Summary

クリアされた心臓3次元イメージングによる標的細胞集団の心臓損傷応答のキャプチャ

Published: March 17, 2020
doi:

Summary

心筋細胞増殖後の傷害は、非筋細胞集団からの細胞外の手がかりの交響を必要とする動的プロセスである。系統トレース、パッシブクラリティ、3次元全型共焦点顕微鏡技術を利用して、様々な細胞タイプが心臓修復および再生に及ぼす影響を分析することができます。

Abstract

心血管疾患は、他のすべての死因を上回り、世界中の死亡率の驚異的な31%を占めています。この疾患は、主に急性心筋梗塞の形で、心臓傷害に現れる。傷害後の回復力がほとんどなく、かつて健康な心臓組織は繊維状の非収縮性瘢痕組織に置き換えられ、しばしば心不全の前兆となる。再生医療における新しい治療法の選択肢を特定するために、研究は生来の再生能力を持つ脊椎動物に焦点を当てています。そのようなモデル生物の1つは新生児マウスであり、強い心筋再生で心臓損傷に反応する。臨床的に関連する新生児マウスの傷害を誘発するために、我々は、ヒト心臓のアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる心筋梗塞を反映して、左前下降動脈(LAD)を閉塞させる手術を開発した。心筋細胞と非筋細胞集団の両方の変化を追跡する技術と一致すると、このモデルは心臓再生を導くメカニズムを特定するプラットフォームを提供します。傷害後の心臓細胞集団の変化に関する洞察を得ることは、かつて組織切片や組織学的検査などの方法に大きく依存していました。さらに、これらの方法は、細胞系の変化を追跡する能力を欠き、代わりに傷害応答のスナップショットを提供するだけである。系統追跡モデル、全臓器のクリアリング、3次元(3D)全実装顕微鏡の技術的に高度な方法を用いて、心臓修復のメカニズムを解明する方法を説明する。新生児マウス心筋梗塞手術、組織クリアリング、3D全臓器イメージングのプロトコルにより、心筋細胞増殖を誘導する複雑な経路が解明され、心臓再生のための新しい治療標的が明らかになりました。

Introduction

心臓は長い間、マイトアティック後の器官であると考えられてきましたが、最近の証拠は、心筋細胞の再生が成人の人間の心臓で1年に約1%で起こることを示しています。しかし、これらの低い心筋細胞の回転率は、傷害後に起こる組織の大規模な損失を補充するには不十分である。心筋梗塞に苦しんでいる心臓は約10億個の心筋細胞を失い、しばしば心不全と突然の心臓死の前兆として22,33を果たします。世界中で2,600万人以上の人々が心不全の影響を受けているので、心臓病4によって引き起こされた損害を取り消すことができる治療のための満たされていない必要性があります。

治療におけるこのギャップを埋めるために、科学者たちは、傷害後の内因性再生の根源である進化的に保存されたメカニズムの調査を開始しました。哺乳類の心臓再生を研究するための1つのモデルは、新生児マウスである。生後1週間以内に、新生児マウスは心臓損傷5に続く強い再生応答を有する。我々は以前、新生児マウスが心尖部切除5に続く心筋細胞増殖を介して心臓を再生できることを実証した。この技術は新生児の心臓再生を呼び起こす可能性があるが、手術は人間の心臓傷害との臨床的関連性を欠いている。新生児マウスモデルにおける人的傷害を模倣するために、冠状動脈閉塞6を通して心筋梗塞を誘発する技術を開発した。この技術は、左心室心筋6,7に血液の40%〜50%を送達する役割を果たす左前下降下動脈(LAD)の外科的結紮を必要とする7。したがって、手術は左心室壁のかなりの部分に影響を与える梗塞をもたらす。心筋へのこの損傷は、新生児における心筋細胞増殖および心臓再生を刺激する5.

冠状動脈閉塞手術は、心臓再生の内部の働きを明らかにするために、非常に再現性の高い、直接翻訳方法を提供します。新生児手術は、ヒト心臓における冠動脈アテローム性動脈硬化症と平行して、動脈の内壁内にプラークが蓄積すると閉塞とその後の心筋梗塞8を引き起こす可能性がある。心不全患者の治療治療の空隙のために、LADの閉塞は傷害9後1年以内に最大26%に達する死亡率に関連しており、その結果、「未亡人メーカー」と呼ばれています。治療の進歩には、心臓損傷の複雑な生理学的および病理学的影響を正確に反映するモデルが必要です。新生児マウス心臓損傷のための当社の外科プロトコルは、研究者が損傷後に哺乳類の心臓再生を知らせる分子および細胞の手がかりを調査することを可能にするプラットフォームを提供します。

