Summary
انتشار القلب وخلايا القلب بعد الإصابة هي عملية ديناميكية تتطلب سيمفونية من الإشارات خارج الخلية من مجموعات الخلايا غير myocyte. باستخدام تتبع النسب ، والوضوح السلبي ، وتقنيات المجهر ثلاثي الأبعاد كامل جبل confocal ، يمكننا تحليل تأثير مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا على إصلاح القلب والتجدد.
Abstract
ويفوق عدد أمراض القلب والأوعية الدموية جميع أسباب الوفاة الأخرى، وهو مسؤول عن 31% من الوفيات المذهلة في جميع أنحاء العالم. يتجلى هذا المرض في الإصابة القلبية ، في المقام الأول في شكل احتشاء عضلة القلب الحاد. مع القليل من المرونة بعد الإصابة ، سيتم استبدال أنسجة القلب السليمة ذات مرة بأنسجة ندبة ليفية وغير منقدة وغالباً ما تكون مقدمة لفشل القلب. لتحديد خيارات العلاج الجديدة في الطب التجديدي ، ركزت الأبحاث على الفقاريات ذات القدرات التجديدية الفطرية. أحد هذه الكائنات النموذجية هو الفأر الوليدي ، الذي يستجيب لإصابة القلب بتجديد عضلة القلب القوي. من أجل الحث على إصابة في الفأر الوليدي ذات الصلة سريريا، قمنا بتطوير عملية جراحية لانسداد الشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD)، مما يعكس احتشاء عضلة القلب الناجم عن تصلب الشرايين في قلب الإنسان. عندما تتطابق مع التكنولوجيا لتتبع التغييرات على حد سواء داخل خلايا القلب والسكان غير myocyte، وهذا النموذج يوفر لنا منصة لتحديد الآليات التي توجه تجديد القلب. كان اكتساب نظرة ثاقبة في التغيرات في مجموعات خلايا القلب بعد الإصابة يعتمد بشكل كبير على طرق مثل تقسيم الأنسجة والفحص النسيجي ، والتي تقتصر على التحليل ثنائي الأبعاد وغالباً ما تتلف الأنسجة في هذه العملية. وعلاوة على ذلك، تفتقر هذه الأساليب إلى القدرة على تتبع التغيرات في أنساب الخلايا، وبدلاً من ذلك تقدم مجرد لقطة من استجابة الإصابة. هنا ، ونحن نصف كيف يمكن استخدام الأساليب المتقدمة تكنولوجيا في نماذج تتبع النسب ، وتطهير الجهاز كله ، والمجهر ثلاثي الأبعاد (3D) كامل جبل لتوضيح آليات إصلاح القلب. مع بروتوكول نا لجراحة احتشاء عضلة القلب الماوس الوليدي، وتطهير الأنسجة، وتصوير الجهاز كله 3D، يمكن كشف المسارات المعقدة التي تحفز انتشار عضلة القلب، والكشف عن أهداف علاجية جديدة لتجديد القلب.
Introduction
منذ فترة طويلة يعتبر القلب أن يكون جهاز ما بعد mitotic، ولكن الأدلة الأخيرة تثبت أن تجديد عضلة القلب يحدث في قلب الإنسان الكبار في حوالي 1٪ في السنة1. ومع ذلك، هذه المعدلات المنخفضة من دوران عضلة القلب غير كافية لتجديد فقدان هائلة من الأنسجة التي تحدث بعد الإصابة. القلب الذي عانى من احتشاء عضلة القلب سوف تفقد حوالي مليار عضلة القلب، وغالبا ما تكون بمثابة مقدمة لفشل القلب والموت القلبي المفاجئ2،3. مع أكثر من 26 مليون شخص يعانون من قصور القلب في جميع أنحاء العالم، هناك حاجة غير ملباة للعلاجات التي يمكن أن تعكس الأضرار الناجمة عن أمراض القلب4.
من أجل سد هذه الفجوة في العلاجات، بدأ العلماء التحقيق في الآليات المحفوظة تطوريا التي تكمن وراء التجديد الذاتي ة بعد الإصابة. نموذج واحد لدراسة تجديد القلب الثدييات هو الفأر الوليدي. في غضون الأسبوع التالي للولادة ، تتمتع الفئران الوليدية باستجابة تجديدية قوية بعد تلف القلب5. لقد أثبتنا سابقا أن الفئران حديثي الولادة يمكن تجديد قلوبهم عن طريق انتشار عضلة القلب بعد استئصال apical5. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن تثير تجديد القلب في الولدان، فإن الجراحة تفتقر إلى الصلة السريرية لإصابات القلب البشرية. من أجل تقليد إصابة بشرية في نموذج الفأر الوليدي ، قمنا بتطوير تقنية للحث على احتشاء عضلة القلب من خلال انسداد الشريان التاجي6. تتطلب هذه التقنية الربط الجراحي للشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD) ، وهو مسؤول عن توصيل 40٪ -50٪ من الدم إلى عضلة القلب البطينية اليسرى6،7. وبالتالي ، فإن الجراحة تؤدي إلى احتشاء يؤثر على جزء كبير من جدار البطين الأيسر. هذا الضرر الذي يلحق بعضلة القلب سيحفز انتشار عضلة القلب وتجديد القلب في الولدان5.
