Summary
喉管狭窄狭窄源于病理性疤痕沉积，严重缩小气管气道，缺乏有效的医疗疗法。使用PLLA-PCL（70%多L-乳酸酯和30%多氯环）支架作为局部药物输送系统，可以研究旨在减少气管疤痕增殖的潜在疗法。
Abstract
喉管狭窄狭窄 （LTS） 是一种病理性狭窄下眼底和气管，导致外胸阻塞和呼吸明显急促。LTS 的起因是气管中异物的粘膜损伤，导致组织损伤和局部炎症反应，导致病理疤痕组织的沉积。由于缺乏有效的医疗疗法，LTS的治疗是外科手术。这种方法的目的是构建一个生物相容的支架，可以小型化，放入带有LTS的小鼠中。我们证明，PLLA-PCL（70%多L-乳酸酯和30%多氯酰丙酮）结构具有最佳的生物力学强度，具有生物相容性，对体内放置支架可行，并且能够脱脂药物。该方法为测试各种免疫调节剂提供药物输送系统，以局部抑制炎症，减少气道纤维化。制造支架需要 28-30 小时，可轻松复制，允许对大型组组进行实验。在这里，我们结合药物雷帕霉素在支架中，以测试其有效性，以减少纤维化和胶原蛋白沉积。结果表明，PLLA-PCL帐篷具有可靠的拉帕霉素释放，在生理条件下机械稳定，且具有生物相容性，在气管中引起炎症反应小。此外，拉帕霉素-脱脂PLLA-PCL支架减少了体内气管的疤痕形成。
Introduction
喉管狭窄狭窄 （LTS） 是气管的病理性收缩，最常见的原因是异位后插管损伤。细菌殖民化、异体对气管切开术或内切管的反应，以及患者特异性因素的组合导致异常炎症反应。这种不适应的免疫反应导致胶原蛋白在气管沉积，导致气管的亮度变窄，随后的狭窄1，2。由于目前治疗这种疾病主要是外科手术，开发一种替代的基于医学的治疗模式，针对导致过度胶原蛋白沉积的异常炎症和亲纤维化途径。拉帕霉素，抑制mTOR信号复合物，已被证明具有免疫抑制作用以及强大的抗纤维细胞效果。然而，当雷帕霉素是系统施用，常见的副作用（例如，高脂血症，贫血，血小板减少症）可以明显3。我们的方法的目的是开发一种本地药物输送工具，用于气道，以减轻这些系统影响。我们的评估侧重于调查药物输送结构的局部免疫反应及其抑制成纤维细胞功能和改变局部免疫微环境的能力。疾病特定结果包括评估纤维化标志物的体内测试。
生物降解药物脱毒支架已用于多种器官系统（包括气道4）的疾病动物模型。为了管理气道狭窄或坍塌，以前的研究已经使用了药物涂层硅胶和镍基支架5。PLLA-PCL结构被选择为这种特殊的方法，因为它的药物洗脱配置文件和机械强度在生理条件下在3周内，这已经证明在以前的出版研究6。PLLA-PCL也是一种生物相容性和可生物降解的材料，已经获得FDA4的批准。在大型动物模型（如兔子和狗）中研究了与生相容的支架，以驱除顺铂和MMC。然而，在这些动物模型中，支架没有被放置在动物疾病模型中，并且被植入转子。这项研究为评估一种生物相容性药物脱毒支架提供了一种独特的方法，该支架在小鼠模型中被横向放置，用于气道损伤和喉部狭窄。一种在局部免疫调节药物上洗脱，并可在鼠模型中小型化研究的生物相容性支架，对于临床前转化研究很有价值。以前尝试用支架与其他材料结构产生强大的异物反应恶化潜在的炎症，区分LTS7。据我们所知，这种方法是首次在LTS的鼠模型中研究支架药物输送系统的免疫调节和抗纤维化效果。鼠模型本身为研究免疫调节药物对气管的影响提供了几个优点。可以研究转基因小鼠和健康及患病小鼠的实验组，从而产生实验性可重复性，提高成本效益。此外，将支架横向输送到小鼠气管中，模拟了这种支架在人类中的临床交付，进一步突出了这种方法的转化优势。最后，PLLA-PCL支架与药物的生产相对容易，允许修改，提供替代药物治疗，旨在减少气管的疤痕形成。
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Protocol
