Summary

Het vastleggen van de cardiale letselrespons van gerichte celpopulaties via Cleared Heart Driedimensionale beeldvorming

Published: March 17, 2020
doi:

Summary

Cardiomyocyte proliferatie na letsel is een dynamisch proces dat een symfonie van extracellulaire signalen van niet-myocyte celpopulaties vereist. Met behulp van afstamming strekken, passieve helderheid, en drie-dimensionale whole-mount confocale microscopie technieken, kunnen we analyseren de invloed van een verscheidenheid van celtypes op cardiale reparatie en regeneratie.

Abstract

Hart- en vaatziekten overtreft alle andere doodsoorzaken en is verantwoordelijk voor maar liefst 31% van de sterfgevallen wereldwijd. Deze ziekte manifesteert zich bij hartletsel, voornamelijk in de vorm van een acuut hartinfarct. Met weinig veerkracht na letsel, zal het eens gezonde hartweefsel worden vervangen door vezelig, niet-contractiele littekenweefsel en vaak een prelude op hartfalen. Om nieuwe behandelingsopties in regeneratieve geneeskunde te identificeren, heeft het onderzoek zich gericht op gewervelde dieren met aangeboren regeneratieve mogelijkheden. Een dergelijk model organisme is de neonatale muis, die reageert op hartletsel met robuuste myocardiale regeneratie. Om een verwonding bij de neonatale muis te veroorzaken die klinisch relevant is, hebben we een operatie ontwikkeld om de linker voorste dalende slagader (LAD) te oconeren, waarbij een hartinfarct wordt weerspiegeld dat wordt veroorzaakt door atherosclerose in het menselijk hart. Wanneer gekoppeld aan de technologie om veranderingen bij te houden, zowel binnen cardiomyocyten als niet-myocytenpopulaties, biedt dit model ons een platform om de mechanismen te identificeren die hartregeneratie begeleiden. Het verkrijgen van inzicht in veranderingen in hartcelpopulaties na letsel eenkeer zwaar vertrouwd op methoden zoals weefselsectie en histologisch onderzoek, die beperkt zijn tot tweedimensionale analyse en vaak schade aan het weefsel in het proces. Bovendien missen deze methoden de mogelijkheid om veranderingen in cellijnen te traceren, in plaats daarvan bieden ze slechts een momentopname van de blessurerespons. Hier beschrijven we hoe technologisch geavanceerde methoden in lineage tracing modellen, hele orgaan clearing, en drie-dimensionale (3D) whole-mount microscopie kan worden gebruikt om mechanismen van cardiale reparatie op te helderen. Met ons protocol voor neonatale muis myocardiale infarct chirurgie, weefsel clearing, en 3D hele orgaan beeldvorming, de complexe trajecten die cardiomyocyte proliferatie induceren kan worden ontrafeld, onthullen nieuwe therapeutische doelen voor hartregeneratie.

Introduction

Het hart is al lang beschouwd als een post-mitotisch orgaan, maar recent bewijs toont aan dat cardiomyocyte vernieuwing optreedt in het volwassen menselijk hart op ongeveer 1% per jaar1. Echter, deze lage tarieven van cardiomyocyte omzet zijn onvoldoende om het enorme verlies van weefsel dat optreedt na letsel aan te vullen. Een hart dat heeft geleden een hartinfarct zal verliezen ongeveer een miljard cardiomyocyten, vaak dienen als een prelude op hartfalen en plotselinge hartdood2,3. Met meer dan 26 miljoen mensen getroffen door hartfalen wereldwijd, is er een onvervulde behoefte aan therapieën die de schade toegebracht door hart-en vaatziekten kan keren4.

