys som utförs manuellt. Automatiseringen av filmen bearbetning möjliggör analys av tusentals MT spår inom varje cell, vilket ökar den statistiska kraften i analysen. Dessutom kan metoden ändras genom att till exempel ändra synkroniseringsprotokollet och erhålla celler från olika faser i cellcykeln. Detta kan till exempel vara ett användbart verktyg för att screening MT inriktning kemoterapeutiska läkemedel när effekten på Interphase och dividera celler bör särskiljas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmarna i den ljusmikroskopi anläggningen, Max-Planck Institute of experimental Medicine, för deras expertråd och stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100xC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Elektrisches teleskop. Germany patent. Nipkow, P. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. Tanaami, T., Kenta, M. , EP92114750A (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Tags

Biologi mikrotubuli dynamik mikrotubuli tillväxt plus-end mikrotubuli spårning prometaphase Live-cell Imaging spinning disk konfokalmikroskopi
Mätning av mikrotubuli dynamik genom spinning disk mikroskopi i monopolär mitotiska spindlar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Movsisyan, N., Pardo, L. A.… More

Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter