עיצוב של משחררי ביוטינג לסמים ביולוגיים בעכברים עם היצרות לרינגוקנה
Summary
היצרות לרינגוקנה התוצאות מתוך התצהיר צלקת פתולוגית כי באופן ביקורתי מצמצמת את דרכי הנשימה הקנה וחסר טיפולים רפואיים יעילים. באמצעות PLLA-PCL (70% פולי-L-lactide ו-30% pvc) סטנט כמערכת שילוח סמים מקומי, טיפולים פוטנציאליים המיועדים להפחתת התפשטות הצלקת בקנה הנשימה ניתן ללמוד.
Abstract
היצרות לרינגוקנה (הארה ב) היא היצרות פתולוגית של תת-הבית וקנה הנשימה המוביל לחסימה מחוץ לבית החזה וקוצר נשימה משמעותי. התוצאות של המנהיג מפציעה מגוף זר בקנה הנשימה, המובילה לפגיעה ברקמות ותגובה דלקתית מקומית אשר משתבש, המובילה לתצהיר של רקמת צלקת פתולוגית. הטיפול עבור הארה הוא כירורגי עקב חוסר טיפולים רפואיים יעילים. מטרת שיטה זו היא לבנות סטנט תואם ביולוגי זה יכול להיות מיניאטורי למקום עכברים עם הארה. הדגמנו כי PLLA-PCL (70% פולי-L-lactide ו-30% polycaprolactone) בונה היה חוזק ביומכאני אופטימלי, היה ביולוגי תואם, מעשית עבור vivo מיקום סטנט, ומסוגל להתחמק תרופה. שיטה זו מספקת מערכת העברת תרופות לבדיקת סוכנים אימונומודולטוריים שונים כדי לעכב את הדלקת באופן מקומי ולהפחית פיברוזיס של דרכי הנשימה. ייצור סטנטים לוקח 28 שעות וניתן לשכפל בקלות ולאפשר ניסויים עם כנופיית גדולים. כאן אנו שילב את rapamycin התרופה בתוך סטנט כדי לבדוק את יעילותו בהפחתת פיברוזיס והתצהיר קולגן. התוצאות התגלו כי האוהלים PLLA-PCL הראו לשחרר rapamycin אמין, היו יציבים מכנית בתנאים פיסיולוגיים, היו תואמים ביולוגית, וגרימת תגובה דלקתית קטנה בקנה הנשימה. נוסף על כך, הפחתת הצלקת של היווצרות הצלקות בקנה הנשימה בvivo.
Introduction
היצרות לרינגוקנה (הארה ב) היא היצרות פתולוגית של קנה הנשימה לרוב בשל פציעה הפוסט-צנרור. השילוב של הקולוניזציה החיידקית, תגובת גוף זר למעי הגס או צינורית אנדוקנה, וגורמים ספציפיים למטופל מובילים לתגובה דלקתית חריגה. זה התגובה החיסונית מסתגלת מוביל התצהיר של קולגן בקנה הנשימה, וכתוצאה מכך היצרות הלומיאל של קנה הנשימה ואת היצרות הבאים1,2. כמו הטיפול הנוכחי עבור מחלה זו היא כירורגית בעיקר, פיתוח אלטרנטיבה רפואית מבוססת טיפול הפרדיגמה מיקוד מסלולים דלקתיים והפרופיברוטיים להוביל התצהיר קולגן מוגזם נחקרו. Rapamycin, אשר מעכב את מתחם ה-mTOR איתות, הוכח כי יש אפקטים חיסוני מדכאים, כמו גם אפקט אנטיפיברוסט חזק. עם זאת, כאשר rapamycin הוא מנוהל באופן מערכתית, תופעות לוואי נפוצות (למשל, hyperlipidemia, אנמיה, תרומבוציטופניה) יכול להיות מבוטא3. מטרת המתודולוגיה שלנו היא לפתח רכב עבור משלוח סמים מקומי מעשית לשימוש בדרכי הנשימה כי היה להפחית את ההשפעות הללו מערכתית. ההערכות שלנו מתמקדות בחקירת התגובה החיסונית המקומית לבניית משלוח הסמים, כמו גם יכולתו לעכב את התפקוד הפיברוהפיצוץ ולשנות את הסביבה החיסונית המקומית. תוצאות ספציפיות למחלות כוללות בדיקות vivo כי הערכת סמנים של פיברוזיס.