最近の研究では、細胞外環境と増殖型心筋細胞との動的関係が明示されています。例えば、心部10を取り巻く細胞外マトリックスの剛性を減少させることにより、出生後回生期の窓を延長することができる。新生児細胞外マトリックスからの生体材料はまた、心臓損傷11に続く成人哺乳類の心臓における心臓再生を促進することができる。また、心筋細胞増殖に伴う血管形成応答12,13;12,新生児マウスの再生心臓に特有の副動脈形成は、心臓再生12を刺激するために不可欠であることが示された。さらに、我々の研究室は神経シグナル伝達が成長因子レベルの変調を介して心筋細胞増殖および心臓再生を調節することを実証した。これらの知見は、心臓損傷に応答して非筋細胞集団を追跡する必要性を強調している。この目的を達成するために、トランスジェニックマウスラインにおけるCre-lox組換えシステムを利用して、系統トレースのための蛍光レポータータンパク質の構成的または条件的な発現を組み込んでいます。さらに、高度な方法を用いて、Cre依存型の多色蛍光レポーターの確率的発現に依存するレインボーマウスラインを用いてクローン拡張パターンを決定し、標的細胞集団15のクローン拡張を決定することができる。新生児冠動脈閉塞手術で系統トレースを採用することは、心臓再生の複雑な細胞機構を解剖するための強力なツールです。

3次元(3D)の臓器全画像を用いて蛍光標識細胞の系統を追跡することは、特に神経線維や血管などの細胞集団が壊れやすい場合に、従来の断面化と再構成技術を用いて達成することは困難である。光学断面による臓器の直接全実装イメージングは表面的な細胞集団を捕捉することができるが、組織の奥深くに存在する構造はアクセスできないままである。これらの障壁を回避するために、組織クリア技術は、臓器組織全体の不透明度を低減するために開発されています。近年、脂質抽出16を介して固定組織をクリアする透明脂質交換アクリルアミドハイブリジッドリジッドイメージング適合組織hYdrogel(CLARITY)ベースの方法に大きな進歩がなされている。また、屈折率を均質化し、その後、撮像しながら光散乱を低減するステップも取られる。そのような方法の1つは活性なCLARITYであり、電気泳動を用いて組織18全体に洗浄剤を浸透させることによって脂質分解を促進する。効果的であるが、この組織の清算方法は高価な機器を必要とし、組織損傷を引き起こす可能性があり、心臓神経19のような脆弱な細胞集団との相容れないアプローチを作る。したがって、我々は穏やかに洗剤の浸透を促進するために熱に依存する受動的なCLARITYアプローチを採用し、したがって、複雑な細胞構造20、21,21の保持を支援する。

受動クラリティは、通常、アクティブなCLARITY18よりも効率が悪いと考えられていますが、この技術には、臓器の深さ全体をクリアできないことと、成人組織をクリアするために必要な膨大な時間という2つの大きな障害がしばしば伴います。私たちの受動的なCLARITYアプローチは、新生児および成人心臓組織を完全にクリアすることができる迅速な清算プロセスでこれらの障壁の両方を克服する。当社の受動的なCLARITY組織クリアリング技術は、成人心臓全体に分布する稀な集団を含む様々な心臓細胞集団の可視化を可能にする効率に達した。クリアされた心臓を共焦点顕微鏡で画像化すると、発達中、疾患、再生中の細胞特異的パターニングのアーキテクチャを照らすことができます。

Protocol

実験はすべて、実験動物の使用とケアのためのガイドに従って、ウィスコンシン大学マディソン校医学公衆衛生学部の施設動物のケアと使用委員会に従って行われました。すべての方法は、野生型C57BL/ 6J(B6)およびジャクソン研究所から得られたトランスジェニックマウスラインで行われました。 1. 1日齢の新生児マウスにおける左前前下方動脈(LAD)の結紮により誘発された…

Representative Results

多くの場合、2つの最も困難なステップは、胸腔から心臓を導き出し、LADを結び付けることです。これらの手順をトラブルシューティングするために、第 4 肋間筋肉間の最初の穿刺の配置に調整が加えられることがあります。穿刺と鈍い解剖が胸骨に近すぎると、心臓が胸腔から出ることができない場合があります(図1A)。 さらに、この?…

Discussion

心筋細胞と非筋細胞集団との細胞間相互作用は、心臓が線維症を受けるか、損傷後に修復するかの決定要因である。神経14、心外膜細胞,24、腹膜マクロファージ1425、動脈12、13、リンパ管内皮細胞26、およびリンパ管内皮細胞26を含む様々な細胞タイプが、すべて心臓修復を媒介する上で不可欠な…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロジェクトの資金は、ウィスコンシン州パートナーシッププログラム(A.I.M.)からUW医学公衆衛生大学院と米国心臓協会キャリア開発賞19CDA34660169(A.I.M.)によって提供されました。

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures Ethicon 8889H Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps Excelta 16-050-146 Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps Fisherbrand 13-812-39 Dissecting, 4.5 in
Glass Vial Fisherbrand 03-339-26A 12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz Sigma-Aldrich Density gradient medium
Iridectomy Scissors Fine Science Tools 15000-03 2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors Fisherbrand 08-951-20 Straight, 6 in
Needle Holder Fisherbrand 08-966 Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps Sigma-Adrich Z168777 Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor Walter Stern Inc 25870-002 30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps Excelta 16050133 Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044 Wako Chemicals Water-soluble azo initiator

References

  1. Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
  2. Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
  3. Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
  4. Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
  7. Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
  8. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  9. MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
  10. Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
  11. Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
  12. Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
  13. Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
  14. Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
  15. Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
  16. Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  17. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  18. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  19. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
  20. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
  21. Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
  22. Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
  23. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
  24. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  25. Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  26. Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).

Play Video

Cite This Article
Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60482, doi:10.3791/60482 (2020).

View Video