Summary

Optagelse af hjerteskaderespons af målrettede cellepopulationer via clearet hjerte tredimensionel billeddannelse

Published: March 17, 2020
doi:

Summary

Cardiomyocyt spredning efter skade er en dynamisk proces, der kræver en symfoni af ekstracellulære signaler fra ikke-myocyte cellepopulationer. Ved hjælp af afstamning sporing, passiv KLARHED, og tre-dimensionelle hel-mount konfokal mikroskopi teknikker, kan vi analysere indflydelsen af en række forskellige celletyper på hjerte reparation og regenerering.

Abstract

Hjerte-kar-sygdom overgår alle andre dødsårsager og er ansvarlig for en svimlende 31% af dødeligheden på verdensplan. Denne sygdom manifesterer sig i hjerteskade, primært i form af en akut myokardieinfarkt. Med lidt modstandskraft efter skade, den gang sundt hjertevæv vil blive erstattet af fibrøst, ikke-kontraktile arvæv og ofte være en optakt til hjertesvigt. For at identificere nye behandlingsmuligheder inden for regenerativ medicin har forskningen fokuseret på hvirveldyr med medfødte regenerative evner. En sådan model organisme er neonatal mus, som reagerer på hjerteskade med robust myokardieregenerering. For at fremkalde en skade i neonatal mus, der er klinisk relevant, har vi udviklet en operation for at okkludere den venstre anterior faldende arterie (LAD), spejling en myokardieinfarkt udløst af åreforkalkning i det menneskelige hjerte. Når matchet med teknologien til at spore ændringer både inden for kardiomyocytter og ikke-myocyte populationer, denne model giver os en platform til at identificere de mekanismer, der styrer hjerte regenerering. Få indsigt i ændringer i hjertecellepopulationer efter skade engang stolede stærkt på metoder såsom væv ssektioning og histologisk undersøgelse, som er begrænset til to-dimensionel analyse og ofte skader væv i processen. Desuden mangler disse metoder evnen til at spore ændringer i celleslægter, i stedet giver blot et øjebliksbillede af skadesreaktionen. Her beskriver vi, hvordan teknologisk avancerede metoder i afstamning sracing modeller, hele orgel clearing, og tre-dimensionelle (3D) hele mount mikroskopi kan bruges til at belyse mekanismer af hjertereparation. Med vores protokol for neonatal mus myokardieinfarkt kirurgi, væv clearing, og 3D hele organ imaging, de komplekse veje, der inducerer kardiomyocyt spredning kan optrævles, afslører nye terapeutiske mål for hjerte-regenerering.

Introduction

Hjertet har længe været anset for at være et post-mitotisk organ, men de seneste beviser viser, at kardiomyocyt fornyelse forekommer i det voksne menneskelige hjerte på omkring 1% om året1. Men, disse lave satser for kardiomyocyte omsætning er utilstrækkelige til at genopbygge den massive tab af væv, der opstår efter skade. Et hjerte, der har lidt en myokardieinfarkt vil miste omkring en milliard kardiomyocytter, ofte tjener som en optakt til hjertesvigt og pludselig hjertedød2,3. Med over 26 millioner mennesker ramt af hjertesvigt på verdensplan, er der et udækket behov for terapi, der kan vende de skader, som hjertesygdomme4.

For at bygge bro over denne kløft i terapeutisk, forskere er begyndt at undersøge evolutionært bevarede mekanismer, der ligger til grund endogen regenerering efter skade. En model til at studere pattedyr hjerteregenerering er neonatal mus. Inden for ugen efter fødslen har nyfødte mus et robust regenerativt respons efter hjerteskader5. Vi har tidligere vist, at neonatal mus kan regenerere deres hjerte via kardiomyocyt spredning efter en apikal resektion5. Selv om denne teknik kan fremkalde hjerteregenerering i nyfødte, mangler operationen klinisk relevans for menneskelige hjerteskader. For at efterligne en menneskelig skade i neonatal mus model, har vi udviklet en teknik til at fremkalde en myokardieinfarkt gennem en koronararterie okklusion6. Denne teknik kræver kirurgisk ligation af venstre anterior faldende arterie (LAD), som er ansvarlig for at levere 40%-50% af blodet til venstre ventrikulær myokardiet6,7. Således, operationen resulterer i en infarkt, der påvirker en betydelig del af venstre ventrikelvæg. Denne skade på myokardiet vil stimulere kardiomyocyt spredning og hjerte regenerering i nyfødte5.

