Summary
La prolifération cardiomyocyte suivant la blessure est un processus dynamique qui exige une symphonie des repères extracellulaires des populations de cellules non-myocytes. En utilisant le traçage de la lignée, le CLARITY passif et les techniques de microscopie confocale à monture entière en trois dimensions, nous pouvons analyser l’influence d’une variété de types de cellules sur la réparation cardiaque et la régénération.
Abstract
Les maladies cardiovasculaires surclassent toutes les autres causes de décès et sont responsables d’un nombre stupéfiant de 31 % des mortalités dans le monde. Cette maladie se manifeste dans les dommages cardiaques, principalement sous la forme d’une infarctus aigu du myocarde. Avec peu de résilience suite à une blessure, le tissu cardiaque une fois en bonne santé sera remplacé par du tissu cicatriciel fibreux et non contractuel et souvent un prélude à l’insuffisance cardiaque. Pour identifier de nouvelles options de traitement en médecine régénérative, la recherche s’est concentrée sur les vertébrés avec des capacités régénératrices innées. Un tel organisme modèle est la souris néonatale, qui répond aux dommages cardiaques avec la régénération myocardique robuste. Afin d’induire une blessure dans la souris néonatale qui est cliniquement pertinente, nous avons développé une chirurgie pour occlude l’artère descendante antérieure gauche (LAD), reflétant une infarctus du myocarde déclenchée par l’athérosclérose dans le coeur humain. Lorsqu’il est jumelé à la technologie pour suivre les changements à la fois au sein des populations cardiomyocytes et non-myocytes, ce modèle nous fournit une plate-forme pour identifier les mécanismes qui guident la régénération cardiaque. L’amélioration des changements dans les populations de cellules cardiaques à la suite d’une blessure reposait autrefois fortement sur des méthodes telles que la section tissulaire et l’examen histologique, qui sont limitées à l’analyse bidimensionnelle et endommagent souvent le tissu dans le processus. En outre, ces méthodes n’ont pas la capacité de retracer les changements dans les lignées cellulaires, au lieu de fournir simplement un instantané de la réponse aux blessures. Ici, nous décrivons comment les méthodes technologiquement avancées dans les modèles de traçage de lignée, le dégagement entier d’organe, et la microscopie entière tridimensionnelle (3D) de montage entier peuvent être employées pour élucider des mécanismes de réparation cardiaque. Avec notre protocole pour la chirurgie néonatale d’infarctus du myocarde de souris, le dégagement de tissu, et la formation image entière d’organe de 3D, les voies complexes qui induisent la prolifération cardiomyocyte peuvent être démêlées, révélant de nouvelles cibles thérapeutiques pour la régénération cardiaque.
Introduction
Le cœur a longtemps été considéré comme un organe post-mitotic, mais des preuves récentes démontrent que le renouvellement cardiomyocyte se produit dans le cœur humain adulte à environ 1% par an1. Cependant, ces faibles taux de rotation de cardiomyocyte sont insuffisants pour reconstituer la perte massive de tissu qui se produit après des dommages. Un cœur qui a subi une infarctus du myocarde perdra environ un milliard de cardiomyocytes, servant souvent de prélude à l’insuffisance cardiaque et la mort cardiaque soudaine2,3. Avec plus de 26 millions de personnes touchées par l’insuffisance cardiaque dans le monde, il ya un besoin non satisfait de thérapies qui peuvent inverser les dommages infligés par la maladie cardiaque4.
Afin de combler cette lacune dans la thérapeutique, les scientifiques ont commencé à étudier les mécanismes évolutivement conservés qui sous-tendent la régénération endogène après des dommages. Un modèle pour étudier la régénération cardiaque des mammifères est la souris néonatale. Dans la semaine qui suit la naissance, les souris néonatales ont une réponse régénératrice robuste suite à des dommages cardiaques5. Nous avons déjà démontré que les souris néonatales peuvent régénérer leur cœur par la prolifération cardiomyocyte suite à une résection apique5. Bien que cette technique puisse évoquer la régénération cardiaque dans les nouveau-nés, la chirurgie manque de pertinence clinique aux dommages cardiaques humains. Afin d’imiter une blessure humaine dans le modèle néonatal de souris, nous avons développé une technique pour induire une infarctus du myocarde par une occlusion coronaire6. Cette technique nécessite la ligature chirurgicale de l’artère descendante antérieure gauche (LAD), qui est responsable de la livraison de 40%-50% du sang au myocarde ventriculaire gauche6,7. Ainsi, la chirurgie entraîne une infarctus qui affecte une partie significative de la paroi ventriculaire gauche. Ces dommages au myocarde stimuleront la prolifération cardiomyocyte et la régénération cardiaque dans les nouveau-nés5.
La chirurgie d’occlusion de l’artère coronaire fournit une méthode hautement reproductible et directement translationnelle pour découvrir le fonctionnement interne de la régénération cardiaque. La chirurgie néonatale parallèle à l’athérosclérose de l’artère coronaire dans le cœur humain, où l’accumulation de la plaque dans les parois intérieures des artères peut causer une occlusion et l’infarctus du myocarde suivant8. En raison d’un vide dans les traitements thérapeutiques pour les patients souffrant d’insuffisance cardiaque, une occlusion dans le LAD est associée à des taux de mortalité atteignant jusqu’à 26% dans l’année suivant la blessure9, et par conséquent a été appelé le «fabricant de veuves». Les progrès de la thérapeutique exigent un modèle qui reflète fidèlement les effets physiologiques et pathologiques complexes des lésions cardiaques. Notre protocole chirurgical pour les lésions cardiaques néonatales de souris fournit une plate-forme qui permet aux chercheurs d’étudier les indices moléculaires et cellulaires qui signalent la régénération de coeur de mammifères après la blessure.
