Summary
A proliferação de cardiomiócitos após a lesão é um processo dinâmico que requer uma sinfonia de pistas extracelulares de populações de células não miócitos. Utilizando o rastreamento de linhagem, claridade passiva e técnicas tridimensionais de microscopia confocal de montagem completa, podemos analisar a influência de uma variedade de tipos de células na reparação e regeneração cardíaca.
Abstract
As doenças cardiovasculares superam todas as outras causas de morte e são responsáveis por impressionantes 31% das mortes em todo o mundo. Esta doença se manifesta em lesão cardíaca, principalmente na forma de um infarto agudo do miocárdio. Com pouca resiliência após a lesão, o tecido cardíaco outrora saudável será substituído por tecido fibroso, cicatriz não contraído e muitas vezes será um prelúdio para a insuficiência cardíaca. Para identificar novas opções de tratamento na medicina regenerativa, a pesquisa se concentrou em vertebrados com capacidades regenerativas inatas. Um desses organismos modelo é o camundongo neonatal, que responde a lesões cardíacas com regeneração robusta do miocárdio. A fim de induzir uma lesão no camundongo neonatal que é clinicamente relevante, desenvolvemos uma cirurgia para ocluir a artéria descendente anterior esquerda (LAD), espelhando um infarto do miocárdio desencadeado pela aterosclerose no coração humano. Quando combinado com a tecnologia para acompanhar as mudanças tanto dentro de cardiomiócitos quanto de populações não-miócitos, este modelo nos fornece uma plataforma para identificar os mecanismos que orientam a regeneração cardíaca. Obtendo uma visão das mudanças nas populações de células cardíacas após a lesão, uma vez que se baseou fortemente em métodos como secção de tecidos e exame histológico, que são limitados à análise bidimensional e muitas vezes danificam o tecido no processo. Além disso, esses métodos não têm a capacidade de rastrear mudanças nas linhagens celulares, em vez disso, fornecendo apenas um instantâneo da resposta à lesão. Aqui, descrevemos como métodos tecnologicamente avançados em modelos de rastreamento de linhagem, limpeza de órgãos inteiros e microscopia de montagem total tridimensional (3D) podem ser usados para elucidar mecanismos de reparação cardíaca. Com nosso protocolo para cirurgia de infarto do miocárdio neonatal, limpeza de tecidos e imagem de órgão inteiro 3D, as vias complexas que induzem a proliferação de cardiomiócitos podem ser desvendadas, revelando novos alvos terapêuticos para a regeneração cardíaca.
Introduction
O coração tem sido considerado por muito tempo como um órgão pós-mitótico, mas evidências recentes demonstram que a renovação dos cardiomiócitos ocorre no coração humano adulto em cerca de 1% ao ano1. No entanto, essas baixas taxas de rotatividade de cardiomiócitos são insuficientes para repor a perda maciça de tecido que ocorre após a lesão. Um coração que sofreu um infarto do miocárdio perderá cerca de um bilhão de cardiomiócitos, muitas vezes servindo como prelúdio para insuficiência cardíaca e morte cardíaca súbita2,3. Com mais de 26 milhões de pessoas afetadas pela insuficiência cardíaca em todo o mundo, há uma necessidade não atendida de terapêutica que pode reverter os danos infligidos por doenças cardíacas4.
A fim de preencher essa lacuna na terapêutica, os cientistas começaram a investigar mecanismos evolutivamente conservados que sustentam a regeneração endógena após a lesão. Um modelo para estudar a regeneração cardíaca de mamíferos é o camundongo neonatal. Na semana seguinte ao nascimento, os camundongos neonatais têm uma resposta regenerativa robusta após danos cardíacos5. Já demonstramos anteriormente que camundongos neonatais podem regenerar seu coração através da proliferação de cardiomiócitos após uma ressecção apical5. Embora essa técnica possa evocar a regeneração cardíaca nos recém-nascidos, a cirurgia carece de relevância clínica para lesões cardíacas humanas. Para imitar uma lesão humana no modelo de camundongos neonatais, desenvolvemos uma técnica para induzir um infarto do miocárdio através de uma oclusão da artéria coronária6. Esta técnica requer ligadura cirúrgica da artéria descendente anterior esquerda (LAD), responsável por fornecer 40%-50% do sangue para o miocárdio ventricular esquerdo6,7. Assim, a cirurgia resulta em um infarto que impacta uma parcela significativa da parede ventricular esquerda. Este dano ao miocárdio estimulará a proliferação de cardiomiócitos e a regeneração cardíaca em recém-nascidos5.