توفر جراحة انسداد الشريان التاجي طريقة مترجمة وقابلة للاستنساخ بشكل كبير للكشف عن الأعمال الداخلية لتجديد القلب. ويوازي جراحة حديثي الولادة تصلب الشرايين التاجية في قلب الإنسان، حيث تراكم البلاك داخل الجدران الداخلية للشرايين يمكن أن يسبب انسداد واحتشاء عضلة القلب اللاحقة8. بسبب الفراغ في العلاجات العلاجية لمرضى قصور القلب ، يرتبط الانسداد في LAD بمعدلات الوفيات التي تصل إلى 26٪ في غضون عام بعد الإصابة9، وبالتالي تم تسميته "صانع الأرملة". تتطلب التطورات في العلاجات نموذجًا يعكس بدقة الآثار الفسيولوجية والمرضية المعقدة لإصابة القلب. يوفر البروتوكول الجراحي لإصابة قلب الفأر الوليدية منصة تسمح للباحثين بالتحقيق في الإشارات الجزيئية والخلوية التي تشير إلى تجديد قلب الثدييات بعد الإصابة.
يسلط البحث الأخير الضوء على العلاقة الديناميكية بين البيئة خارج الخلية وخلايا القلب المنتشرة. على سبيل المثال ، يمكن تمديد نافذة التجدد بعد الولادة عن طريق تقليل صلابة المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالقلب10. المواد الحيوية من مصفوفة خارج الخلية الوليدية يمكن أيضا تعزيز تجديد القلب في قلوب الثدييات البالغة بعد إصابة القلب11. كما يرافق انتشار عضلة القلب هو استجابة أنجيوجينيك12،13؛ وقد تبين أن تكوين الشريان الجانبي الفريد من نوعه لقلب الفأر الوليدي التجدد ضروري لتحفيز تجديد القلب12. وعلاوة على ذلك، أثبت مختبرنا أن الإشارات العصبية تنظم انتشار عضلة القلب وتجديد القلب عن طريق تعديل مستويات عامل النمو، فضلا عن الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة14. هذه النتائج تؤكد على الحاجة إلى تتبع مجموعات الخلايا غير myocyte استجابة لإصابات القلب. من أجل تحقيق هذا الهدف، استفدنا من نظام إعادة تركيب Cre-lox في خطوط الفئران المعدلة وراثيا لدمج التعبير التأسيسي أو المشروط لبروتينات مراسل الفلورسنت لتتبع النسب. وعلاوة على ذلك، يمكننا استخدام أساليب متقدمة لتحديد نمط التوسع clonal مع خط الماوس قوس قزح، الذي يعتمد على التعبير العشوائي من المراسلين الفلورسنت تعتمد على Cre، متعددة الألوان لتحديد التوسع clonal من مجموعات الخلايا المستهدفة15. توظيف تتبع النسب مع جراحة انسداد الشريان التاجي الوليدي هو أداة قوية لتشريح الآليات الخلوية المعقدة لتجديد القلب.
من الصعب تتبع نسب الخلايا المسماة بالفلورسنت مع تصوير الأعضاء ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام تقنية الإخراج وإعادة البناء التقليدية - خاصة عندما تكون مجموعات الخلايا هشة ، مثل الألياف العصبية أو الأوعية الدموية. في حين أن التصوير المباشر الكامل للجهاز عن طريق الإخراج البصري يمكن التقاط مجموعات الخلايا السطحية ، فإن الهياكل التي توجد في عمق الأنسجة لا تزال غير قابلة للوصول. للتحايل على هذه الحواجز ، تم تطوير تقنيات إزالة الأنسجة للحد من غموض أنسجة الأعضاء بأكملها. في الآونة الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في مسح الدهون تبادل الأكريلاميد الهجين التصوير جامدة الأنسجة المتوافقة hYdrogel (وضوح) - الأساليب القائمة ، والتي واضحة الأنسجة الثابتة عن طريق استخراج الدهون16. كما يتم اتخاذ خطوات لتجانس مؤشر الانكسار وتقليل بعد ذلك تشتت الضوء أثناء التصوير17. واحدة من هذه الطريقة هي الوضوح النشط ، مما يسرع تحلل الدهون باستخدام الكهربية لاختراق المنظفات في جميع أنحاء الأنسجة18. على الرغم من فعالية، وهذا الأسلوب تطهير الأنسجة يتطلب معدات باهظة الثمن ويمكن أن يسبب تلف الأنسجة، مما يجعل النهج غير متوافق مع مجموعات الخلايا الهشة مثل الأعصاب القلبية19. وهكذا ، فإننا نستخدم نهج الوضوح السلبي ، الذي يعتمد على الحرارة لتسهيل اختراق المنظفات بلطف ، وبالتالي المساعدة في الاحتفاظ بهياكل الخلايا المعقدة20،21.
ويعتقد عادة الوضوح السلبي لتكون أقل كفاءة من الوضوح النشط18، كما يرافق هذه التقنية في كثير من الأحيان من قبل اثنين من العقبات الرئيسية : عدم القدرة على مسح عمق الجهاز بأكمله وكمية طويلة من الوقت اللازم لمسح أنسجة الكبار. يتغلب نهج الوضوح السلبي لدينا على كل من هذه الحواجز من خلال عملية تطهير سريعة قادرة على إزالة أنسجة القلب الوليدية والبالغين بشكل كامل. وقد وصلت تقنية إزالة الأنسجة السلبية CLARITY لدينا إلى الكفاءة التي تسمح بتصور مجموعة متنوعة من مجموعات خلايا القلب ، بما في ذلك مجموعات نادرة موزعة في جميع أنحاء قلب البالغين. عندما يتم تصوير القلب مسح مع المجهر المعالبؤر، يمكن إضاءة الهندسة المعمارية للنقش الخلايا محددة أثناء التنمية، والمرض، والتجدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا لدليل استخدام ورعاية الحيوانات المختبرية وامتثالا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب والصحة العامة في جامعة ويسكونسن ماديسون. تم تنفيذ جميع الأساليب على النوع البري C57BL/6J (B6) وخطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تم الحصول عليها من مختبرات جاكسون.