Des recherches récentes mettent en évidence la relation dynamique entre l’environnement extracellulaire et la prolifération des cardiomyocytes. Par exemple, la fenêtre régénératrice postnatale peut être prolongée en diminuant la rigidité de la matrice extracellulaire entourant le cœur10. Les biomatériaux de la matrice extracellulaire néonatale peuvent également favoriser la régénération cardiaque dans les cœurs de mammifères adultes à la suite d’une blessure cardiaque11. La prolifération cardiomyocyte accompagne également une réponse angiogénique12,13; la formation d’artère collatérale unique au coeur régénérant de la souris néonatale s’est avérée essentielle pour stimuler la régénération cardiaque12. En outre, notre laboratoire a démontré que la signalisation nerveuse régule la prolifération cardiomyocyte et la régénération cardiaque par modulation des niveaux de facteur de croissance, ainsi que la réponse inflammatoire après la blessure14. Ces résultats soulignent la nécessité de retracer les populations de cellules non myocytes en réponse aux dommages cardiaques. Afin d’atteindre cet objectif, nous avons profité du système de recombinaison Cre-lox dans les lignées de souris transgéniques pour incorporer l’expression constitutive ou conditionnelle des protéines de journaliste fluorescent pour le traçage de la lignée. En outre, nous pouvons utiliser des méthodes avancées pour déterminer le modèle d’expansion clonale avec la ligne de souris Rainbow, qui s’appuie sur l’expression stochastique des cre-dépendants, multi-couleurs des journalistes fluorescents pour déterminer l’expansion clonale des populations cellulaires ciblées15. L’utilisation de la traçabilité de lignée avec la chirurgie néonatale d’occlusion d’artère coronaire est un outil puissant pour disséquer les mécanismes cellulaires complexes de la régénération cardiaque.
Il est difficile de suivre la lignée des cellules étiquetées fluorescentes à l’imagerie d’organes entiers tridimensionnelles (3D) en utilisant la technique traditionnelle de sectionnement et de reconstruction, en particulier lorsque les populations cellulaires sont fragiles, comme les fibres nerveuses ou les vaisseaux sanguins. Tandis que l’imagerie complète directe de l’organe par section optique peut capturer des populations superficielles de cellules, les structures qui résident profondément dans le tissu restent inaccessibles. Pour contourner ces barrières, des techniques de compensation tissulaire ont été développées pour réduire l’opacité des tissus d’organes entiers. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés pour effacer les méthodes compatibles acrylamide-hybridées d’imagerie rigide compatibles à l’imagerie par les lipides, les méthodes basées sur le tissu hYdrogel (CLARITY), qui effacent les tissus fixes par extraction lipidique16. Des mesures sont également prises pour homogénéiser l’indice réfractivant et réduire par la suite la diffusion de la lumière lors de l’imagerie17. Une telle méthode est active CLARITY, qui accélère la décomposition des lipides en utilisant l’électrophorèse pour pénétrer le détergent dans tout le tissu18. Bien qu’efficace, cette méthode de compensation tissulaire nécessite un équipement coûteux et peut causer des lésions tissulaires, ce qui rend l’approche incompatible avec les populations cellulaires fragiles telles que les nerfs cardiaques19. Ainsi, nous utilisons l’approche passive CLARITY, qui repose sur la chaleur pour faciliter doucement la pénétration du détergent, contribuant ainsi à la rétention des structures cellulaires complexes20,21.
La CLARITY passive est généralement considérée comme moins efficace que LA CLARITY18active, car la technique est souvent accompagnée de deux obstacles majeurs : l’incapacité à effacer toute la profondeur de l’organe et la quantité considérable de temps nécessaire pour effacer les tissus adultes. Notre approche passive CLARITY surmonte ces deux barrières grâce à un processus de compensation accéléré capable de nettoyer complètement les tissus cardiaques néonatals et adultes. Notre technique passive de compensation des tissus CLARITY a atteint une efficacité qui permet la visualisation d’une variété de populations de cellules cardiaques, y compris les populations rares réparties dans tout le cœur adulte. Lorsque le cœur dégagé est photographié avec la microscopie confocale, l’architecture des motifs spécifiques aux cellules pendant le développement, la maladie et la régénération peut être éclairée.
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Protocol
Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide pour l’utilisation et les soins des animaux de laboratoire et conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’École de médecine et de santé publique de l’Université du Wisconsin-Madison. Toutes les méthodes ont été effectuées sur le type sauvage C57BL/6J (B6) et les lignées de souris transgéniques obtenues auprès des laboratoires Jackson.
1. Occlusion coronaire (Infarctus du myocarde) induite par la Ligation de l’artère descendante antérieure gauche (LAD) chez les souris néonatales de 1-Day-Old6
- Séparez les chiots néonatals d’un jour de la mère en les plaçant dans une cage propre avec une partie du matériel de nidification d’origine.