A cirurgia de oclusão da artéria coronária fornece um método altamente reprodutível e diretamente translacional para descobrir o funcionamento interno da regeneração cardíaca. A cirurgia neonatal faz um paralelo com a aterosclerose da artéria coronária no coração humano, onde o acúmulo de placa dentro das paredes internas das artérias pode causar uma oclusão e posterior infarto do miocárdio8. Devido a um vazio nos tratamentos terapêuticos para pacientes com insuficiência cardíaca, uma oclusão no LAD está associada a taxas de mortalidade que chegam a 26% dentro de um ano após a lesão9, e consequentemente tem sido chamada de "fazedora de viúvas". Os avanços terapêuticos requerem um modelo que reflita com precisão os complexos efeitos fisiológicos e patológicos da lesão cardíaca. Nosso protocolo cirúrgico para lesão cardíaca de camundongos neonatais fornece uma plataforma que permite aos pesquisadores investigar as pistas moleculares e celulares que sinalizam a regeneração cardíaca dos mamíferos após a lesão.
Pesquisas recentes destacam a relação dinâmica entre o ambiente extracelular e a proliferação de cardiomiócitos. Por exemplo, a janela regenerativa pós-natal pode ser estendida diminuindo a rigidez da matriz extracelular ao redor do coração10. Biomateriais da matriz extracelular neonatal também podem promover a regeneração cardíaca em corações de mamíferos adultos após lesão cardíaca11. Também acompanhando a proliferação de cardiomiócitos é uma resposta angiogênica12,13; a formação da artéria colateral única ao coração regenerador do camundongo neonatal mostrou-se essencial para estimular a regeneração cardíaca12. Além disso, nosso laboratório demonstrou que a sinalização nervosa regula a proliferação de cardiomiócitos e a regeneração cardíaca via modulação dos níveis dos fatores de crescimento, bem como a resposta inflamatória após a lesão14. Esses achados enfatizam a necessidade de traçar populações de células não miócitos em resposta a lesões cardíacas. Para atingir esse objetivo, aproveitamos o sistema de recombinação Cre-lox em linhas transgênicas de camundongos para incorporar a expressão constitutiva ou condicional de proteínas fluorescentes de repórteres para rastreamento de linhagem. Além disso, podemos usar métodos avançados para determinar a padronização da expansão clonal com a linha de mouses Rainbow, que se baseia na expressão estocástica dos repórteres fluorescentes de cor multi-cor dependentes do Cre para determinar a expansão clonal das populações de células-alvo15. A utilização de rastreamento de linhagem com a cirurgia de oclusão da artéria coronária neonatal é uma poderosa ferramenta para dissecar os intrincados mecanismos celulares de regeneração cardíaca.
O rastreamento da linhagem de células fluorescentes rotuladas com imagens de órgãos tridimensionais (3D) é difícil de alcançar usando a técnica tradicional de secção e reconstrução – especialmente quando as populações celulares são frágeis, como fibras nervosas ou vasos sanguíneos. Enquanto a imagem direta do órgão por secção óptica pode capturar populações celulares superficiais, estruturas que residem profundamente dentro do tecido permanecem inacessíveis. Para contornar essas barreiras, técnicas de limpeza de tecidos foram desenvolvidas para reduzir a opacidade de tecidos de órgãos inteiros. Recentemente, avanços significativos foram feitos para os métodos de tecido rígido hibridizado de Acrilamida com acrilamida da Clear Lipide- hibridizado de imagem rígida hYdrogel (CLARITY), que limpam o tecido fixo através da extração lipídica16. Medidas também são tomadas para homogeneizar o índice de refração e, posteriormente, reduzir a dispersão de luz durante a imagem17. Um desses métodos é o CLARITY ativo, que acelera a decomposição lipídica usando eletroforese para penetrar o detergente em todo o tecido18. Embora eficaz, este método de limpeza de tecidos requer equipamentos caros e pode causar danos teciduais, tornando a abordagem incompatível com populações celulares frágeis, como os nervos cardíacos19. Assim, utilizamos a abordagem passiva CLARITY, que conta com o calor para facilitar suavemente a penetração de detergentes, auxiliando, portanto, na retenção de estruturas celulares intrincadas20,21.
A CLARIDADE Passiva é tipicamente considerada menos eficiente do que a CLARIDADE ativa18,pois a técnica é frequentemente acompanhada por dois grandes obstáculos: a incapacidade de limpar toda a profundidade do órgão e a extensa quantidade de tempo necessária para limpar tecidos adultos. Nossa abordagem passiva CLARITY supera ambas as barreiras com um processo de limpeza acelerada que é capaz de limpar totalmente o tecido cardíaco neonatal e adulto. Nossa técnica passiva de limpeza de tecidos CLARITY alcançou uma eficiência que permite a visualização de uma variedade de populações de células cardíacas, incluindo populações raras distribuídas por todo o coração adulto. Quando o coração limpo é imagemdo com microscopia confocal, a arquitetura da padronização específica da célula durante o desenvolvimento, doença e regeneração pode ser iluminada.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia de Uso e Cuidado de Animais de Laboratório e em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais na Faculdade de Medicina e Saúde Pública da Universidade de Wisconsin-Madison. Todos os métodos foram realizados em linhas de camundongos do tipo selvagem C57BL/6J (B6) e transgênicas obtidas nos Laboratórios Jackson.