1. انسداد الشريان التاجي (احتشاء عضلة القلب) الناجمة عن طريق ربط الشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD) في الفئران حديثي الولادة 1-Day-old6
- فصل الجراء حديثي الولادة البالغ من العمر يوم واحد من الأم عن طريق وضعها في قفص نظيف جنبا إلى جنب مع بعض المواد التعشيش الأصلي.
- ضع نصف القفص على وسادة تدفئة على حرارة متوسطة. يجب أن تبقى الجراء على الجانب غير الساخن من القفص ، يتم وضعها فقط على الجانب الساخن بعد الجراحة.
- إنشاء منطقة جراحية معقمة تحت مجهر التشغيل. جمع المعدات الجراحية المعقمة(الجدول 1).
- قم بتنويم الجرو عن طريق انخفاض حرارة الجسم: لف الجرو في الشاش لتجنب ملامسة الجلد المباشر للجليد ودفنه في سرير جليدي لمدة 3-4 دقيقة تقريبًا. تحقق من انخفاض حرارة الفئران بشكل دوري عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم. الولدان يتسامحان مع انخفاض حرارة الجسم بشكل جيد، ومع ذلك، فإن التعرض المطول لانخفاض حرارة الجسم قد يؤدي إلى قضمة الصقيع والوفيات اللاحقة.
- مرة واحدة في esesthetized، وضع الماوس على المنطقة الجراحية في موقف supine، وتأمين الذراعين والساقين مع الشريط. قم بتعقيم المنطقة الجراحية للفأر ة بمحلول مطهر.
- تحديد موقع منطقة الصدر السفلي وجعل شق عرضي في الجلد مع مقص تشريح الصغيرة. لتوسيع الرؤية الجراحية للأضلاع، فصل الجلد عن العضلات عن طريق رفع الجلد بلطف مع زوج من ملقط خلع الملابس واضغط بلطف ضد العضلات بين الوبمعمع مع مقص صغير في موقف مغلق.
- تحديد موقع الفضاء بين الوكوستال الرابع(الشكل 1A)وجعل ثقب صغير سطحي باستخدام ملقط حادة، مع الحرص على عدم ثقب أي أعضاء داخلية. إجراء تشريح حاد عن طريق توسيع المنطقة بين العضلات بين الوب مع ملقط خلع الملابس. الموضع التشريحي السليم للشق ضروري للوصول المناسب إلى القلب.
- توجيه بلطف القلب من تجويف الصدر عن طريق وضع إصبع وتطبيق ضغط متزايد على الجانب الأيسر من البطن في حين عقد الفضاء بين الوكوستية مفتوحة مع ملقط خلع الملابس(الشكل 1B). بمجرد أن يكون القلب خارج الصدر ، قم بإزالة ملقط الملابس ، وتخفيف الضغط ، والسماح للقلب بالراحة على العضلات بين الوُرَك.
- تحديد موقع LAD كمنطقة من القلب يحتوي على دم أقل تجمعًا وهو في الموضع التشريحي الصحيح(الشكل 1C). يمكن رؤية LAD فقط تحت المجهر إذا تم الوصول إلى القلب في غضون بضع دقائق من بدء الجراحة.
- تنفيذ ربط LAD عن طريق خياطة LAD مع خياطة 6-0(الشكل 1D). التعادل عقدة مربعة مرتين للحث على احتشاء عضلة القلب(الشكل 1E). عمق خياطة في عضلة القلب قد تختلف، ومع ذلك، تحديد المواقع التشريحية المناسبة من الربط LAD أمر بالغ الأهمية لإعادة المستنسخة. عند ربط LAD ، يجب سحب الخياطة بإحكام ولكن بعناية حتى لا نقطع LAD. سيتم رؤية التبييض في قمة القلب على الفور(الشكل 1E)
- السماح للقلب أن تنزلق مرة أخرى إلى تجويف الصدر; ويمكن تسهيل هذه العملية بلطف مع ملقط خلع الملابس. خياطة الأضلاع جنبا إلى جنب مع عقدة الجراح تليها عقدة مربعة، وذلك باستخدام ملقط حادة لرفع المجموعة العليا من الأضلاع أثناء تمرير خياطة 6-0 من خلال المجموعة العليا والسفلى من الأضلاع.
- إزالة الشريط الذي كان يستخدم لتأمين الساقين الخلفيتين من الجرو.
- تلتصق يالجلد معا عن طريق وضع كمية صغيرة من الجلد الغراء على الجزء العلوي من البطن. ثم، والاستيلاء على الجلد من أسفل البطن مع ملقط غرامة وتغطي منطقة الصدر المكشوفة. الحد من كمية الغراء الزائد الذي لا يزال على الجراء، وهذا يمكن أن تزيد من احتمال الرفض وأكل لحوم البشر من قبل الأم.
- تسهيل الانتعاش فورا من التخدير عن طريق وضع الجرو على لوحة التدفئة تعيين إلى الحرارة المتوسطة. تبديل دوريا موضع الولدان لتدفئة بالتساوي في جميع أجزاء الجسم.
- السماح لحديثي الولادة بالبقاء مباشرة على وسادة التدفئة لمدة 10-15 دقيقة.
- تنظيف الدم المتبقية والغراء مع مسح الكحول.
- تغطية الروائح الأجنبية على حديثي الولادة عن طريق فرك الجسم كله مع الفراش من القفص الأصلي. ضع الجرو في القفص على الجانب الساخن بينما يتم إجراء عمليات جراحية أخرى.
- بمجرد الانتهاء من جميع العمليات الجراحية والجراء دافئة ومتنقلة، ونقل القمامة جنبا إلى جنب مع المواد التعشيش الأصلي إلى قفص الأم.
- راقب الفئران لمدة 30-60 دقيقة بعد الجراحة وراقب قبول الأم للجراء عن طريق التعشيش و / أو الاستمالة.