- Placer la moitié de la cage sur un coussin chauffant à feu moyen. Les chiots doivent rester sur le côté non chauffé de la cage, seulement être placés sur le côté chauffé après la chirurgie.
- Créez une zone chirurgicale stérile sous un microscope opératoire. Recueillir de l’équipement chirurgical stérilisé(tableau 1).
- Anesthésiez le chiot par hypothermie : enveloppez le chiot dans de la gaze pour éviter un contact direct avec la glace et enterrez-le dans un lit de glace pendant environ 3 à 4 min. Vérifiez périodiquement l’hypothermie des souris en effectuant une pincée d’orteil. Les nouveau-nés tolèrent bien l’hypothermie, cependant, l’exposition prolongée à l’hypothermie peut avoir comme conséquence des engelures et la mortalité suivante.
- Une fois anesthésié, placez la souris sur la zone chirurgicale en position de supine, en fixant les bras et les jambes avec du ruban adhésif. Stériliser la zone chirurgicale de la souris avec une solution antiseptique.
- Localiser la région inférieure de la poitrine et faire une incision transversale dans la peau avec de petits ciseaux disséquants. Pour élargir la vue chirurgicale des côtes, séparer la peau du muscle en soulevant doucement la peau avec une paire de forceps de pansement et appuyez doucement contre les muscles intercostal avec les petits ciseaux en position fermée.
- Localisez le quatrième espace intercostal(figure 1A) et faites une petite ponction superficielle à l’aide de forceps pointus, en prenant soin de ne pas perforer les organes internes. Effectuez une dissection émoussée en élargissant la zone entre les muscles intercostal avec des forceps de pansement. Un bon positionnement anatomique de l’incision est essentiel pour un accès approprié au cœur.
- Guidez doucement le cœur hors de la cavité thoracique en plaçant un doigt et en appliquant une pression croissante sur le côté gauche de l’abdomen tout en maintenant l’espace intercostal ouvert avec des forceps d’habillage(figure 1B). Une fois que le cœur est à l’extérieur de la poitrine, retirez les forceps de pansement, soulagez la pression et laissez le cœur reposer sur les muscles intercostalaux.
- Localiser le LAD comme la zone du cœur qui a moins de sang commun et est dans la position anatomique correcte (figure 1C). Le LAD ne peut être vu sous le microscope que si le cœur est accessible dans les quelques minutes suivant le début de la chirurgie.
- Effectuez la ligature LAD en suturant le LAD avec une suture 6-0(figure 1D). Attachez un noeud carré deux fois pour induire l’infarctus du myocarde (figure 1E). La profondeur de la suture dans le myocarde peut varier, cependant, le positionnement anatomique approprié de la ligature LAD est crucial pour la reproductibilité. Lors de la ligature de la LAD, la suture doit être tirée étroitement, mais soigneusement afin de ne pas couper le LAD. Blanchir au sommet du cœur sera vu immédiatement (Figure 1E)
- Laisser le cœur se repepre à la cavité thoracique; ce processus peut être doucement facilité avec des forceps de pansement. Suture les côtes avec le noeud d’un chirurgien suivi d’un noeud carré, en utilisant des forceps émoussés pour soulever l’ensemble supérieur des côtes tout en passant une suture 6-0 à travers l’ensemble supérieur et inférieur des côtes.
- Retirez la bande qui a été utilisée pour fixer les pattes postérieures du chiot.
- Adhérez la peau ensemble en plaçant une petite quantité de colle de peau sur le haut de l’abdomen. Ensuite, saisissez la peau du bas-ventre avec de fines forceps et couvrez la région thoracique exposée. Limitez la quantité d’excès de colle qui reste sur les chiots, car cela peut augmenter la probabilité de rejet et de cannibalisme par la mère.
- Faciliter immédiatement la récupération de l’anesthésie en plaçant le chiot sur un coussin chauffant réglé à feu moyen. Passez périodiquement le placement des nouveau-nés pour réchauffer uniformément toutes les parties du corps.
- Laisser le nouveau-né rester directement sur la plaque chauffante pendant 10 à 15 min. En règle générale, le mouvement est rétabli dans les 5 minutes suivant sa mise à feu.
- Nettoyez le sang résiduel et la colle avec une lingette d’alcool.
- Couvrez les parfums étrangers sur les nouveau-nés en frottant tout le corps avec la literie de la cage d’origine. Placez le chiot dans la cage sur le côté chauffé pendant que d’autres chirurgies sont effectuées.
- Une fois toutes les chirurgies terminées et les chiots chauds et mobiles, transférez la litière avec le matériel de nidification d’origine dans la cage de la mère.
- Surveillez les souris pendant 30-60 min après la chirurgie et surveillez l’acceptation des chiots par la mère en niche et/ou en toilettage.
- Vérifiez les souris le matin suivant la chirurgie. Si la mère est en détresse et n’a pas imbriqué les chiots, considérez une mère adoptive pour les chiots.
2. Effacer le cœur de la souris avec LA CLARTÉ passive21,22,23
- Anesthésiez la souris avec l’isoflurane. Effectuez une pincée d’ateil pour s’assurer que la souris est entièrement sous sédatif.