Om deze kloof in de therapieën te overbruggen, zijn wetenschappers begonnen met het onderzoeken van evolutionair geconserveerde mechanismen die ten grondslag liggen aan endogene regeneratie na letsel. Een model voor het bestuderen van zoogdier hartregeneratie is de neonatale muis. Binnen de week na de geboorte hebben neonatale muizen een robuuste regeneratieve respons na hartschade5. We hebben eerder aangetoond dat neonatale muizen hun hart kunnen regenereren via cardiomyocyte proliferatie na een apicale resectie5. Hoewel deze techniek hartregeneratie in de neonaten kan oproepen, mist de operatie klinische relevantie voor menselijke hartletsels. Om een menselijk letsel in het neonatale muismodel na te bootsen, hebben we een techniek ontwikkeld om een hartinfarct te veroorzaken door middel van een coronaire slagader occlusie6. Deze techniek vereist chirurgische ligatie van de linker voorste dalende slagader (LAD), die verantwoordelijk is voor het leveren van 40%-50% van het bloed aan de linker ventriculaire myocardium6,7. Zo resulteert de operatie in een infarct dat een aanzienlijk deel van de linker ventriculaire wand beïnvloedt. Deze schade aan het myocardium zal cardiomyocyteproliferatie en hartregeneratie bij neonaten stimuleren5.

De coronaire oclusie chirurgie biedt een zeer reproduceerbare en direct translationele methode om de innerlijke werking van hartregeneratie te ontdekken. De neonatale chirurgie parallellen coronaire slagader atherosclerose in het menselijk hart, waar accumulatie van plaque binnen de binnenwanden van de slagaders kan leiden tot een occlusie en de daaropvolgende hartinfarct8. Als gevolg van een leegte in therapeutische behandelingen voor patiënten met hartfalen, een occlusie in de LAD wordt geassocieerd met sterftecijfers tot 26% binnen een jaar na letsel9, en bijgevolg is genoemd de “weduwe maker.” Vooruitgang in de therapieën vereist een model dat nauwkeurig de complexe fysiologische en pathologische effecten van cardiale letsel weerspiegelt. Ons chirurgisch protocol voor neonatale muis hartletsel biedt een platform waarmee onderzoekers de moleculaire en cellulaire signalen die zoogdier hartregeneratie signaal na letsel te onderzoeken.

Recent onderzoek benadrukt de dynamische relatie tussen de extracellulaire omgeving en het verspreiden van cardiomyocyten. Bijvoorbeeld, de postnatale regeneratieve venster kan worden uitgebreid door het verminderen van de stijfheid van de extracellulaire matrix rond het hart10. Biomaterialen uit de neonatale extracellulaire matrix kunnen ook hartregeneratie bevorderen bij volwassen zoogdierharten na hartletsel11. Ook de begeleidende cardiomyocyteproliferatie is een angiogene respons12,13; bijkomende slagadervorming die uniek is voor het regenererende hart van de neonatale muis bleek essentieel te zijn voor het stimuleren van hartregeneratie12. Bovendien heeft ons lab aangetoond dat zenuwsignalering cardiomyocyteproliferatie en hartregeneratie reproduceert via modulatie van groeifactorniveaus, evenals de ontstekingsreactie na letsel14. Deze bevindingen benadrukken de noodzaak om niet-myocyte celpopulaties te traceren in reactie op hartletsel. Om dit doel te bereiken, hebben we gebruik gemaakt van de Cre-lox recombination systeem in transgene muizen lijnen te nemen constitutieve of voorwaardelijke expressie van fluorescerende reporter eiwitten voor lineage tracing. Bovendien kunnen we geavanceerde methoden gebruiken om de kloonexpansiepatronen te bepalen met de Rainbow muislijn, die is gebaseerd op de stochastische expressie van de Cre-afhankelijke, multi-color fluorescerende verslaggevers om de kloonexpansie van gerichte celpopulaties te bepalen15. Gebruik te maken van afstamming traceren met de neonatale kransslagader occlusie chirurgie is een krachtig hulpmiddel voor het ontleden van de ingewikkelde cellulaire mechanismen van hartregeneratie.