1. Oclusão da Artéria Coronária (Infarto do Miocárdio) Induzida via Ligadura da Artéria Descendente Anterior Esquerda (LAD) em Camundongos Neonatais de 1 dia de idade6
- Separe os filhotes neonatais de 1 dia de idade da mãe, colocando-os em uma gaiola limpa junto com parte do material original de ninho.
- Coloque metade da gaiola em uma almofada de aquecimento definida para fogo médio. Os filhotes devem permanecer no lado não aquecido da gaiola, sendo colocados apenas no lado aquecido após a cirurgia.
- Crie uma área cirúrgica estéril um microscópio operacional. Recolher equipamento cirúrgico esterilizado(Tabela 1).
- Anestesiar o filhote via hipotermia: enrole o filhote em gaze para evitar o contato direto da pele com gelo e enterre-o em um leito de gelo por aproximadamente 3-4 min. Verifique a hipotermia dos ratos periodicamente realizando uma pitada de dedo do dedo. Os recém-nascidos toleram bem a hipotermia, no entanto, a exposição prolongada à hipotermia pode resultar em queimaduras de gelo e mortalidade subsequente.
- Uma vez anestesiado, coloque o rato sobre a área cirúrgica na posição supina, prendendo os braços e pernas com fita adesiva. Esterilizar a área cirúrgica do camundongo com uma solução antisséptica.
- Localize a região inferior do tórax e faça uma incisão transversa na pele com uma pequena tesoura dissecante. Para ampliar a visão cirúrgica das costelas, separe a pele do músculo levantando a pele suavemente com um par de pinças de curativo e pressione suavemente contra os músculos intercostais com a pequena tesoura na posição fechada.
- Localize o quarto espaço intercostal (Figura 1A) e faça uma punção pequena e superficial usando fórceps afiados, tomando cuidado para não perfurar nenhum órgão interno. Realize uma dissecção contundente ampliando a área entre os músculos intercostais com pinças de curativo. O posicionamento anatômico adequado da incisão é essencial para o acesso adequado ao coração.
- Guie suavemente o coração para fora da cavidade torácica colocando um dedo e aplicando pressão crescente no lado esquerdo do abdômen enquanto segura o espaço intercostal aberto com pinças de curativo(Figura 1B). Uma vez que o coração esteja fora do peito, remova os fórceps do curativo, alivie a pressão e deixe o coração descansar sobre os músculos intercostais.
- Localize o LAD como a área do coração que tem menos sangue acumulado e está na posição anatômica correta(Figura 1C). O LAD só pode ser visto o microscópio se o coração for acessado dentro de alguns minutos após o início da cirurgia.
- Realizar a ligadura LAD suturando o LAD com uma sutura de 6-0(Figura 1D). Amarre um nó quadrado duas vezes para induzir o infarto do miocárdio(Figura 1E). A profundidade da sutura no miocárdio pode variar, no entanto, o posicionamento anatômico adequado da ligadura LAD é crucial para a reprodutibilidade. Ao ligar o LAD, a sutura deve ser puxada com firme, mas com cuidado para não cortar o LAD. A branqueamento no ápice do coração será vista imediatamente (Figura 1E)
- Deixe o coração escorregar de volta para a cavidade torácica; este processo pode ser suavemente facilitado com pinças de vestir. Suturar as costelas juntamente com o nó de um cirurgião seguido de um nó quadrado, usando fórceps contundentes para levantar o conjunto superior de costelas enquanto passa uma sutura 6-0 através do conjunto superior e inferior de costelas.
- Remova a fita que foi usada para fixar as patas traseiras do filhote.
- Adere a pele junto colocando uma pequena quantidade de cola de pele no abdômen superior. Em seguida, pegue a pele do abdômen inferior com fórceps finos e cubra a região do peito exposta. Limitar a quantidade de cola em excesso que permanece sobre os filhotes, pois isso pode aumentar a probabilidade de rejeição e canibalismo por parte da mãe.
- Facilite imediatamente a recuperação da anestesia colocando o filhote em uma almofada de aquecimento definida para fogo médio. Mude periodicamente a colocação dos recém-nascidos para aquecer uniformemente todas as partes do corpo.
- Deixe o recém-nascido permanecer diretamente na almofada de aquecimento por 10-15 min. Normalmente, o movimento é recuperado dentro de 5 minutos de ser colocado no calor.
- Limpe o sangue residual e cole com uma limpeza de álcool.
- Cubra perfumes estranhos em recém-nascidos esfregando todo o corpo com roupa de cama da gaiola original. Coloque o filhote na gaiola do lado aquecido enquanto outras cirurgias estão sendo realizadas.