- Placez la souris sur une zone propre et chirurgicale en position de supine, en fixant les bras et les jambes avec du ruban adhésif.
- Maintenir la sédation de l’isoflurane sur la souris à l’aide d’un cône nasal jusqu’à ce que le cœur soit extrait.
- Ouvrez la poitrine inférieure en tenant la fourrure juste en dessous du processus xiphoid avec des forceps de tissu et faire une incision couvrant la largeur de la cage thoracique utilisant les grands ciseaux disséquants.
- Couper à côté des parties distales de la cage thoracique avec des ciseaux chirurgicaux.
- Exposez le muscle du diaphragme en saisissant le processus xiphoïde avec des forceps de tissu. Détachez le diaphragme à l’aide de forceps incurvés.
- Tout en maintenant une compréhension du processus xiphoïde, tirez le tissu cranially jusqu’à ce que le cœur battant est accessible.
- Saisissez le cœur à la base avec des forceps incurvés et disséquez le cœur de la cavité thoracique en coupant l’aorte et le cava supérieur avec des ciseaux d’iridectomy.
- Alors que le cœur bat encore, placez le cœur dans un plat Petri rempli de PBS de sorte que le cœur pompe le sang à l’intérieur comme il ne cesse de battre. L’infarctus du myocarde peut être confirmé en vérifiant que le placement de la suture est dans la position anatomique appropriée pour la ligature DE LAD.
- Serrez doucement le cœur avec des forceps pour permettre au cœur d’expulser le sang résiduel.
- Transférer le cœur de la souris dans une fiole en verre jetable de 2,5 ml avec 2 ml de PBS. Laver le sang résiduel en incuber le cœur sur un shaker pendant 10 minutes à température ambiante (RT) à plusieurs reprises. Modifier la solution PBS à chaque fois jusqu’à ce que PBS reste clair.
- Jetez le PBS et remplissez la fiole de 2 ml de paraformaldéhyde froid de 4 % (PFA). Incuber pendant 4 heures à RT (figure 2A).
- Après l’incubation, jetez la PFA et la fiole avec 2 ml de PBS. Laver le cœur sur un shaker pendant 10 min à RT. Répétez l’étape de lavage deux fois, vidange et remplissage de la fiole avec nouveau PBS à chaque fois pour laver complètement l’excès de PFA.
- Jetez PBS et remplissez la fiole avec 2 ml d’acrylamide de 4 % et 0,5 % de solution VA-044. Incuber pendant la nuit à 4 oC.
- Le lendemain, effectuer la polymérisation en transférant la fiole à un bloc de chaleur fixé à 37 oC pendant 3 heures.
- Transférer le cœur dans une nouvelle fiole de coquille de verre et répéter l’étape 2.12 (cycle de lavage PBS).
- Jetez PBS et remplissez la fiole de 2 ml de solution de compensation(tableau 2). Incuber à 37 oC jusqu’à ce que le cœur soit dégagé. Changez la solution et remplissez-le avec une solution de compensation fraîche tous les 2 à 3 jours. Le processus de compensation pourrait prendre jusqu’à plusieurs semaines(figure 2B-C).
REMARQUE : Les cœurs P1 prennent généralement environ 3 à 5 jours, tandis que les cœurs P21 peuvent prendre près d’un mois avant que l’incubation de la solution de compensation soit terminée. - Jetez PBS et remplissez la fiole de 2 ml de PBS et répétez l’étape 2.12 (cycle de lavage PBS). Remplissez le flacon avec PBS frais et incuber toute la nuit à 37 oC.
- Si l’immunostaining sera effectué, sautez les étapes 2.21-2.22 et passez à la section 3 pour l’immunostaining. Si vous vous fiez uniquement à la fluorescence endogène, passez les étapes 2.21-2.22 et sautez la section 3.
- Jetez PBS et modifiez la solution en solution de correspondance des indices réfractifs (RIMS) (tableau 3). Incuber pendant la nuit à 37 oC.
- Après l’incubation, le tissu défriché peut être stocké dans la solution RIMS à RT. Tissu peut sembler blanc et opaque dans le centre lors de la première modification dans RIMS; les tissus doivent devenir transparents après avoir été incubés dans les RIMS à température ambiante pendant plusieurs semaines(figure 2D).
3. Optionnel : Immunohistochimie Staining of the Whole-Mount Mouse Heart
- Retirez le cœur dégagé de la solution RIMS et placez-le dans un flacon de verre propre de 2,5 ml avec 2 ml de PBST (PBS avec 0,1 % De Triton-X 100)
- Laver le cœur dans PBST 3 fois sur un rotateur orbital avec des incubations de 30 min à RT.
- Bloquer la fixation d’anticorps non spécifique en plongeant le cœur dans 2 ml de tampon de blocage de 20 % (dilué dans PBST) et incuber avec rotation pendant 3 heures à RT. Transférer à 4 oC pour tacher avec rotation pendant la nuit.
REMARQUE : Le tampon de blocage est fabriqué à partir du sérum normal correspondant à l’espèce dans laquelle l’anticorps secondaire a été soulevé. - Laver le cœur dans PBST 3 fois avec rotation pour 5 min incubations à RT.