注：此处描述的所有方法均获得约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会 （MO12M354） 的批准。
1. 在PLLA-PCL中制备拉帕霉素
- 准备两个玻璃瓶（带盖）70：30 PLLA-PCL 聚合物溶液（固有粘度 1.3±1.8 DL/G;材料表）溶液，一个小瓶含有1.0%的拉帕霉素，另一个没有拉帕霉素。
- 在玻璃瓶中加入6毫克的拉帕霉素至600毫克70：30 PLLA-PCL，使含有1.0%的拉帕霉素含有聚合物溶液。
- 对于不含拉帕霉素（控制）的聚合物溶液，只需在玻璃瓶中加入600mg的70：30 PLLA-PCL。
- 在烟罩下，在每个玻璃瓶中加入6 mL的二氯甲烷。
注意：二氯甲烷是一种腐蚀性材料，只能使用玻璃移液器。适当的安全预防措施包括个人眼部保护和手套。 - 在每个玻璃瓶中加入120μL的甘油（对于2%的甘油溶液）。
注：添加甘油可提高支架结构的灵活性和刚度。 - 回顾玻璃瓶，让 70：30 PLLA-PCL 与拉帕霉素和无雷帕霉素溶解和均质6~12小时。
注：玻璃小瓶也可以放置在旋转摇动平台上，以加快溶解速度。
2. 拉帕霉素洗脱测试
- 70：30 PLLA-PCL 溶液的移液器 1 mL，含有 1% 的拉帕霉素，放入玻璃培养皿中。
注：此体积为 70：30 PLLA-PCL 溶液，含有 1% 的拉帕霉素，将包含 120 μg 的拉帕霉素，并代表每个结构中的拉帕霉素总量。可使用替代体积和浓度。 - 让 70：30 PLLA-PCL 与 1% 的拉帕霉素硬化成玻璃培养皿中的平坦盘。
- 硬化后，将磁盘放入 2 mL 的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4），并在 37°C 腔室中孵育。
- 每 24 小时收集和更换 PBS （2 mL），并使用收集的 PBS 进行高性能液相色谱 （HPLC） 分析拉帕霉素含量。
- 使用自动进样器和 C18 4.6 厘米 x 250 mm HPLC 柱通过自动进样器喷油器运行样品，以及雷帕霉素的连续稀释，以创建校准的标准曲线。以三元运行每个示例。
注：要测试的拉帕霉素的连续稀释包括10%、1%、0.1%和0.01%。 - 使用HPLC级水和醋酸酯的移动相，体积为10/90，流速为2.0 mL/min。
注：图1显示了雷帕霉素在14天期间的洗脱。
3. 创建拉帕霉素-脱脂PLLA-PCL鼠风道支架
注：使用无菌材料和无菌技术执行步骤3.2-3.9，以避免影响体内和体外应用的污染。
- 如第 1 节所述，制备含有拉帕霉素的 PLLA-PCL 溶液。
- 使用带橡胶气球的玻璃巴斯德移液器，将含有1%拉帕霉素的PLLA-PCL溶液涂在22G氟化乙烯丙烯基气管（材料表）的静脉管上。一手握住血管器，并使用玻璃移液器将 PLLA-PCL 溶液滴到血管器上。缓慢旋转血管，确保使用 PLLA-PCL 溶液均匀覆盖血管。
注：起初，PLLA-PCL溶液将很薄，但随着二氯甲烷在应用到血管导管过程中蒸发，该溶液将变得更加粘稠，以模制到血管内。在应用过程中持续转动血管导管是有益的。这一步骤必须缓慢和细致地完成，以确保支架的厚度一致。 - 用血管的尖端朝下支撑模制的血管，在玻璃培养皿的边缘支撑，用于干燥。
- 在室温下，让支架在真空罩中干燥 24 小时（图 2A）。
- 通过轻轻拧动底层导管，将其从模制支架中滑出，从底层血管中去除支架结构（图 2B）。
- 在铸造过程中检查支架是否有任何缺陷。如果铸支架存在缺陷，请丢弃它。
- 用精细的直剪刀修剪铸支架的每一端，使边缘是轴向的。
- 使用精细直剪刀，切割铸支架的 3 mm 轴向段，用于 LTS 的鼠标模型（图 2C）。