סטנטים מתכלים לתרופות מתכלה שימשו במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכות איברים מרובות, כולל נתיב האוויר4. לניהול היצרות בדרכי הנשימה או קריסה, החקירות הקודמות השתמשו סיליקון מצופה סמים וסטנטים מבוססי ניקל5. בניית PLLA-PCL נבחרה עבור שיטה זו מסוימת בגלל הפרופיל שלה משחרלי התרופה וחוזק מכני בתנאים פיסיולוגיים במשך תקופה של 3 שבועות, אשר הוכח במחקרים הקודמים שפורסמו6. PLLA-PCL הוא גם חומר ביולוגי תואם ומתכלה כבר אושרה על ידי ה-FDA4. משחררי סטנטים ביולוגיים ו-MMC נבדקו בדגמי בעלי חיים גדולים כגון ארנבים וכלבים. עם זאת, במודלים אלה של בעלי חיים, סטנטים לא הושמו במודל בעל חיים של מחלות והושתל השתלת עצמות. מחקר זה מספק שיטה ייחודית להערכת סטנט ביולוגי משחררי התרופות ממוקם transorally במודל העכבר של פציעה בדרכי הנשימה והיצרות לרינגוקנה. סטנט תואם ביולוגי המפריש תרופה חיסונית מקומית והוא יכול להיות מיניאטורי למחקר במודל murine הוא בעל ערך עבור מחקר טרום המחקר הקליני. נסיונות קודמים לניצול סטנט עם מבנה חומרים אחרים שנוצר תגובות גוף זר חזק החמרה הדלקת הבסיסית המבדיל את הארה ב7. מתודולוגיה זו, לידיעתנו, היא הראשונה מסוגו ללמוד את ההשפעות האימונומודולטיות והאנטי פיברופטיים של מערכת העברת תרופות מבוססת-סטנט במודל של מורטין. המודל המורין עצמו מציע מספר יתרונות לחקר ההשפעות של סם אימונומודוללי על קנה הנשימה. עכברים מהונדסים גנטית וגדודים ניסיוני של עכברים בריאים וחולים ניתן ללמוד, אשר יכול להוביל לשינוי ניסיוני ולשפר עלות יעילות. יתר על כן, המסירה של סטנט העברת לתוך קנה הנשימה של העכבר מחקה משלוח קליני של סטנט כזה בבני אדם, אשר עוד מדגיש את היתרון הטרנסלייתי של שיטה זו. לבסוף, הקלות היחסית שבה הסטנט PLLA-PCL עם התרופה ניתן לייצר מאפשר שינויים כדי לספק טיפולי סמים חלופיים מכוון להפחתת צלקת היווצרות בקנה הנשימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצעדים הקריטיים ביותר עבור בהצלחה בנייה ושימוש סטנט משחררי התרופה ב vivo הם 1) קביעת היחס האופטימלי של PLLA-PCL עבור שיעור התרופה הרצוי, 2) קביעת הריכוז המתאים של התרופה כדי להיות משתמט, 3) ליציקת סטנטים סביב הקטטר לשימוש vivo, ו 4) מעביר את הסטנט לתוך העכברים לאחר האינדוקציה של הארה ב מבלי לגרום לחסימ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המכון הלאומי על חירשות והפרעות תקשורת אחרות של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרס 1K23DC014082 ו 1K23DC014082 (אלכסנדר הלל). מחקר זה היה גם נתמך מבחינה כספית על ידי האגודה הטריולוגית והמכללה האמריקנית למנתחים (אלכסנדר הלל), קרן האגודה האמריקנית לרפואה, שיקגו, IL (Madhavi Duvvuri) ו מענק הכשרה T32 נדבך (קווין Motz).
Materials
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA “finger-type” stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