- تحقق على الفئران في صباح اليوم التالي للجراحة. إذا كانت الأم حزينة ولم تعشش الجراء ، ففكر في أم حاضنة للجراء.
2. تطهير قلب الماوس مع الوضوح السلبي21،22،23
- قم بتنويم الفأرة بـ"إيزوغلوران" قم بإجراء قرصة إصبع القدم لضمان أن الفأر ة مُسَسَّبة بالكامل.
- وضع الماوس على منطقة نظيفة والجراحية في موقف supine، وتأمين الذراعين والساقين مع الشريط.
- الحفاظ على الإيأووفلوران يُسَيّر على الفأرة باستخدام مخروط الأنف حتى يتم استخراج القلب.
- فتح أسفل الصدر عن طريق عقد الفراء فقط تحت عملية xiphoid مع ملقط الأنسجة وجعل شق تمتد عرض القفص الصدري باستخدام مقص تشريح كبير.
- قطع جنبا إلى جنب مع أجزاء من القفص الصدري مع مقص الجراحية.
- فضح العضلة الحجاب الحاجز من خلال استيعاب عملية xiphoid مع ملقط الأنسجة. فصل الحجاب الحاجز باستخدام ملقط المنحني.
- مع الحفاظ على فهم لعملية xiphoid ، اسحب الأنسجة بشكل قحفي حتى يمكن الوصول إلى القلب النابض.
- فهم القلب في القاعدة مع ملقط المنحني وتشريح القلب من تجويف الصدر عن طريق قطع الأورطا والوريد الوريد الكافا متفوقة مع مقص اإرديكتو.
- في حين أن القلب لا يزال ينبض، ضع القلب في طبق بيتري مليئة برنامج تلفزيوني بحيث يضخ القلب من الدم في الداخل كما أنه يحتفظ بالنبض. يمكن تأكيد احتشاء عضلة القلب عن طريق التحقق من أن وضع الخياطة في الموضع التشريحي المناسب لربط LAD.
- ضغط بلطف على القلب مع ملقط للسماح للقلب لطرد الدم المتبقي.
- نقل قلب الماوس إلى قارورة قذيفة زجاجية يمكن التخلص منها 2.5 مل مع 2 مل من PBS. غسل الدم المتبقي عن طريق احتضان القلب على شاكر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) عدة مرات. تغيير حل PBS في كل مرة حتى يبقى PBS واضحًا.
- تجاهل برنامج تلفزيوني وملء القارورة مع 2 مل من الباردة 4٪ paraformaldehyde (PFA). احتضان لمدة 4 ساعات في RT(الشكل 2A).
- بعد الحضانة، تخلص من PFA والقارورة مع 2 مل من PBS. غسل القلب على شاكر لمدة 10 دقائق في RT. كرر خطوة الغسيل مرتين، واستنزاف وملء القارورة مع برنامج تلفزيوني جديد في كل مرة لغسل تماما PFA الزائدة.
- تجاهل برنامج تلفزيوني وملء القارورة مع 2 مل من 4٪ أكريلاميد و 0.5٪ VA-044 الحل. احتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
- في اليوم التالي، قم بإجراء البلمرة عن طريق نقل القارورة إلى كتلة حرارية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- نقل القلب إلى قارورة قذيفة زجاجية جديدة وتكرار الخطوة 2.12 (دورة غسل PBS).
- تجاهل برنامج تلفزيوني وملء القارورة مع 2 مل من حل المقاصة(الجدول 2). احتضان في 37 درجة مئوية حتى يتم تطهير القلب. قم بتغيير الحل وإعادة تعبئته ابلي مع حل المقاصة الجديد كل 2-3 أيام. قد تستغرق عملية المقاصة عدة أسابيع(الشكل 2B-C).
ملاحظة: عادة ً ما تستغرق قلوب P1 حوالي 3-5 أيام، في حين أن قلوب P21 يمكن أن تستغرق ما يقرب من شهر قبل اكتمال حضانة حل المقاصة. - تجاهل برنامج تلفزيوني وملء القارورة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني وتكرار الخطوة 2.12 (دورة غسل PBS). إعادة ملء القارورة مع PBS الطازجة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- إذا تم إجراء تلطيخ المناعة، فتخطى الخطوات 2.21-2.22 وانتقل إلى القسم 3 للكشف عن المناعة. إذا كنت تعتمد فقط على الفلورسة الذاتية، فتابع الخطوات 2.21-2.22 وتخطي القسم 3.
- تجاهل برنامج تلفزيوني وتغيير الحل إلى حل مطابقة مؤشر الانكسار (RIMS)(الجدول 3). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- بعد الحضانة، يمكن تخزين الأنسجة الخالية في محلول RIMS في RT. قد تبدو الأنسجة بيضاء ومبهمة في المركز عند نقلها لأول مرة إلى RIMS. يجب أن تصبح الأنسجة شفافة بعد احتضانها في RIMS في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع(الشكل 2D).
3. اختياري: المناعة هيستوكيمياء تلطيخ قلب الفأر كامل جبل
- إزالة القلب مسح من حل RIMS ووضعها في قارورة زجاجية نظيفة 2.5 مل مع 2 مل من PBST (PBS مع 0.1٪ تريتون-X 100)
- غسل القلب في PBST 3 مرات على دوار مداري مع 30 حضانة دقيقة في RT.
- منع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة عن طريق غمر القلب في 2 مل من 20٪ حجب العازلة (مخففة في PBST) واحتضان مع التناوب لمدة 3 ساعات في RT. نقل إلى 4 درجة مئوية لوصمة عار مع التناوب بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يتم إجراء حظر المخزن المؤقت من المصل العادي مطابقة الأنواع التي أثيرت الأجسام المضادة الثانوية. - غسل القلب في PBST 3 مرات مع التناوب لمدة 5 دقيقة حضانة في RT.