- Uma vez que todas as cirurgias são concluídas e os filhotes são quentes e móveis, transfira a ninhada junto com o material original de aninhamento para a gaiola da mãe.
- Monitore os camundongos por 30-60 min após a cirurgia e observe a aceitação da mãe dos filhotes fazendo ninho e/ou preparo.
- Verifique os ratos na manhã seguinte à cirurgia. Se a mãe está angustiada e não aninha os filhotes, considere uma mãe adotiva para os filhotes.
2. Limpar o coração do rato com CLARIDADE Passiva21,,22,,23
- Anestesiar o rato com isoflurano. Execute uma pitada de dedo do dedo para garantir que o mouse esteja totalmente sedado.
- Coloque o mouse sobre uma área cirúrgica limpa na posição supina, prendendo os braços e pernas com fita adesiva.
- Mantenha a sedação de isoflurano no mouse usando um cone do nariz até que o coração seja extraído.
- Abra o peito inferior segurando a pele logo abaixo do processo xifoide com fórceps teciduais e faça uma incisão abrangendo a largura da caixa torácica usando a grande tesoura dissecante.
- Corte ao lado das porções distais da caixa torácica com uma tesoura cirúrgica.
- Exponha o músculo diafragma agarrando o processo xifoide com fórceps teciduais. Desconecte o diafragma usando fórceps curvos.
- Mantendo uma compreensão do processo xifoida, puxe o tecido cranialmente até que o coração batendo esteja acessível.
- Segure o coração na base com fórceps curvados e disseque o coração da cavidade torácica cortando a aorta e a veia cava superior com uma tesoura de iridectomia.
- Enquanto o coração ainda está batendo, coloque o coração em uma placa de Petri cheia de PBS para que o coração bombeie o sangue para dentro enquanto ele continua batendo. O infarto do miocárdio pode ser confirmado verificando se a colocação da sutura está na posição anatômica adequada para a ligadura LAD.
- Aperte suavemente o coração com fórceps para permitir que o coração expulse o sangue residual.
- Transfira o coração do rato para um frasco descartável de concha de vidro de 2,5 mL com 2 mL de PBS. Lave o sangue residual incubando o coração em um agitador por 10 minutos à temperatura ambiente (RT) várias vezes. Altere a solução PBS todas as vezes até que o PBS permaneça limpo.
- Descarte o PBS e encha o frasco com 2 mL de paraformaldeído frio de 4% (PFA). Incubar por 4 horas no RT (Figura 2A).
- Após a incubação, descarte o PFA e o frasco com 2 mL de PBS. Lave o coração em um agitador por 10 min em RT. Repita o passo de lavagem duas vezes, drenando e enchendo o frasco com novo PBS cada vez para lavar completamente o excesso de PFA.
- Descarte o PBS e encha o frasco com 2 mL de 4% de acrilamida e 0,5% de solução VA-044. Incubar durante a noite a 4 °C.
- No dia seguinte, realize a polimerização transferindo o frasco para um bloco de calor fixado a 37 °C por 3 horas.
- Transfira o coração para um novo frasco de concha de vidro e repita o passo 2.12 (ciclo de lavagem PBS).
- Descarte o PBS e encha o frasco com 2 mL de solução de compensação(Tabela 2). Incubar a 37 °C até que o coração esteja limpo. Altere a solução e recarregue com a solução de compensação fresca a cada 2-3 dias. O processo de compensação pode levar até várias semanas(Figura 2B-C).
NOTA: Os corações P1 normalmente levam em torno de 3 a 5 dias, enquanto os corações P21 podem levar quase um mês antes que a incubação da Solução de Compensação esteja completa. - Descarte o PBS e encha o frasco com 2 mL de PBS e repita a etapa 2.12 (ciclo de lavagem PBS). Recarregue o frasco com PBS fresco e incubar durante a noite a 37 °C.
- Se a imunocoloração for realizada, pule as etapas 2.21-2.22 e prossiga para a Seção 3 para a imunocoloração. Se depender exclusivamente de fluorescência endógena, prossiga com as etapas 2.21-2.22 e pule a Seção 3.
- Descarte o PBS e altere a solução para Solução de Correspondência de Índice refrativo (RIMS) (Tabela 3). Incubar durante a noite a 37 °C.
- Após a incubação, o tecido limpo pode ser armazenado na solução RIMS na RT. O tecido pode parecer branco e opaco no centro quando transferido pela primeira vez para o RIMS; o tecido deve ficar transparente após ser incubado em RIMS à temperatura ambiente por várias semanas(Figura 2D).