Koronararterieokklusionkirurgi giver en meget reproducerbar og direkte translationel metode til at afdække de indre funktioner i hjerteregenerering. Den neonatal kirurgi paralleller koronararterie åreforkalkning i det menneskelige hjerte, hvor ophobning af plak inden for de indre vægge af arterierne kan forårsage en okklusion og efterfølgende myokardieinfarkt8. På grund af et tomrum i terapeutiske behandlinger for hjertesvigt patienter, en okklusion i LAD er forbundet med dødelighed en nåede op til 26% inden for et år efter skade9, og derfor er blevet kaldt “enke maker.” Fremskridt inden for terapi kræver en model, der præcist afspejler de komplekse fysiologiske og patologiske virkninger af hjerteskade. Vores kirurgiske protokol for neonatal mus hjerteskade giver en platform, der giver forskerne mulighed for at undersøge de molekylære og cellulære signaler, der signalerer pattedyr hjerte regenerering efter skade.

Nyere forskning fremhæver det dynamiske forhold mellem det ekstracellulære miljø og prolifererende kardiomyocytter. For eksempel kan det postnatale regenerative vindue forlænges ved at mindske stivheden af den ekstracellulære matrix omkring hjertet10. Biomaterialer fra neonatal ekstracellulær matrix kan også fremme hjerte regenerering i voksne pattedyr hjerter efter hjerteskade11. Også ledsagende kardiomyocyt spredning er en angiogenic respons12,13; sikkerhedsstillelse arterie dannelse unikke for regenererende hjertet af neonatal musen viste sig at være afgørende for at stimulere hjerteregenerering12. Desuden har vores laboratorium vist, at nerve signalering regulerer kardiomyocyt spredning og hjerte regenerering via graduering af vækstfaktor niveauer, samt den inflammatoriske reaktion efter skade14. Disse resultater understreger behovet for at spore ikke-myocyt cellepopulationer som reaktion på hjerteskade. For at nå dette mål, har vi benyttet os af Cre-lox rekombinationssystem i transgene mus linjer til at indarbejde konstituerende eller betinget udtryk for fluorescerende reporter proteiner til afstamning sporing. Desuden kan vi bruge avancerede metoder til at bestemme klonale ekspansion mønstre med Rainbow muselinje, som er afhængig af stokastiske udtryk for Cre-afhængige, multi-farve fluorescerende journalister til at bestemme klonal udvidelse af målrettede cellepopulationer15. Beskæftiger afstamning opsporing med neonatal koronararterie okklusion kirurgi er et kraftfuldt værktøj til at dissekere de indviklede cellulære mekanismer hjerteregenerering.

Sporing afstamning af fluorescerende mærkede celler med tre-dimensionelle (3D) hele organ imaging er vanskeligt at opnå ved hjælp af traditionelle skæring og genopbygning teknik – især når cellepopulationer er skrøbelige, såsom nervefibre eller blodkar. Mens direkte hel-mount billeddannelse af orglet ved optisk skæring kan fange overfladiske cellepopulationer, strukturer, der bor dybt inde i vævet forbliver utilgængelige. For at omgå disse barrierer er der udviklet vævsrydningsteknikker for at reducere opaciteten af hele organvæv. For nylig, betydelige fremskridt er blevet gjort for at Clear Lipid-udvekslede Acrylamid-hybridiseret Rigid Imaging kompatible Tissue hYdrogel (CLARITY)-baserede metoder, som klare fast væv via lipid ekstraktion16. Der tages også skridt til at homogenisere brydningsindekset og derefter reducere lysspredning, mens billeddannelse17. En sådan metode er aktiv CLARITY, som fremskynder lipid nedbrydning ved hjælp af elektroforese at trænge ind i vaskemiddel i hele vævet18. Selv om effektiv, denne væv clearing metode kræver dyrt udstyr og kan forårsage vævsskader, hvilket gør tilgangen uforenelig med skrøbelige cellepopulationer såsom hjertenerver19. Således anvender vi den passive CLARITY tilgang, som er afhængig af varme til forsigtigt at lette vaskemiddel penetration, derfor medvirken i fastholdelsen af indviklede cellestrukturer20,21.

