Ontwerp van een biocompatibele drug-Eluting tracheale stent in muizen met Laryngotracheale stenose
Summary
Laryngotracheale stenose is het resultaat van pathologische litteken afzetting die de tracheale luchtweg kritisch vernauwt en geen effectieve medische therapieën mist. Met behulp van een PLLA-PCL (70% poly-L-lactide en 30% polycaprolactone) stent als een lokale drug delivery systeem, potentiële therapieën gericht op het verminderen van litteken proliferatie in de luchtpijp kan worden bestudeerd.
Abstract
Laryngotracheale stenose (LTS) is een pathologische vernauwing van de subglottis en luchtpijp die leidt tot extrathoracale obstructie en significante kortademigheid. LTS resulteert in een slijmvlies beschadiging door een vreemd lichaam in de luchtpijp, wat leidt tot weefselbeschadiging en een lokale ontstekingsreactie die misgaat, wat leidt tot de afzetting van pathologisch littekenweefsel. De behandeling van LTS is chirurgisch vanwege het gebrek aan effectieve medische therapieën. Het doel van deze methode is om een biocompatibele stent te construeren die kan worden geminiaturiseerd om in muizen met LTS te plaatsen. We hebben aangetoond dat een plla-PCL (70% poly-L-lactide en 30% polycaprolactone) constructie een optimale biomechanische sterkte had, was biocompatibel, praktisch uitvoerbaar voor een in vivo plaatsing stent, en geschikt voor het eluering van drugs. Deze methode biedt een systeem voor het afleveren van geneesmiddelen voor het testen van verschillende immunomodulerende middelen om de ontsteking lokaal te remmen en de fibrose van de luchtwegen te verminderen. De productie van de stents duurt 28 − 30 uur en kan eenvoudig worden gereproduceerd, waardoor experimenten met grote cohorten mogelijk zijn. Hier hebben we het medicijn rapamycine binnen de stent opgenomen om de effectiviteit ervan te testen bij het verminderen van fibrose en collageen depositie. De resultaten toonden aan dat PLLA-PCL-tenten betrouwbare rapamycineafgifte vertoonden, mechanisch stabiel waren in fysiologische omstandigheden en biocompatibel waren, waardoor weinig ontstekingsreactie in de luchtpijp werd teweeggebracht. Verder vermindert de rapamycine-eluting PLLA-PCL stents de littekenvorming in de luchtpijp in vivo.
Introduction
Laryngotracheale stenose (LTS) is een pathologisch vernauwing van de luchtpijp, meestal als gevolg van iatrogene post-intubatie letsel. De combinatie van bacteriële kolonisatie, reactie van het buitenlandse lichaam op een tracheostomie of endotracheale buis, en patiëntspecifieke factoren leiden tot een afwijkende ontstekingsreactie. Deze maladaptieve immuunrespons leidt tot de afzetting van collageen in de luchtpijp, resulterend in Luminale vernauwing van de luchtpijp en daaropvolgende stenose1,2. Aangezien de huidige behandeling voor deze ziekte primair chirurgisch is, is het ontwikkelen van een alternatief medisch gebaseerd behandelings paradigma gericht op de afwijkende inflammatoire en profibrotische trajecten die leiden tot overmatige collageen depositie. Rapamycine, die remt de mTOR signalering complex, is gebleken dat immunosuppressieve effecten evenals een robuuste antifibroblast effect. Wanneer rapamycine echter systemisch wordt toegediend, kunnen vaak voorkomende bijwerkingen (bijv. hyperlipidemie, anemie, trombocytopenie) worden uitgesproken3. Het doel van onze methodologie is het ontwikkelen van een voertuig voor lokale geneesmiddelafgifte uitvoerbaar voor gebruik op de luchtweg die deze systemische effecten zou verminderen. Onze beoordelingen zijn gericht op het onderzoeken van de lokale immuunrespons op de drug delivery construct evenals de capaciteit voor de remming van fibroblast functie en de lokale immune micro omgeving te veranderen. Ziektespecifieke uitkomsten omvatten in vivo testen die markers van fibrose evalueren.
Biologisch afbreekbare drug-eluting stents zijn gebruikt in diermodellen van de ziekte in meerdere orgel systemen, met inbegrip van de luchtweg4. Voor het beheer van de luchtweg stenose of instorting, hebben eerdere onderzoeken gebruik gemaakt van met drugs beklede siliconen en op nikkel gebaseerde stents5. Een PLLA-PCL-constructie werd gekozen voor deze specifieke methode vanwege zijn geneesmiddel elutie profiel en mechanische sterkte in fysiologische omstandigheden gedurende een periode van 3 weken, wat is aangetoond in eerdere gepubliceerde studies6. PLLA-PCL is ook een biocompatibel en biologisch afbreekbaar materiaal dat al is goedgekeurd door de FDA4. Biocompatibele stents eluering cisplatine en MMC zijn bestudeerd in grote diermodellen zoals konijnen en honden. Echter, in deze diermodellen, stents werden niet geplaatst in een diermodel van de ziekte en werden geïmplanteerd transcervically. Deze studie biedt een unieke methode voor het beoordelen van een biocompatibele drug-eluting stent geplaatst transoraal in een muismodel van luchtweg letsel en laryngotracheale stenose. Een biocompatibele stent die lokaal een immunomodulerend geneesmiddel wegspost en kan worden geminiaturiseerd voor studie in een muriaans model is waardevol voor translationeel preklinisch onderzoek. Eerdere pogingen tot stent-gebruik met andere materiaal constructies genereerden robuuste reacties van het buitenlandse lichaam en verergeren de onderliggende ontstekingdie LTS onderscheidt. Deze methodologie, naar onze kennis, is de eerste in zijn soort om de immunomodulerende en antifibrotische effecten van een stent-based geneesmiddel bezorgingssysteem in een muriene model van LTS te bestuderen. Het model van de Murine zelf biedt verschillende voordelen voor het bestuderen van de effecten van een immunomodulerende drug op de luchtpijp. Genetisch gemodificeerde muizen en experimentele cohorten van gezonde en zieke muizen kunnen worden bestudeerd, wat kan leiden tot experimentele reproduceerbaarheid en het verbeteren van de kosteneffectiviteit. Bovendien bootst de levering van de stent transoraal in de luchtpijp van de muis de klinische levering van een dergelijke stent bij mensen na, wat het translationeel voordeel van deze methode verder benadrukt. Ten slotte, het relatieve gemak waarmee de PLLA-PCL stent met het medicijn kan worden geproduceerd, maakt het mogelijk om alternatieve medicamenteuze therapieën te leveren die gericht zijn op het verminderen van littekenvorming in de luchtpijp.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen voor het succesvol construeren en gebruiken van een drug-eluting stent in vivo zijn 1) het bepalen van de optimale PLLA-PCL ratio voor de gewenste drug elutie rate, 2) het bepalen van de juiste concentratie van het geneesmiddel dat moet worden verwijderd, 3) het vormen van de stents rond de angio katheter voor in vivo gebruik, en 4) transoraal het leveren van de stent in de muizen na LTS inductie zonder fatale luchtwegobstructie veroorzaken.
Hoewel er verschillende m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nationaal Instituut voor doofheid en andere communicatiestoornissen van de National Institutes of Health onder de awardnummers 1K23DC014082 en 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Deze studie werd ook financieel gesteund door de Triological Society en American College of Surgeons (Alexander Hillel), de American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) en een T32 NIDCD training Grant (Kevin Motz).
Materials
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA “finger-type” stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