- تزج القلب في الأجسام المضادة الأولية (المخفف في 2٪ حجب العازلة مع PBST) ومنع التعرض للضوء عن طريق التفاف قارورة الزجاج في رقائق الألومنيوم. احتضان مع التناوب بين عشية وضحاها في RT.
ملاحظة: من هذه النقطة إلى الأمام، يجب أن تستخدم رقائق الألومنيوم بشكل مستمر لحماية الثانوية من التعرض للضوء المحيط. - احتضان لمدة 24 ساعة إضافية مع دوران في 4 °C.
- بعد تلطيخ الأولية، كرر الخطوة 3.2 (دورة غسيل PBST طويلة) لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المنضمة من الأنسجة. تمديد غسل مع حضانة بين عشية وضحاها مع التناوب في RT.
- العمل في منطقة ذات إضاءة محدودة لمنع التعرض الثانوي للضوء الأجسام المضادة، تزج القلب في الأجسام المضادة الثانوية (المخفف في 2٪ حجب العازلة مع PBST) واحتضان مع التناوب لمدة 3 ساعات في RT. نقل إلى 4 درجة مئوية لوصمة عار مع التناوب بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، كرر الخطوة 3.2 (دورة غسيل PBST طويلة) لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المنضمة.
- استبدال الحل مع 2٪ حظر المخزن المؤقت (مخففة في PBST). إزالة الأجسام المضادة غير المنضمة المتبقية عن طريق الغسيل بين عشية وضحاها مع التناوب في RT.
- في اليوم التالي، تحقق من إزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة باستخدام المجهر المعالبؤر. قم بتمديد الغسيل حسب الحاجة، لتحل محل حل العازلة العازلة 2٪ يوميا. المضي قدما مرة واحدة قليلا إلى أي ثانوية غير محددة موجودة.
- تخزين القلب الملطخبالمناعة في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية.
- مباشرة قبل المجهر كامل جبل، احتضان القلب في حل RIMS بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تمديد الحضانة 24 ساعة إضافية إذا كان النسيج لا يزال غير مسح تماما.
- قم بتخزين القلب الملطخ بالمناعة والمناعي بالكامل في RIMS في RT.
4. تصور السكان غير myocyte في 3D مع التصوير المجهري كونكورس واحد الفوتون من قلب الماوس مسح
ملاحظة: إذا تم حصاد قلوب الماوس جنينياً، تابع القسم 4.1. بالنسبة لقلوب الفئران التي يتم حصادها بعد الولادة، تابع القسم 4.2.
- تصوير قلب الفأر الجنيني المنجلي
- ملء شريحة الاكتئاب المجهر مع حل برنامج تلفزيوني.
- التقط بعناية القلب مسح مع ملقط المنحني ووضع الأنسجة على الشريحة.
- قم بتركيب الشريحة بقسيمة غلاف زجاجية. يمكن الآن تصوير الأنسجة تحت المجهر البؤري.
- تصوير قلب الفأر بعد الولادة بعد الولادة
- ملء نصف غرفة الشريحة الاكتئاب مع حل PBS. من أجل إنشاء غرفة كبيرة بما يكفي لتناسب قلب الماوس الكبار ، تم وضع شريحة اكتئاب البولي بروبلين المطبوعة ثلاثية الأبعاد حسب الطلب(الشكل 4).
- التقاط بعناية القلب مسح مع ملقط المنحني ووضع الأنسجة في الغرفة. ملء حجم المتبقية من الغرفة مع برنامج تلفزيوني.
- ملء الغرفة مع برنامج تلفزيوني حتى سطح السائل يشكل قبة فوق الجزء العلوي من الغرفة. قم بتركيب شريحة الغطاء. يمكن الآن تصوير الأنسجة تحت مجهر بؤري منتصب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في كثير من الأحيان خطوتين الأكثر تحديا هي توجيه القلب للخروج من تجويف الصدر وligating LAD. لاستكشاف هذه الخطوات، قد يتم إجراء تعديلات في موضع الثقب الأولي بين العضلات بين الوكوستية الرابعة; إذا كان الثقب والتشريح الحاد قريبين جدًا من القص ، فقد لا يتمكن القلب من الخروج من تجويف الصدر(الشكل 1A).
بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى زيادة الضغط على البطن الأيسر لتسهيل هذه العملية(الشكل 1B). قد تحدث مضاعفات أيضا عند وضع القلب على العضلات بين الوب. وجدنا أن القلب سيبقى خارج التجويف دون الانسحاب عندما يتم الاحتفاظ بالتشريح غير الحاد إلى الحد الأدنى من الحجم وتنفيذه بشكل رئيسي في الاتجاه الأفقي. يسمح هذا التوجه أيضًا بالتصور الواضح وإمكانية الوصول إلى LAD(الشكل 1C).
عند وضع إبرة خياطة وراء LAD ، يقترح أن تخترق عمق الجدار الأمامي للبطين الأيسر ، حيث أن الربط السطحي يحتوي على مساحة أقل للتكيف في وضع الخياطة النهائي(الشكل 1D). يجب أن يتم ربط الخياطة حول LAD بحركات ثابتة وخاضعة للرقابة ، حيث أن LAD هش وقطع هذا الشريان التاجي والجدار الأمامي سيؤدي إلى الوفيات(الشكل 1E). في غضون 5-10 دقائق بعد اكتمال الجراحة ، يجب أن يكون الوليد مفعمًا بالحيوية والتنفس بشكل طبيعي.