Passiv KLARHED menes typisk at være mindre effektiv end aktiv CLARITY18, da teknikken ofte ledsages af to store hindringer: den manglende evne til at rydde hele organdybden og den omfattende tid, der kræves for at rydde voksenvæv. Vores passive CLARITY tilgang overvinder begge disse barrierer med en fremskyndet clearing proces, der er i stand til fuldt ud at rydde neonatal og voksen hjertevæv. Vores passive CLARITY vævsrydningsteknik har nået en effektivitet, der gør det muligt at visualiseringaf en række hjertecellepopulationer, herunder sjældne populationer fordelt over hele det voksne hjerte. Når det ryddede hjerte er afbildet med konfokal mikroskopi, kan arkitekturen af celle-specifikke mønstre under udvikling, sygdom og regenerering belyses.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen for brug og pleje af laboratoriedyr og i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care and Use Committee i School of Medicine and Public Health ved University of Wisconsin-Madison. Alle metoder blev udført på vilde type C57BL/6J (B6) og transgene muselinjer fremstillet af Jackson Laboratories. 1. Koronararterie Okklusion (Myokardieinfarkt) Induceret via Ligation af venstre anterior faldende arterie (LAD) i 1-dags-gamle neonat…

Representative Results

Ofte er de to mest udfordrende trin vejlede hjertet ud af brysthulen og ligating LAD. For at foretage fejlfinding af disse trin kan der foretages justeringer i placeringen af den indledende punktering mellem de fjerde interkostale muskler. Hvis punkteringen og den stumpe dissektion er for tæt på brystbenet, kan hjertet muligvis ikke forlade brysthulen (figur 1A). Desuden kan øget pres på venstre mave være nødvendigt for at lette denne proces…

Discussion

Celle-celle interaktioner mellem kardiomyocytter og ikke-myocyt populationer er en afgørende faktor for, om hjertet vil gennemgå fibrose eller reparation efter skade. Opdagelser er blevet gjort viser, at en række celletyper, herunder nerver14, epikardieceller24, peritoneal makrofager25, arterioler12,13, og lymfeformet endotelceller26, alle spiller en væsentlig roll…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansieringen af dette projekt blev ydet af UW School of Medicine and Public Health fra Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), og en American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures Ethicon 8889H Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps Excelta 16-050-146 Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps Fisherbrand 13-812-39 Dissecting, 4.5 in
Glass Vial Fisherbrand 03-339-26A 12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz Sigma-Aldrich Density gradient medium
Iridectomy Scissors Fine Science Tools 15000-03 2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors Fisherbrand 08-951-20 Straight, 6 in
Needle Holder Fisherbrand 08-966 Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps Sigma-Adrich Z168777 Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor Walter Stern Inc 25870-002 30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps Excelta 16050133 Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044 Wako Chemicals Water-soluble azo initiator

References

  1. Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
  2. Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
  3. Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
  4. Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
  7. Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
  8. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  9. MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
  10. Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
  11. Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
  12. Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
  13. Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
  14. Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
  15. Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
  16. Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  17. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  18. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  19. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
  20. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
  21. Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
  22. Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
  23. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
  24. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  25. Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  26. Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).

Play Video

Cite This Article
Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60482, doi:10.3791/60482 (2020).

View Video