3. Opcional: Coloração imuno-histoquímica do coração do rato de montagem integral
- Remova o coração limpo da solução RIMS e coloque em um frasco de vidro limpo de 2,5 mL com 2 mL de PBST (PBS com 0,1% Triton-X 100)
- Lave o coração em PBST 3 vezes em um rotador orbital com incubações de 30 min no RT.
- Bloqueie a ligação de anticorpos não específicos ao imersão do coração em 2 mL de 20% de tampão de bloqueio (diluído em PBST) e incubar com rotação por 3 horas em RT. Transfira para 4 °C para colorir com rotação durante a noite.
NOTA: O tampão de bloqueio é feito de soro normal que corresponde à espécie em que o anticorpo secundário foi criado. - Lave o coração em PBST 3 vezes com rotação para incubações de 5 min em RT.
- Mergulhe o coração em anticorpo primário (diluído em 2% de tampão de bloqueio com PBST) e evite a exposição à luz envolvendo o frasco de vidro em papel alumínio. Incubar com rotação durante a noite no RT.
NOTA: Deste ponto em diante, a folha de alumínio deve ser continuamente usada para proteger o secundário da exposição à luz ambiente. - Incubar por mais 24 horas com rotação a 4 °C.
- Após a coloração primária, repita o passo 3.2 (longo ciclo de lavagem pbst) para remover o anticorpo primário desvinculado do tecido. Estenda a lavagem com uma incubação durante a noite com rotação em RT.
- Trabalhando em uma área com iluminação limitada para evitar a exposição à luz de anticorpos secundários, mergulhe o coração em anticorpo secundário (diluído em 2% de tampão de bloqueio com PBST) e incubar com rotação por 3 horas em RT. Transfira para 4 °C para colorir com rotação durante a noite.
- No dia seguinte, repita o passo 3.2 (longo ciclo de lavagem pbst) para remover o anticorpo secundário não ligado.
- Substitua a solução por um tampão de bloqueio de 2% (diluído em PBST). Remova o anticorpo residual desvinculado lavando durante a noite com rotação em RT.
- No dia seguinte, verifique se o excesso de anticorpo secundário foi removido usando microscopia confocal. Amplie a lavagem conforme necessário, substituindo a solução de tampão de bloqueio de 2% diariamente. Proceder uma vez pouco ou nenhum secundário não específico está presente.
- Armazene o coração imunosmacuado em PBS a 4 °C.
- Diretamente antes da microscopia de montagem total, incubar o coração na solução RIMS durante a noite a 37 °C. Estender a incubação por mais 24 horas se o tecido ainda não estiver totalmente limpo.
- Armazene o coração totalmente limpo e imunomanchado em RIMS em RT.
4. Visualização de populações não-miócitos em 3D com microscopia confocal de fótons único do coração do rato limpo
NOTA: Se os corações do rato forem colhidos embrionáriamente, continue com a seção 4.1. Para os corações de camundongos colhidos no pós-natal, continue com a seção 4.2.
- Imagem do coração de rato embrionário limpo
- Preencha o slide de depressão do microscópio com a solução PBS.
- Pegue cuidadosamente o coração limpo com fórceps curvos e coloque o tecido sobre o escorregador.
- Monte o slide com um deslizamento de vidro. O tecido agora pode ser imagem um microscópio confocal.
- Imagem do coração do rato pós-natal limpo
- Preencha metade da câmara do slide de depressão com a solução PBS. Para criar uma câmara grande o suficiente para caber um coração de rato adulto, um slide de depressão de polipropileno impresso em 3D foi feito medida(Figura 4).
- Pegue cuidadosamente o coração limpo com fórceps curvos e coloque o tecido na câmara. Preencha o volume restante da câmara com PBS.
- Encha a câmara com PBS para que a superfície do líquido forme uma cúpula acima do topo da câmara. Monte o slide de cobertura. O tecido agora pode ser imagem um microscópio confocal vertical.
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Representative Results
Muitas vezes os dois passos mais desafiadores são guiar o coração para fora da cavidade torácica e ligar o LAD. Para solucionar esses degraus, podem ser feitos ajustes na colocação da punção inicial entre os quartos músculos intercostais; se a perfuração e dissecção contundente estiverem muito próximas do esterno, o coração pode não ser capaz de sair da cavidade torácica(Figura 1A).
Além disso, pode ser necessário aumentar a pressão no abdômen esquerdo para facilitar esse processo(Figura 1B). Complicações também podem ocorrer ao descansar o coração nos músculos intercostais. Descobrimos que o coração permanecerá fora da cavidade sem se retirar quando a dissecção contundente for mantida em um tamanho mínimo e realizada principalmente na direção horizontal. Essa orientação também permite uma visualização clara e acessibilidade ao LAD (Figura 1C).