عند الانتقال إلى بروتوكول CLARITY السلبي ، يجب حماية القلوب التي يتم حصادها من خط الماوس الذي يتضمن مراسلًا فلورسنتداخليًا لتتبع نسب الخلايا من الضوء(الشكل 2)، والذي يمكن تحقيقه عن طريق تغليف القارورة الزجاجية في رقائق الألومنيوم. أثناء خطوة المقاصة ، يكون احتضان الوقت في Clearing Solution متغيرًا اعتمادًا على عمر الماوس عندما يتم حصاد القلب. تكتمل هذه الخطوة عندما يكون النسيج بأكمله معتمًا باستمرار ، مع عدم وجود تلون في المركز(الشكل 2B-C). سوف تصبح قلوب شفافة على نحو متزايد بعد التخزين في حل RIMS في درجة حرارة الغرفة لبضعة أيام(الشكل 2D). تجدر الإشارة إلى أن توسيع الأنسجة قد يحدث أثناء عملية المقاصة.
يسمح بروتوكول CLARITY السلبي لدينا باختراق فعال للأجسام المضادة وبالتالي يتوافق مع طرق الكيمياء المناعية لتسمية البروتين (البروتينات) ذات الفائدة. وقد تم التحقق من صحة ذلك في Actl6bCre; Rosa26tdT الفئران المعدلة وراثيا، والتي تسمية الخلايا العصبية الناضجة مع tdTomato (tdT) بروتين المراسل. الأعصاب القلبية هي سطحية أساسا، مع بعض السكان المقيمين في طبقة epicardial، لذلك استخدمنا هذه الخلايا كدليل على نموذج رئيسي لإعادة إنتاج إشارة المراسل الذاتية(الشكل 3A)،فضلا عن الحفاظ على شكل البروتين مراسل قبل وبعد وضوح(الشكل 3B-C). نتائج ممثلنا من Actl6bكري; تظهر فئران Rosa26tdT أن إشارة بروتين tdT الذاتية التي شوهدت في الأعصاب من قلب P7 غير واضح تم تلخيصها بأمانة في الأعصاب من قلوب TdT المسماة P7 غير الواضحة والصافية(الشكل 3). إلى العصب tdT إيجابية منافية, وهو بروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) الأجسام المضادة الأولية (أرنب متعدد الكلونة; 1:200 تخفيف; تم استخدام روكلاند #600-401-379) جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 488 (متعدد الماعز؛ 1:1000 تخفيف؛ invitrogen #A-11008). لتصور مسح القلب بالعين أثناء خطوات المناعة والتصوير، يمكن استخدام مصباح يدوي فوق بنفسجي لفترة وجيزة لإلقاء الضوء على القلب.
الشكل 1: تحريض احتشاء عضلة القلب في الفأر الوليدي من خلال انسداد الشريان التاجي للشريان الأمامي الأيسر التنازلي (LAD). (أ)المساحة بين الوحدانية الرابعة، المشار لها بعلامة نجمية واحدة (*)، موجودة ويتم إجراء تشريح حاد. (ب)يتم تطبيق الضغط على البطن الأيسر لتوجيه القلب للخروج من تجويف الصدر. (ج)يتم تحديد LAD ، الذي يتميز بعلامة نجمية مزدوجة (**) ، على أنه الشريان السائد وعن طريق الوضع التشريحي. (D, E) ثم يتم تمرير خياطة خلف LAD وترتبط عقدة مربعة حول LAD للحث على انسداد الشريان التاجي والاحتشاء اللاحق. (E)بمجرد الانتهاء ، يمكن رؤية التبييض أسفل الخياطة ، في قمة القلب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تطور طريقة الوضوح السلبي على قلب الماوس P14. تم حصاد القلوب من فئران P14 ،(A)ثابتة ، و (B - D) خضعت لبروتوكول الوضوح السلبي. بالنسبة للقلوب التي تؤخذ في نقطة زمنية P14 ، فإن خطوة حضانة Clearing Solution هي (B) غير مكتملة عندما يكون اللون في وسط القلب واضحًا ، وينظر بعد 6 أيام ، و (C) عندما يظهر القلب معتمًا بالتساوي ، وينظر بعد 10 أيام. (د)بعد تخزين القلب في RIMS ، يتم مسح الأنسجة تمامًا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كامل جبل التصوير 3D من قلوب الماوس P7 مع المجهر كونكسورس. ممثل كامل جبل الصور 3D من P7 Actl6bكري؛ يتم عرض Rosa26tdT قلوب الفئران المعدلة وراثيا كإسقاطات كثافة قصوى من الصور z مكدسة. تم عرض قلوب لإظهار (أ)النّازج الذاتية tdTomato (tdT) الفلورية مباشرة بعد الحصاد (أحمر) (B) التلطيخ المناعي للأعصاب الإيجابية tdT في قلب غير واضح (أليكسا فلور 488؛ الأخضر) و (C) المناعة القابلة للاستنساخ من الأعصاب tdT إيجابية في قلب مسح (اليكسا فلور 488 ؛ الأخضر). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: 3D الشرائح الاكتئاب البولي بروبلين المطبوعة. لتصوير عينات القلب بعد الولادة، كانت شرائح الاكتئاب المخصصة مطبوعة ثلاثية الأبعاد على البولي بروبلين. أبعاد الشريحة هي 25 ملم × 75 ملم × 1 ملم ، مع انخفاض الشريحة جيدا 13 ملم في القطر وإما(A)6.5 ملم أو(B)17 ملم في العمق. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نوع المعدات | وصف | الشركه | رقم الكتالوج |
| قارورة زجاجية | 12 × 35mm قارورة مع كاب | العلامة التجارية لفيشر | 03-339-26A |
| 6-0 غرز البرين | غرز البولي بروبلين | أخلاقيات | 8889H |
| ملقط حادة | نصيحة جيدة، مستقيم، 4.25 في | سيغما-أدريش | Z168777 |
| خلع الملابس ملقط | تشريح، 4.5 في | العلامة التجارية لفيشر | 13-812-39 |
| حامل إبرة | مايو هيغار، 6 في | العلامة التجارية لفيشر | 08-966 |
| مقص تشريح صغير | 30 مم حافة القطع | شركة والتر ستيرن | 25870-002 |
| ملقط الأنسجة | الأنسجة المتوسطة، 1X2 الأسنان | إكسلتا | 16050133 |
| مقص تشريح كبير | مستقيم، 6 في | العلامة التجارية لفيشر | 08-951-20 |
| مقص ايريديكوتوم | 2 مم حافة القطع | أدوات العلوم الدقيقة | 15000-03 |
| ملقط منحنية | نصف منحني، مسنن، 4 في | إكسلتا | 16-050-146 |
الجدول 1: المعدات الجراحية.