- Plongez le cœur dans l’anticorps primaire (dilué dans un tampon de blocage de 2 % avec PBST) et évitez l’exposition à la lumière en enveloppant la fiole de verre dans du papier d’aluminium. Incuber avec rotation pendant la nuit à RT.
REMARQUE : À partir de ce point, le papier d’aluminium doit être utilisé en permanence pour protéger le secondaire contre l’exposition à la lumière ambiante. - Incuber pendant 24 heures supplémentaires avec rotation à 4 oC.
- Après la coloration primaire, répétez l’étape 3.2 (long cycle de lavage PBST) pour enlever l’anticorps primaire non lié du tissu. Étendre le lavage avec une incubation de nuit avec rotation à RT.
- Travailler dans une zone avec un éclairage limité pour prévenir l’exposition secondaire à la lumière des anticorps, immerger le cœur dans des anticorps secondaires (dilué dans un tampon de blocage de 2 % avec PBST) et incuber avec rotation pendant 3 heures à RT. Transférer à 4 oC pour tacher avec rotation pendant la nuit.
- Le lendemain, répétez l’étape 3.2 (long cycle de lavage PBST) pour enlever les anticorps secondaires non liés.
- Remplacez la solution par un tampon de blocage de 2 % (dilué dans PBST). Enlever les anticorps résiduels non liés en lavant toute la nuit avec rotation à RT.
- Le lendemain, vérifiez que l’excédent d’anticorps secondaire a été enlevé à l’aide de microscopie confocienne. Étendre le lavage au besoin, en remplaçant quotidiennement la solution tampon de blocage de 2 %. Procéder une fois peu ou pas de secondaire non spécifique est présent.
- Rangez le cœur immunostendié dans PBS à 4 oC.
- Directement avant la microscopie à monture entière, incuber le cœur dans la solution RIMS pendant la nuit à 37 oC. Prolonger l’incubation de 24 heures supplémentaires si le tissu n’est toujours pas entièrement effacé.
- Conservez le cœur entièrement dégagé et immunostendié dans RIMS à RT.
4. Visualiser les populations non myocytes en 3D avec l’imagerie à microscopie confoque mono-photon du cœur de souris effacée
REMARQUE : Si les cœurs de souris sont récoltés embryonnairement, continuez avec la section 4.1. Pour les cœurs de souris récoltés par voie postnatale, continuer avec la section 4.2.
- Imagerie du cœur de souris embryonnaire effacé
- Remplissez la glissière de dépression de microscope avec la solution PBS.
- Ramassez soigneusement le cœur dégagé avec des forceps incurvés et placez le tissu sur la glissière.
- Monter la glissière avec un coverlip en verre. Le tissu peut maintenant être photographié sous un microscope confocal.
- Imagerie du cœur postnatal de souris effacé
- Remplissez la moitié de la chambre de la diapositive de dépression avec la solution PBS. Afin de créer une chambre assez grande pour s’adapter à un cœur de souris adulte, une diapositive de dépression en polypropylène imprimée en 3D a été faite sur mesure(figure 4).
- Ramassez soigneusement le cœur dégagé avec des forceps incurvés et placez le tissu dans la chambre. Remplissez le volume restant de la chambre avec PBS.
- Remplissez la chambre de PBS de sorte que la surface du liquide forme un dôme au-dessus du haut de la chambre. Monter la glissière de couverture. Le tissu peut maintenant être photographié sous un microscope confocal droit.
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Representative Results
Souvent, les deux étapes les plus difficiles guident le cœur hors de la cavité thoracique et ligatant le LAD. Pour dépanner ces étapes, des ajustements peuvent être apportés au placement de la ponction initiale entre les quatrièmes muscles intercostal; si la ponction et la dissection émoussée sont trop proches du sternum, le cœur peut ne pas être en mesure de sortir de la cavité thoracique(figure 1A).
En outre, une pression accrue sur l’abdomen gauche peut être nécessaire pour faciliter ce processus (figure 1B). Des complications peuvent également se produire lors du repos du cœur sur les muscles intercostals. Nous avons constaté que le cœur restera en dehors de la cavité sans se retirer lorsque la dissection émoussée est maintenue à une taille minimale et effectuée principalement dans la direction horizontale. Cette orientation permet également une visualisation et une accessibilité claires au LAD(figure 1C).
Lors de la mise de l’aiguille de suture derrière le LAD, il est suggéré de pénétrer profondément dans la paroi antérieure du ventricule gauche, comme une ligature superficielle a moins de place pour l’ajustement dans le placement final de suture (figure 1D). Lier la suture autour de la LAD doit être effectuée avec des mouvements contrôlés et réguliers, car le LAD est fragile et la rupture de cette artère coronaire et la paroi antérieure causera la mortalité(figure 1E). Dans les 5 à 10 minutes suivant la fin de la chirurgie, le nouveau-né doit être vif et respirer normalement.
Lorsque vous passez au protocole transparent passif, les cœurs récoltés à partir d’une lignée de souris qui intègre un reporter fluorescent endogène pour le traçage de lignée cellulaire doivent être protégés de la lumière(figure 2), qui peut être accomplie en enveloppant la fiole de verre dans du papier d’aluminium. Pendant l’étape de compensation, le temps d’incubation dans la solution de compensation est variable en fonction de l’âge de la souris lorsque le cœur a été récolté. Cette étape est complète lorsque le tissu entier est toujours opaque, sans décoloration au centre(figure 2B-C). Les cœurs deviendront de plus en plus transparents après le stockage dans la solution RIMS à température ambiante pendant quelques jours(figure 2D). Il convient de noter que l’expansion des tissus peut se produire pendant le processus de compensation.