Ao colocar a agulha de sutura atrás do LAD, sugere-se penetrar profundamente na parede anterior do ventrículo esquerdo, pois uma ligadura superficial tem menos espaço para ajuste na colocação final da sutura(Figura 1D). A amarração da sutura ao redor do LAD deve ser realizada com movimentos controlados e constantes, pois o LAD é frágil e rompe ndo esta artéria coronária e a parede anterior causará mortalidade(Figura 1E). Dentro de 5 a 10 minutos após a cirurgia estar completa, o recém-nascido deve ser animado e respirando normalmente.
Ao seguir para o protocolo passivo CLARITY, os corações colhidos de uma linha de rato que incorpora um repórter fluorescente endógeno para o rastreamento da linhagem celular devem ser protegidos da luz (Figura 2), que pode ser realizado envolvendo o frasco de vidro em papel alumínio. Durante a etapa de compensação, o tempo de incubação na Solução de Compensação é variável dependendo da idade do camundongo quando o coração foi colhido. Esta etapa é completa quando todo o tecido é consistentemente opaco, sem descoloração no centro (Figura 2B-C). Os corações ficarão cada vez mais transparentes após o armazenamento na solução RIMS à temperatura ambiente por alguns dias(Figura 2D). Deve-se notar que a expansão do tecido pode ocorrer durante o processo de compensação.
Nosso protocolo passivo CLARITY permite uma penetração eficaz de anticorpos e, portanto, é compatível com métodos imunohistoquímicos para rotular proteínas de interesse. Isso foi validado no Actl6bCre; Camundongos transgênicos Rosa26tdT, que rotulam neurônios maduros com a proteína repórter tdTomato (tdT). Os nervos cardíacos são principalmente superficiais, com algumas populações residindo na camada epicárdica, por isso usamos essa população celular como modelo de prova de principal para a reprodutibilidade do sinal de repórter endógeno(Figura 3A),bem como a preservação da conformação da proteína do repórter antes e depois da CLARIDADE(Figura 3B-C). Nossos resultados representativos do Actl6bCre; Os camundongos Rosa26tdT mostram que o sinal de proteína tdT endógeno visto nos nervos de um coração P7 não claro foi fielmente recapitulado em nervos de ambos os corações tdT imclaro e limpos imunorotulados P7(Figura 3). Para imunorótulo saquet-positivo, um anticorpo primário da Proteína Fluorescente Vermelha (RFP) (policloal de coelho; 1:200 diluição; Rockland #600-401-379) foi usado juntamente com um anticorpo secundário Alexa Fluor 488 (policlonal de cabra; 1:1000 diluição; Invitrogen #A-11008). Para visualizar o coração limpo olho por olho durante as etapas de imunocoloração e imagem, uma lanterna ultravioleta pode ser usada brevemente para iluminar o coração.
Figura 1: Indução de Infarto do Miocárdio no Rato Neonatal através da Oclusão da Artéria Coronária da Artéria Descendente Anterior Esquerda (LAD). (A) O quarto espaço intercostal, indicado por um único asterisco (*), está localizado e uma dissecção contundente é realizada. (B) A pressão é aplicada no abdômen esquerdo para guiar o coração para fora da cavidade torácica. (C) O LAD, marcado por um asterisco duplo (**), é identificado como sendo a artéria predominante e por posição anatômica. (D, E) Uma sutura é então passada atrás do LAD e um nó quadrado é amarrado ao redor do LAD para induzir uma oclusão da artéria coronária e subsequente infarto. (E) Uma vez completa, a branqueamento pode ser vista abaixo da sutura, no ápice do coração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Progressão do Método de CLARIDADE Passiva em um Coração de Rato P14. Os corações foram colhidos de camundongos P14,(A)fixos e(B-D)submetidos ao protocolo passivo CLARITY. Para corações tomados em um ponto de tempo P14, o passo de incubação da solução de compensação é (B) incompleto quando a descoloração no centro do coração é aparente, vista após 6 dias, e (C) completa quando o coração aparece uniformemente opaco, visto após 10 dias. (D)Depois que o coração é armazenado em RIMS, o tecido é completamente limpo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem 3D completa de corações de rato P7 com microscopia confocal. Imagens 3D representativas de p7 Actl6bCre; Os corações de camundongos transgênicos Rosa26tdT são mostrados como projeções de intensidade máxima de imagens empilhadas em Z. Os corações foram revistos para mostrar(A) fluorescência endógena tdTomato (tdT) diretamente após a colheita (vermelho)(B) imunocoloração de nervos tdT positivos em um coração incosido (Alexa Fluor 488; verde) e (C) imunorotulagem reprodutível de nervos tdT positivos em um coração limpo (Alexa Fluor 488; verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Slides de depressão de polipropileno impresso sinuoso 3D. Para imagem das amostras de coração pós-natal, slides de depressão personalizados foram impressos em 3D em polipropileno. As dimensões do slide são de 25 mm x 75 mm x 1 mm, com uma depressão deslizante de 13 mm de diâmetro e(A)6,5 mm ou(B)17 mm de profundidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tipo de equipamento | Descrição | Empresa | Número do catálogo |
| Frasco de vidro | Frasco de 12 x 35mm com tampa | Marca de pesca | 339-26A |
| 6-0 Suturas de Prolene | Suturas de polipropileno | Ethicon | 8889H |
| Fórceps afiados | Dica fina, reta, 4.25 em | Sigma-Adrich | Z168777 |
| Pinças de vestir | Dissecando, 4,5 em | Marca de pesca | 13-812-39 |
| Suporte de agulha | Mayo-Hegar, 6 em | Marca de pesca | 08-966 |
| Pequena tesoura dissecindo | Borda de corte de 30 mm | Walter Stern Inc | 25870-002 |
| Fórceps de tecido | Tecido médio, 1X2 Dentes | Excelta | 16050133 |
| Tesoura de dissecação grande | Em linha reta, 6 em | Marca de pesca | 08-951-20 |
| Tesoura de Iridectomia | Borda de corte de 2 mm | Ferramentas de ciência fina | 15000-03 |
| Fórceps curvos | Metade curvada, serrilhada, 4 em | Excelta | 16-050-146 |
Tabela 1: Equipamento cirúrgico.