Het bijhouden van de afstamming van fluorescerende gelabelde cellen met driedimensionale (3D) hele orgaanbeeldvorming is moeilijk te bereiken met behulp van traditionele sectioning en reconstructie techniek – vooral wanneer celpopulaties kwetsbaar zijn, zoals zenuwvezels of bloedvaten. Terwijl directe geheel-mount beeldvorming van het orgaan door optische sectioning oppervlakkige celpopulaties kan vangen, structuren die diep in het weefsel verblijven ontoegankelijk blijven. Om deze barrières te omzeilen, zijn weefselclearingtechnieken ontwikkeld om de ondoorzichtigheid van hele orgaanweefsels te verminderen. Onlangs zijn aanzienlijke vooruitgang geboekt op clear lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel (CLARITY)-gebaseerde methoden, die vast weefsel wissen via lipide extractie16. Er worden ook stappen ondernomen om de brekingsindex te homogeniseren en vervolgens de lichtverstrooiing te verminderen terwijl imaging17. Een dergelijke methode is actieve helderheid, die lipideafbraak versnelt met behulp van elektroforese om het wasmiddel door het hele weefsel te penetreren18. Hoewel effectief, deze weefsel clearing methode vereist dure apparatuur en kan weefselschade veroorzaken, waardoor de aanpak onverenigbaar met fragiele celpopulaties zoals de hartzenuwen19. Zo maken we gebruik van de passieve CLARITY-benadering, die afhankelijk is van warmte om de penetratie van detergentia voorzichtig te vergemakkelijken, waardoor we helpen bij het behoud van ingewikkelde celstructuren20,21.

Passieve HELDERHEID wordt meestal beschouwd als minder efficiënt dan actieve HELDERHEID18,omdat de techniek vaak gepaard gaat met twee belangrijke obstakels: het onvermogen om de gehele orgaandiepte te wissen en de uitgebreide hoeveelheid tijd die nodig is om volwassen weefsels te wissen. Onze passieve CLARITY-aanpak overwint beide barrières met een snel clearingproces dat in staat is om neonatale en volwassen hartweefsel volledig te zuiveren. Onze passieve CLARITY tissue clearing techniek heeft een efficiëntie bereikt die de visualisatie van een verscheidenheid van hartcelpopulaties mogelijk maakt, met inbegrip van zeldzame populaties verspreid over het volwassen hart. Wanneer het gewiste hart wordt afgebeeld met confocale microscopie, kan de architectuur van celspecifieke patronen tijdens ontwikkeling, ziekte en regeneratie worden verlicht.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor het gebruik en de verzorging van proefdieren en in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee in de School of Medicine and Public Health aan de Universiteit van Wisconsin-Madison. Alle methoden werden uitgevoerd op wilde type C57BL/6J (B6) en transgene muislijnen verkregen van Jackson Laboratories. 1. Coronaire Slagader Occlusie (Myocardial Infarct) Geïnduceerd via ligatie van de linker voorste aflop…

Representative Results

Vaak zijn de twee meest uitdagende stappen begeleiden het hart uit de borstholte en ligating de LAD. Om deze stappen op te lossen, kunnen aanpassingen worden gedaan bij de plaatsing van de eerste punctie tussen de vierde intercostale spieren; als de punctie en de botte dissectie zich te dicht bij het borstbeen bevinden, kan het hart de borstholte mogelijk niet verlaten(figuur 1A). Bovendien kan een verhoogde druk op de linkerbuik nodig zijn om dit…

Discussion

Cel-cel interacties tussen cardiomyocyten en niet-myocyte populaties zijn een bepalende factor van de vraag of het hart fibrose zal ondergaan of herstellen na letsel. Ontdekkingen zijn gedaan waaruit blijkt dat een verscheidenheid van celtypes, waaronder zenuwen14, epicardiale cellen24, peritoneale macrofagen25, arterioles12,13, en lymfatische endotheelcellen26, spelen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De financiering voor dit project werd verstrekt door de UW School of Medicine and Public Health van het Wisconsin Partnership Program (A.I.M.), en een American Heart Association Career Development Award 19CDA34660169 (A.I.M.).