Notre protocole passif CLARITY permet une pénétration efficace des anticorps et est donc compatible avec les méthodes d’immunohistochimie pour étiqueter les protéines(s) d’intérêt. Ceci a été validé dans Actl6bCre; Rosa26tdT souris transgéniques, qui étiquetent les neurones matures avec la protéine de journaliste de tdTomato (tdT). Les nerfs cardiaques sont principalement superficiels, avec quelques populations résidant dans la couche épicardiale, donc nous avons utilisé cette population cellulaire comme un modèle de preuve de principal pour la reproductibilité du signal journaliste endogène(figure 3A), ainsi que la préservation de la conformation protéique journaliste avant et après CLARITY (Figure 3B-C). Nos résultats représentatifs d’Actl6bCre; Les sourisde TdT de Rosa26 montrent que le signal endogène de protéine de tdT vu dans les nerfs d’un coeur P7 peu clair a été fidèlement récapitulé dans les nerfs des coeurs p7 immunolabeled tdT peu clairs et dégagés(figure 3). Aux nerfs tdT-positifs d’immunolabel, un anticorps primaire de protéine fluorescente rouge (RFP) (polyclonal de lapin ; 1:200 dilution ; Rockland #600-401-379) a été utilisé avec un anticorps secondaire Alexa Fluor 488 (polyclonal de chèvre; 1:1000 dilution; Invitrogen #A-11008). Pour visualiser le cœur dégagé par l’œil pendant les étapes d’immunostaining et d’imagerie, une lampe de poche ultraviolette peut être brièvement utilisée pour éclairer le cœur.
Figure 1 : Induction de l’infarctus du myocarde dans la souris néonatale par l’occlusion d’artère coronaire de l’artère descendante antérieure gauche (LAD). (A) Le quatrième espace intercostal, indiqué par un seul astérisque ( ) est situé et une dissection émoussée est effectuée. (B) La pression est appliquée sur l’abdomen gauche pour guider le cœur hors de la cavité thoracique. (C) Le LAD, marqué par un double astérisque, est identifié comme étant l’artère prédominante et par la position anatomique. (D, E) Une suture est ensuite passée derrière le LAD et un noeud carré est attaché autour du LAD pour induire une occlusion coronaire et infarctus ultérieur. (E) Une fois terminé, le blanchiment peut être vu sous la suture, au sommet du cœur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Progression de la méthode CLARITY passive sur un Cœur de souris P14. Les cœurs ont été récoltés à partir de souris P14, (A) fixe, et (B-D) a subi le protocole passif CLARITY. Pour les cœurs pris à un point d’heure P14, l’étape d’incubation de la solution de compensation est (B) incomplète lorsque la décoloration au centre du cœur est apparente, vu après 6 jours, et (C) complet lorsque le cœur apparaît uniformément opaque, vu après 10 jours. (D) Après que le cœur est stocké dans RIMS, le tissu est complètement effacé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Imagerie 3D à monture entière des cœurs de souris P7 avec microscopie confocale. Images 3D représentatives de P7 Actl6bCre; Rosa26tdT souris transgéniques cœurs sont montrés comme projections d’intensité maximale des images z-empilés. Les cœurs ont été photographiés pour montrer (A) la fluorescence endogène de tdTomato (tdT) directement après la récolte (rouge) (B) immunostaining des nerfs tdT-positifs dans un coeur clair (Alexa Fluor 488; vert) et (C) immunolabeling reproductible des nerfs tdT-positifs dans un coeur effacé (Alexa Fluor 488; vert). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Diapositives de dépression en polypropylène imprimés 3D. Pour imaginer les échantillons postnatals de coeur, les diapositives personnalisées de dépression ont été imprimées en 3D sur du polypropylène. Les dimensions de la glissière sont de 25 mm x 75 mm x 1 mm, avec une dépression de glissement bien de 13 mm de diamètre et soit (A) 6,5 mm ou (B) 17 mm de profondeur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Type d’équipement | Description | Société | Numéro de catalogue |
| Flacon de verre | 12 x 35mm Vial avec cap | Fisherbrand (Fisherbrand) | 03-339-26A |
| 6-0 Sutures Prolene | Sutures de polypropylène | Ethicon | 8889H |
| Forceps pointus | Fine Tip, droit, 4.25 en | Sigma-Adrich | Z168777 |
| Forceps d’habillage | Disséquer, 4.5 en | Fisherbrand (Fisherbrand) | 13-812-39 |
| Porte-aiguille | Mayo-Hegar, 6 en | Fisherbrand (Fisherbrand) | 08-966 |
| Petit ciseau disséquant | 30 mm Cutting Edge | Walter Stern inc. | 25870-002 |
| Forceps tissulaires | Tissu moyen, 1X2 Dents | Excelta Excelta | 16050133 |
| Grands ciseaux disséquants | Droit, 6 en | Fisherbrand (Fisherbrand) | 08-951-20 |
| Ciseaux Iridectomy | 2 mm Cutting Edge | Outils de haute science | 15000-03 |
| Forceps courbés | Mi-courbé, Serrated, 4 en | Excelta Excelta | 16-050-146 |
Tableau 1 : Équipement chirurgical.