| Solução de compensação | |||
| Reagente | Final | Quantidade | Notas |
| Sulfato de dodecil de sódio (SDS) | 8,0% c/v | 40 g | |
| Ácido bórico | 1,25% c/v | 6,25 g | |
| 1-thioglicerol | 0,5% c/v | 5 μL/mL | Adicionado conforme necessário para a solução |
| Adicione 400 ml de h20 ultrapuro a 1 L de béquer. Misture em SDS e Ácido Bórico com agitação magnética. | |||
| Ajuste o pH para 8,5 usando 6M NaOH. Leve o volume para 500 ml e Autoclave. | |||
| Armazene a solução em temperatura ambiente. | |||
| Outros Reagentes de CLAREAÇÃO | |||
| Reagente | Final | Estoque | Notas |
| Pfa | 4.0% | 16% | Diluído em PBS |
| Acrilamida | 4.0% | 40% | Diluído em PBS |
| VA-044 | 0.5% | 10% | Adicionado conforme necessário para a solução |
Tabela 2: Solução de compensação e outros reagentes de CLAREZA.
| Reagente | Final | Quantidade |
| Tampão de fosfato | 0,02 M | 90 mL |
| Histodenz | 133,3% c/v | 120 g |
| Azida de sódio | 0,05% c/v | 45 mg |
| Adicione 90 mL de tampão de fosfato de 0,02 M à garrafa de mídia de vidro de 250 mL envolta em papel alumínio. | ||
| Misture em reagentes listados com agitação magnética. Permitir que os componentes se dissolvam durante a noite. | ||
| Solução de vórtice e filtrar purificar com sistema de filtragem em uma garrafa de mídia de vidro estéril de 250 mL. | ||
| Enrole a garrafa em papel alumínio e armazene a solução à temperatura ambiente. | ||
Tabela 3: Solução de correspondência de índice de refração (RIMS).
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Discussion
As interações celular-celular entre cardiomiócitos e populações não-miócitos são um fator determinante para saber se o coração será submetido a fibrose ou reparação após a lesão. Descobertas têm sido feitas demonstrando que uma variedade de tipos de células, incluindo nervos14, células epicárdicas24, macrófagos peritoneal25, arterioles12,13, e células endoteliais linfáticas26, todos desempenham um papel essencial na mediação da reparação cardíaca. Essas linhagens celulares e outras de interesse podem ser geneticamente rastreadas durante o desenvolvimento, doença e regeneração aplicando tecnologias Cre-lox e CRISPR-Cas9 em camundongos. Quando juntamente com a limpeza de órgãos e métodos avançados de microscopia, as contribuições de populações não-miócitos podem ser avaliadas com precisão, abrindo a porta para elucidar alvos celulares e moleculares da regeneração do miocárdio após a lesão.
A eficiência do protocolo depende da ligadura consistente e reprodutível do LAD durante a cirurgia de oclusão da artéria coronária. Camundongos neonatais são sensíveis à exposição prolongada à hipotermia; assim, a cirurgia deve ser realizada não apenas com precisão, mas também em poucos minutos. Do início ao fim, a cirurgia de infarto do miocárdio deve levar menos de 8 minutos. Recomendamos primeiro praticar em várias ninhadas do mesmo fundo que os camundongos experimentais até que a proficiência seja alcançada.
A progressão do reparo cardíaco pode ser avaliada usando ecocardiografia para medir a função cardíaca (ou seja, encurtamento fracionado, fração de ejeção, volume sistólica e diastólica) uma vez dentro de 3 a 7 dias após a cirurgia e novamente pouco antes de colher o coração , sugerido entre 21 e 28 dias após a lesão. Os corações podem ser coletados para limpeza em vários pontos de tempo após a cirurgia de infarto do miocárdio.