| حل المقاصة | |||
| كاشف | النهائي | المبلغ | تلاحظ |
| كبريتات دوريسيل الصوديوم (SDS) | 8.0% ث/v | 40 جم | |
| حمض البوريك | 1.25% ث/v | 6.25 غرام | |
| 1-ثيوغليسيرول | 0.5% ث/v | 5 ميكرولتر/مل | تمت إضافته حسب الحاجة إلى الحل |
| أضف 400 مل من H20 فائقة النقاء إلى 1 لتر من الكأس. مزيج في SDS وحمض البوريك مع التحريك المغناطيسي. | |||
| ضبط درجة الحموضة إلى 8.5 باستخدام 6M NaOH. جلب حجم إلى 500 مل والأوتوكلاف. | |||
| تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة. | |||
| الكواشف الوضوح الأخرى | |||
| كاشف | النهائي | الاسهم | تلاحظ |
| PFA | 4.0% | 16% | مخففة في برنامج تلفزيوني |
| الأكريلاميد | 4.0% | 40% | مخففة في برنامج تلفزيوني |
| VA-044 | 0.5% | 10% | تمت إضافته حسب الحاجة إلى الحل |
الجدول 2: حل المقاصة والكواشف الوضوح الأخرى.
| كاشف | النهائي | المبلغ |
| مخزن الفوسفات المؤقت | 0.02 متر | 90 مل |
| هيستودنز | 133.3 في المائة ث/ر | 120 جم |
| أزيد الصوديوم | 0.05% ث/v | 45 ملغ |
| إضافة 90 مل من 0.02 M فوسفات المخزن المؤقت إلى 250 مل زجاجة زجاج الوسائط ملفوفة في رقائق الألومنيوم. | ||
| مزيج في الكواشف المدرجة مع التحريك المغناطيسي. السماح للمكونات لتذوب بين عشية وضحاها. | ||
| دوامة الحل وتنقية تصفية مع نظام الترشيح في زجاجة وسائط زجاجية معقمة 250 مل. | ||
| التفاف زجاجة في رقائق الألومنيوم وتخزين حل في درجة حرارة الغرفة. | ||
الجدول 3: حل مطابقة مؤشر الانكسار (RIMS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تفاعلات الخلية بين خلايا القلب والسكان غير myocyte هي عامل حاسم في ما إذا كان القلب سيخضع للتليف أو إصلاح بعد الإصابة. وقد تم إجراء اكتشافات تثبت أن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الأعصاب14،الخلايا epicardial24،الضامة الباسيمي25، الشرايين12،,13،والخلايا البديلية اللمفاوية26،وكلها تلعب دورا أساسيا في التوسط في إصلاح القلب.25 يمكن تتبع هذه الأنساب الخلية وغيرها من الاهتمامات وراثيا أثناء التنمية والمرض والتجدد من خلال تطبيق تقنيات Cre-lox و CRISPR-Cas9 في الفئران. عندما يقترن تطهير الجهاز وطرق المجهر المتقدمة، يمكن تقييم مساهمات السكان غير myocyte بدقة، وفتح الباب لتوضيح الأهداف الخلوية والجزيئية من تجديد عضلة القلب بعد الإصابة.
تعتمد كفاءة البروتوكول على ربط ثابت وقابل للاستنساخ للLAD أثناء جراحة انسداد الشريان التاجي. الفئران الوليدية حساسة للتعرض الموسع لانخفاض حرارة الجسم; وبالتالي ، يجب أن يتم إجراء الجراحة ليس فقط بدقة ولكن أيضًا في غضون دقائق. من البداية إلى النهاية ، يجب أن تستغرق جراحة احتشاء عضلة القلب أقل من 8 دقائق. نوصي أولا ً بممارسة العديد من القمامة من نفس خلفية الفئران التجريبية حتى يتم تحقيق الكفاءة.
يمكن تقييم تطور إصلاح القلب باستخدام تخطيط صدى القلب لقياس وظيفة القلب (أي تقصير كسور، كسر طرد، حجم انقباضي وانبساطي) مرة واحدة في غضون 3 إلى 7 أيام بعد الجراحة ومرة أخرى قبل وقت قصير من حصاد القلب ، واقترح ما بين 21- و 28 يوما بعد الإصابة. يمكن جمع القلوب للمقاصة في نقاط زمنية متعددة بعد جراحة احتشاء عضلة القلب.
تخضع خطوة المقاصة (الخطوة 2.17) للاختلاف في المدة اعتمادًا على عمر وسلالة الماوس الذي تم حصاد القلب منه ، مما قد يؤدي إلى اختلافات في حجم القلب. بالنسبة لفأرالخلفية B6، تُقدَّر مدة المقاصة على أساس العمر على النحو التالي: P1 (7-10 أيام)، P7 (14-17 يومًا)، P14 (21-24 يومًا)، P21 (28-31 يومًا)، P28 (35-38 يومًا). على الرغم من أن التركيز الأساسي لمعملنا هو تطهير القلب ، فقد كانت طريقة الوضوح السلبية ناجحة لتطهير رئتي الفئران (النتائج غير المنشورة) ولا نتوقع أي حد لتطبيق هذا على نطاق واسع على الأعضاء الأخرى. بشكل عام ، فإن عملية المقاصة المعجلة لدينا ذات قيمة عالية للقدرة على إزالة الأنسجة بسرعة وفعالية.