Materials

1-thioglycerol
6-0 Prolene Sutures Ethicon 8889H Polypropylene Sutures
Acrylamide
Boric acid
Curved Forceps Excelta 16-050-146 Half Curved, Serrated, 4 in
Dressing Forceps Fisherbrand 13-812-39 Dissecting, 4.5 in
Glass Vial Fisherbrand 03-339-26A 12 x 35 mm Vial with Cap
Histodenz Sigma-Aldrich Density gradient medium
Iridectomy Scissors Fine Science Tools 15000-03 2 mm Cutting Edge
Large Dissecting Scissors Fisherbrand 08-951-20 Straight, 6 in
Needle Holder Fisherbrand 08-966 Mayo-Hegar, 6 in
Paraformaldehyde
Phosphate Buffer
Sharp Forceps Sigma-Adrich Z168777 Fine Tip, Straight, 4.25 in
Small Dissecting Scissor Walter Stern Inc 25870-002 30 mm Cutting Edge
Sodium Azide
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
Tissue Forceps Excelta 16050133 Medium Tissue, 1X2 Teeth
VA-044 Wako Chemicals Water-soluble azo initiator

References

  1. Lazar, E., Sadek, H. A., Bergmann, O. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
  2. Kikuchi, K., Poss, K. D. Cardiac regenerative capacity and mechanisms. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 719-741 (2012).
  3. Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
  4. Savarese, G., Lund, L. H. Global Public Health Burden of Heart Failure. Cardiac Failure Review. 3 (1), 7-11 (2017).
  5. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  6. Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
  7. Karwowski, J., et al. Relationship between infarct artery location, acute total coronary occlusion, and mortality in STEMI and NSTEMI patients. Polish Archives of Internal Medicine. 127 (6), 401-411 (2017).
  8. Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  9. MAGGIC. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. European Heart Journal. 33 (14), 1750-1757 (2012).
  10. Notari, M., et al. The local microenvironment limits the regenerative potential of the mouse neonatal heart. Science Advances. 4 (5), 5553 (2018).
  11. Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
  12. Das, S., et al. A Unique Collateral Artery Development Program Promotes Neonatal Heart Regeneration. Cell. 176 (5), 1128-1142 (2019).
  13. Wang, Z., et al. Decellularized neonatal cardiac extracellular matrix prevents widespread ventricular remodeling in adult mammals after myocardial infarction. Acta Biomateria. 87, 140-151 (2019).
  14. Mahmoud, A. I., et al. Nerves Regulate Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Developmental Cell. 34 (4), 387-399 (2015).
  15. Yanai, H., Tanaka, T., Ueno, H. Multicolor lineage tracing methods and intestinal tumors. Journal of Gastroenterology. 48 (4), 423-433 (2013).
  16. Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  17. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  18. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  19. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biol. 14, 48 (2014).
  20. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).
  21. Phillips, J., et al. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Scientific Reports. 6, 26013 (2016).
  22. Blom, J. N., Lu, X., Arnold, P., Feng, Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. Journal of Visualized Experiments. (111), e54100 (2016).
  23. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 754 (2018).
  24. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  25. Wang, J., Kubes, P. A Reservoir of Mature Cavity Macrophages that Can Rapidly Invade Visceral Organs to Affect Tissue Repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  26. Vieira, J. M., et al. The cardiac lymphatic system stimulates resolution of inflammation following myocardial infarction. Journal of Clinical Investigation. 128 (8), 3402-3412 (2018).

Play Video

Cite This Article
Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging. J. Vis. Exp. (157), e60482, doi:10.3791/60482 (2020).

View Video