A etapa de compensação (etapa 2.17) está sujeita à variação de duração dependendo da idade e tensão do camundongo a partir do qual o coração foi colhido, o que pode resultar em diferenças no tamanho do coração. Para um mouse de fundo B6, a duração de compensação com base na idade é estimada da seguinte forma: P1 (7-10 dias), P7 (14-17 dias), P14 (21-24 dias), P21 (28-31 dias), P28 (35-38 dias). Embora o foco principal do nosso laboratório seja a limpeza do coração, nosso método passivo CLARITY tem sido bem sucedido para limpar pulmões de camundongos (resultados não publicados) e não prevemos nenhum limite para aplicar isso amplamente a outros órgãos. No geral, nosso processo de compensação acelerado é altamente valorizado pela capacidade de limpar tecidos de forma rápida e eficaz.
Deve-se notar que complicações podem surgir ao aplicar técnicas de limpeza de tecidos em órgãos com repórteres endógenos em subpopulações raras. O sinal do repórter em populações densas de células (como os miócitos23) parece ser mais resistente ao processo de compensação e, portanto, o sinal é normalmente retido; no entanto, outras populações celulares mais sensíveis (como nervos cardíacos) são propensas a ter sinal de proteína fluorescente endógeno extinto após fixação prolongada ou compensação. Isso se tornou evidente no Actl6bCre; O modelo de mouse repórter Rosa26tdT, onde os corações P7 fixados brevemente por 15 minutos mostraram forte sinal tdT(Figura 3A),no entanto, este sinal fluorescente foi extinto após a fixação por 1 hora ou durante a noite de incubação na Solução de Compensação (dados não mostrados). No cenário de sinal de repórter perdido, a coloração de anticorpos direcionada à proteína repórter é compatível com a limpeza de tecidos para amplificar o sinal(Figura 3). A adição de um passo de imunorotulagem pode ser vantajosa para tecidos submetidos a imagens extensivas, uma vez que os anticorpos conjugados são resistentes ao alvejante e produzem expressão estável e a longo prazo. Com a capacidade de rastrear proteínas endógenas e através da imunocoloração, nosso protocolo permite localização única de populações raras de células cardíacas que residem profundamente no coração.
Corações limpos podem passar por rastreamento de linhagem ou análise de expressão de proteína fluorescente usando microscopia confocal 3D de montagem total. O microscópio confocal é equipado com linhas de laser otimizadas para excitar repórteres florescentes (ou anticorpos secundários conjugados), por exemplo: BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555) e APC (Cy5, Alexa Fluor 647) a 405 nm, 488 nm, 561 nm e 683 nm, respectivamente. Para amostras de coração incapazes de caber em um slide dedepressão – comum se o coração colhido no pós-natal – um slide de depressão personalizado pode ser feito por impressão 3D em polipropileno. Slides personalizados seguiram as dimensões de um slide de depressão de microscópio (25 mm x 75 mm x 1 mm), variando a profundidade do poço para 6,5 mm ou 17 mm(Figura 4).
A fim de visualizar as linhas celulares do repórter em 3D, o microscópio confocal é definido para adquirir imagens empilhadas em z em todo o coração. Ao fotografar corações maiores, o coração inteiro pode não ser capaz de ser capturado em uma única imagem empilhada em z, mesmo com um objetivo de baixa ampliação. Neste cenário, uma série de múltiplas imagens empilhadas em z tiradas em diferentes regiões do coração podem ser costuradas usando uma grande função de imagem. Isso é feito calibrando o microscópio para a lente objetiva apropriada e especificando o campo para a grande área de varredura de imagem. Em seguida, as imagens empilhadas em z passam por reconstrução 3D usando um programa de renderização de volume e projeção de intensidade máxima(Figura 3). As imagens de alta resolução adquiridas podem ser analisadas para determinar a padronização precisa de células espaciais 3D de populações de células-alvo.
Coletivamente, este protocolo fornece uma poderosa ferramenta molecular para entender as mudanças celulares dinâmicas que ocorrem durante a reparação e regeneração cardíaca. Este método descreve os passos para induzir um infarto do miocárdio, realizar a limpeza de órgãos inteiros, rastrear populações específicas de células e analisar a padronização de células 3D. Juntas, essas técnicas proporcionam acesso a populações de células de rastreamento que antes eram inacessíveis devido à sua presença esparsa ou localização dentro do tecido. Isso permitirá uma investigação mais aprofundada das questões primordiais para o avanço das abordagens terapêuticas na medicina regenerativa, particularmente aquelas destinadas a estimular a regeneração endógena do coração.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O financiamento para este projeto foi fornecido pela UW School of Medicine and Public Health do Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), e um American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
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