| Solution de compensation | |||
| Réactif | Final | Montant | Notes |
| Sulfate de dodéthyle de sodium (SDS) | 8,0% w/v | 40 g | |
| Acide borique | 1,25% w/v | 6,25 g | |
| 1-thioglycerol | 0,5% w/v | 5 L/mL | Ajouté au besoin pour trouver une solution |
| Ajouter 400 ml de bec ultrapure H20 à 1 L. Incorporer le SDS et l’acide borique à l’agitation magnétique. | |||
| Ajuster le pH à 8,5 à l’aide de 6M NaOH. Porter le volume à 500 ml et Autoclave. | |||
| Conserver la solution à température ambiante. | |||
| Autres réactifs CLARITY | |||
| Réactif | Final | Stock | Notes |
| PFA (PFA) | 4.0% | 16% | Dilué dans PBS |
| Acrylamide | 4.0% | 40% | Dilué dans PBS |
| VA-044 | 0.5% | 10% | Ajouté au besoin pour trouver une solution |
Tableau 2 : Solution de compensation et autres réactifs CLARITY.
| Réactif | Final | Montant |
| Tampon de phosphate | 0,02 M | 90 ml |
| Histodenz Histodenz | 133,3% w/v | 120 g |
| Sodium Azide | 0,05% w/v | 45 mg |
| Ajouter 90 ml de tampon de phosphate de 0,02 M à une bouteille de support en verre de 250 ml enveloppée dans du papier d’aluminium. | ||
| Incorporer les réactifs énumérés avec une agitation magnétique. Laisser les composants se dissoudre pendant la nuit. | ||
| Solution Vortex et filtrer purifient avec un système de filtration dans une bouteille stérile de 250 ml de support en verre. | ||
| Envelopper la bouteille dans du papier d’aluminium et entreposer la solution à température ambiante. | ||
Tableau 3 : Solution de correspondance des indices réfractaires (RIMS).
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Discussion
Les interactions cellulaires entre les cardiomyocytes et les populations non myocytes sont un facteur déterminant de la question de savoir si le cœur subira la fibrose ou la réparation après une blessure. Des découvertes ont été faites démontrant qu’une variété de types de cellules, y compris les nerfs14, les cellules épicardiales24, macrophages péritonéaux25, artérioles12,13, et les cellules endothéliales lymphatiques26, tous jouent un rôle essentiel dans la médiation de la réparation cardiaque. Ces lignées cellulaires et d’autres d’intérêt peuvent être génétiquement tracées pendant le développement, la maladie, et la régénération en appliquant des technologies Cre-lox et CRISPR-Cas9 chez la souris. Lorsqu’elles sont associées à l’effacement des organes et aux méthodes avancées de microscopie, les contributions des populations non myocytes peuvent être évaluées avec précision, ouvrant la porte à élucider les cibles cellulaires et moléculaires de la régénération myocardique à la suite d’une blessure.
L’efficacité du protocole dépend de la ligature cohérente et reproductible du LAD pendant la chirurgie d’occlusion d’artère coronaire. Les souris néonatales sont sensibles à une exposition prolongée à l’hypothermie; ainsi, la chirurgie doit non seulement être effectuée avec précision, mais aussi en quelques minutes. Du début à la fin, la chirurgie d’infarctus du myocarde devrait prendre moins de 8 minutes. Nous recommandons d’abord la pratique sur plusieurs portées du même fond que les souris expérimentales jusqu’à ce que la compétence soit atteinte.
La progression de la réparation cardiaque peut être évaluée en utilisant l’échocardiographie pour mesurer la fonction cardiaque (c.-à-d. raccourcissement fractionnel, fractionnement d’éjection, volume systolique et diastolique) une fois dans les 3 à 7 jours après la chirurgie et encore peu de temps avant la récolte du cœur , suggéré entre 21 et 28 jours après une blessure. Les coeurs peuvent être collectés pour le dégagement à plusieurs temps après chirurgie d’infarctus du myocarde.
L’étape de dégagement (étape 2.17) est sujette à une variation de durée en fonction de l’âge et de la souche de la souris à partir de laquelle le cœur a été récolté, ce qui peut entraîner des différences de taille cardiaque. Pour une souris de fond B6, la durée de compensation en fonction de l’âge est estimée comme suit : P1 (7-10 jours), P7 (14-17 jours), P14 (21-24 jours), P21 (28-31 jours), P28 (35-38 jours). Bien que l’objectif principal de notre laboratoire est le nettoyage cardiaque, notre méthode passive CLARITY a réussi à effacer les poumons des souris (résultats non publiés) et nous prévoyons aucune limite sur l’application générale de ce à d’autres organes. Dans l’ensemble, notre processus de compensation accélérée est très apprécié pour la capacité de nettoyer les tissus rapidement et efficacement.