تجدر الإشارة إلى أن المضاعفات يمكن أن تنشأ عند تطبيق تقنيات إزالة الأنسجة في الأعضاء مع المراسلين الذاتية في الفئات الفرعية النادرة. إشارة المراسل في مجموعات الخلايا الكثيفة (مثل الخلايا الخلايا23)يبدو أن أكثر مقاومة لعملية المقاصة، وبالتالي يتم الاحتفاظ عادة إشارة; ومع ذلك، فإن مجموعات الخلايا الأخرى الأكثر حساسية (مثل الأعصاب القلبية) عرضة للإصابة بإشارة بروتين الفلورسنت الذاتية التي يتم إخمادها بعد التثبيت المطول أو المقاصة. هذا أصبح واضحا في Actl6bكري; Rosa26مراسل نموذج الماوس، حيث P7 قلوب ثابتة لفترة وجيزة لمدة 15 دقيقة أظهرت إشارة tdT قوية(الشكل 3A)،ولكن تم إخماد هذه الإشارة الفلورية بعد التثبيت لمدة 1 ساعة أو الحضانة بين عشية وضحاها في حل المقاصة (البيانات غير مبين). في سيناريو إشارة المراسل المفقودة ، يتوافق تلطيخ الأجسام المضادة التي تستهدف بروتين المراسل مع تطهير الأنسجة لتضخيم الإشارة(الشكل 3). يمكن أن تكون إضافة خطوة تسمية المناعة مفيدة للأنسجة التي تخضع للتصوير المكثف ، حيث أن الأجسام المضادة المترافقة مقاومة للتبييض وتنتج تعبيرًا مستقرًا وطويل الأجل. مع القدرة على تتبع البروتينات الذاتية ومن خلال التنيل المناعي، بروتوكولنا يسمح بشكل فريد لتوطين دقيق للمجموعات خلايا القلب النادرة التي تتواجد في أعماق القلب.
يمكن أن تخضع القلوب التي تم تطهيرها لتتبع النسب أو تحليل تعبير البروتين الفلوري باستخدام المجهر ثلاثي الأبعاد ثلاثي الأبعاد. وقد تم تجهيز المجهر البؤري مع خطوط الليزر الأمثل لإثارة المراسلين الفلوري (أو الأجسام المضادة الثانوية مترافق)، على سبيل المثال: BFP (DAPI، اليكسا فلور 405) ، EGFP (FITC ، اليكسا فلور 488) ، DsRed (TRITC ، اليكسا فلور 546/555) ، وAPC (Cy5 ، اليكسا فلور 647) في 405 نانومتر ، 488 نانومتر ، 561 نانومتر ، و 683 نانومتر ، على التوالي. لعينات القلب غير قادر على احتواء في شريحة الاكتئاب – شائعة إذا كان القلب حصادها بعد الولادة – يمكن إجراء شريحة الاكتئاب مخصصة عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد على البولي بروبلين. تتبع الشرائح المخصصة أبعاد شريحة اكتئاب المجهر (25 مم × 75 مم × 1 مم) ، وتختلف عمق البئر إلى إما 6.5 مم أو 17 مم(الشكل 4).
من أجل تصور خطوط خلية المراسل في 3D ، يتم تعيين المجهر البؤري للحصول على صور مكدسة z في جميع أنحاء القلب. عند تصوير قلوب أكبر، قد لا يتمكن القلب بأكمله من التقاطه في صورة واحدة مكدسة بـ z حتى مع هدف التكبير المنخفض. في هذا السيناريو، يمكن خياطة سلسلة من الصور المتعددة المكدسة z التي تم التقاطها في مناطق قلب مختلفة معًا باستخدام وظيفة صورة كبيرة. ويتم ذلك عن طريق معايرة المجهر إلى العدسة الموضوعية المناسبة وتحديد الحقل لمنطقة مسح الصور الكبيرة. ثم، صور z مكدسة الخضوع لإعادة الإعمار 3D باستخدام برنامج تقديم حجم وأقصى قدر من الكثافة الإسقاط(الشكل 3). يمكن تحليل الصور عالية الدقة التي تم الحصول عليها لتحديد أنماط الخلايا المكانية ثلاثية الأبعاد الدقيقة لتجمعات الخلايا المستهدفة.
يوفر هذا البروتوكول بشكل جماعي أداة جزيئية قوية لفهم التغيرات الخلوية الديناميكية التي تحدث أثناء إصلاح القلب وتجديده. تصف هذه الطريقة الخطوات للحث على احتشاء عضلة القلب ، وإجراء تطهير كامل للأعضاء ، وتتبع مجموعات محددة من الخلايا ، وتحليل نقش الخلايا ثلاثية الأبعاد. وتوفر هذه التقنيات مجتمعة إمكانية الوصول إلى مجموعات الخلايا النزرة التي كان من غير الممكن الوصول إليها من قبل بسبب وجودها أو موقعها المتناثر داخل الأنسجة. وهذا سيمكن من إجراء مزيد من التحقيق في الأسئلة ذات الأهمية القصوى لتعزيز النهج العلاجية في الطب التجديدي، ولا سيما تلك التي تهدف إلى تحفيز تجديد القلب الذاتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل كلية الطب والصحة العامة في جامعة ويسكونسن من برنامج الشراكة في ولاية ويسكونسن (A.I.M.)، وجائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية 19CDA34660169 (A.I.M. ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
- Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
- MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
- Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
- Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
- Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
- Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
- Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
- Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
- Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
- Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).