Il convient de noter que des complications peuvent survenir lors de l’application de techniques de compensation tissulaire dans les organes avec des journalistes endogènes dans les sous-populations rares. Le signal de reporter dans les populations denses de cellules (comme les myocytes23) semblent être plus résistants au processus de compensation et ainsi le signal est généralement conservé ; cependant, d’autres populations cellulaires plus sensibles (comme les nerfs cardiaques) sont sujettes à avoir le signal de protéine fluorescente endogène éteint après fixation prolongée ou dégagement. Cela est devenu évident dans l’Actl6bCre; Rosa26tdT modèle de souris journaliste, où les cœurs P7 fixé brièvement pendant 15 minutes a montré le signal TdT fort(figure 3A), mais ce signal fluorescent a été éteint après fixation pendant 1 heure ou pendant la nuit incubation dans la solution de compensation (données non montrées). Dans le scénario d’un signal de reporter perdu, la coloration des anticorps ciblant la protéine reporter est compatible avec le nettoyage des tissus pour amplifier le signal(figure 3). L’ajout d’une étape d’immunolabeling peut être avantageux pour les tissus subissant une imagerie étendue, car les anticorps conjugués sont résistants à l’eau de Javel et produisent une expression stable et à long terme. Avec la capacité de suivre les protéines endogènement et par immunostaining, notre protocole permet de manière unique la localisation précise des populations rares de cellules cardiaques qui résident profondément dans le cœur.
Les cœurs défrichés peuvent subir un traçage de la lignée ou une analyse d’expression fluorescente à l’aide d’une microscopie confocale 3D à monture entière. Le microscope confocal est équipé de lignes laser optimisées pour exciter les reporters fluorescents (ou anticorps secondaires conjugués), par exemple : BFP (DAPI, Alexa Fluor 405), EGFP (FITC, Alexa Fluor 488), DsRed (TRITC, Alexa Fluor 546/555), et APC (Cy5, Alexa Fluor 647) à 405 nm, 488 nm, 561 nm, et 683 nm, respectivement. Pour les échantillons de cœur incapables de s’adapter dans une glissière de dépression - commune si le cœur récolté par voie postnatale - une diapositive de dépression personnalisée peut être faite par impression 3D sur polypropylène. Des diapositives personnalisées ont suivi les dimensions d’une glissière de dépression au microscope (25 mm x 75 mm x 1 mm), variant la profondeur du puits à 6,5 mm ou 17 mm(figure 4).
Afin de visualiser les lignées cellulaires des reporters en 3D, le microscope confocal est mis à acquérir des images z-empilées dans tout le cœur. Lors de l’imagerie de plus grands cœurs, le cœur entier peut ne pas être en mesure d’être capturé dans une seule image z-empilés, même avec un objectif de grossissement faible. Dans ce scénario, une série de plusieurs images z-empilées prises à différentes régions de cœur peuvent être cousues ensemble à l’aide d’une grande fonction d’image. Ceci est accompli en étalonnant le microscope à la lentille objective appropriée et en spécifiant le champ pour la grande zone de balayage d’image. Ensuite, les images empilées z subissent une reconstruction 3D à l’aide d’un programme de rendu de volume et d’une projection d’intensité maximale(figure 3). Les images à haute résolution acquises peuvent être analysées pour déterminer le modelage précis des cellules spatiales 3D des populations cellulaires ciblées.
Collectivement, ce protocole fournit un outil moléculaire puissant pour comprendre les changements cellulaires dynamiques qui se produisent pendant la réparation cardiaque et la régénération. Cette méthode décrit les étapes pour induire une infarctus du myocarde, effectuer le dégagement entier d’organe, tracer des populations spécifiques de cellules, et analyser le modèle 3D de cellules. Ensemble, ces techniques donnent accès à des populations de cellules traces qui étaient auparavant inaccessibles en raison de leur présence ou de leur emplacement clairsemés dans le tissu. Cela permettra une étude plus approfondie des questions primordiales pour faire progresser les approches thérapeutiques en médecine régénérative, en particulier celles visant à stimuler la régénération du cœur endogène.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Le financement de ce projet a été fourni par l’UW School of Medicine and Public Health du Wisconsin Partnership Program (A.I.M.) et un American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-thioglycerol | |||
| 6-0 Prolene Sutures | Ethicon | 8889H | Polypropylene Sutures |
| Acrylamide | |||
| Boric acid | |||
| Curved Forceps | Excelta | 16-050-146 | Half Curved, Serrated, 4 in |
| Dressing Forceps | Fisherbrand | 13-812-39 | Dissecting, 4.5 in |
| Glass Vial | Fisherbrand | 03-339-26A | 12 x 35 mm Vial with Cap |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | Density gradient medium | |
| Iridectomy Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2 mm Cutting Edge |
| Large Dissecting Scissors | Fisherbrand | 08-951-20 | Straight, 6 in |
| Needle Holder | Fisherbrand | 08-966 | Mayo-Hegar, 6 in |
| Paraformaldehyde | |||
| Phosphate Buffer | |||
| Sharp Forceps | Sigma-Adrich | Z168777 | Fine Tip, Straight, 4.25 in |
| Small Dissecting Scissor | Walter Stern Inc | 25870-002 | 30 mm Cutting Edge |
| Sodium Azide | |||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | |||
| Tissue Forceps | Excelta | 16050133 | Medium Tissue, 1X2 Teeth |
| VA-044 | Wako Chemicals | Water-soluble azo initiator |
References
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