注：大约8个支架可以由一个铸造的血管仪制成，每个3毫米支架含有120μg的拉帕霉素。 - 将 3 mm 支架加载到新的 22 静脉导管上，用于 LTS 的鼠标型号（图 1）。
4. 小鼠拉林戈切斯特狭窄诱导
- 在进行体内小鼠研究之前，获得动物护理和使用委员会的批准。
- 通过注射氯胺酮（80~100毫克/千克）和木兰素（5~10毫克/千克）的腹内注射，麻醉9周大的雄性C57BL/6。
注：其他菌株的小鼠可以替代，但建议小鼠重量在20-27克之间。 - 将小鼠随机化为实验组（化学力学损伤，放置1%的含有拉帕霉素的PLLA-PCL支架）和两个对照组：1）化学机械损伤，放置PLLA-PCL支架，2）化学机械损伤，无支架的位置。
- 将鼠标放在手术平台上，放在一个上等位置。使用贴在平台顶部的小螺纹循环，通过围绕中央切口循环来延长颈椎。
- 使用 2 英寸胶带将鼠标的手和腿固定在桌子上。捏住鼠标爪，以确保其有足够的麻醉。
- 手术部位随后做好了准备。应去除上覆毛皮，并清洁皮肤（用酒精或稀释的皮肤消毒剂交替碘或氯西丁磨砂）。三次。应覆盖区域并佩戴无菌手套。消毒仪器在不使用时应放在无菌表面上。
- 使用精细的弯曲虹膜剪刀在鼠标颈部进行 1.5 厘米的中线垂直切口。分割上垂胸腺并横向化两个产生的叶，以可视化气管。在上部附着处双边划分上覆的肌体和甲状腺（带状）肌肉。
注：在此之后，整个喉管复合物应完全暴露。 - 通过喉部通过22G血管切开器进入气管。使用小钳子对小鼠的前喉施加压力，以帮助正确放置血管。通过气管可视化白色血管导管，以确保正确放置（非食管）。
注：小鼠气管非常薄，白色气管将通过半透明气管进行可视化。 - 通过插入的血管仪，通过博霉素涂层的线刷。
- 慢慢取出血管，以便只有钢丝刷留在气管中。
- 在气管上用细钳施加反压，用钢丝刷机械地破坏气管流明。
- 将血管器重新插入钢丝刷的气管中。
- 拆下钢丝刷并重新涂抹博霉素。
- 重复步骤 4.8_4.12 共 5 倍。将霉素涂抹到每个应用程序之间的刷子上。
注：此模型的验证和描述可在 Hillel 等人8中找到。 - 从小鼠气管中取出血管导管。
注：如果没有支架放置，切口可以使用组织胶水关闭。
5. 小鼠的跨口服PLLA-PCL支架放置
- 将一个 3 mm 铸支架加载到空的 22 G 血管仪上（图 3A）。
注：支架应从血管的顶端休息 5 mm。 - 在 3 mm 铸支架上绘制一条细黑色垂直线。
注： 此行可改进气管支架的可视化效果。 - 将鼠标与预装支架的血管器进行外置插管。
- 通过转颈切口将气管中的气管上的支架可视化（图3B）。
注：气管非常薄，允许支架上的黑色染料通过气管可视化。使用此选项可确认正确的气管放置。 - 用细钳夹住气管，通过跨颈椎切口将支架抓住到位。
- 横向取下血管，同时用细钳保持支架的抓地力。
注意：当去除血管导管时，不要对支架施加太大的力，不要压碎流明，这一点极为重要。然而，需要足够的力来确保支架不会用血管切除。0.8 mm 的 sialendoscope 可用于可视化支架在气管中的位置和位置。 - 用组织胶水关闭跨颈椎切口。
- 允许每只鼠标恢复到其原始活动级别，然后再将其放回笼子中。
6. 样品的形态学制备
- 麻醉小鼠吸入麻醉和牺牲小鼠与宫颈错位每个动物协议后7，14或21天。
注：根据研究的慢性，可以使用不同的时间间隔（例如，28、30 天等）。 - 如步骤 4.4 和 4.5 所述，将鼠标放在手术平台上。
- 使用精细的弯曲虹膜剪刀重新打开鼠标上的颈部切口。
- 每个步骤 4.6 暴露气管。
- 使用细弯曲的虹膜剪刀将远端气管分到支架的下方。
- 使用细弯曲的虹膜剪刀将近端气管在喉部下方和支架上方分开。
注：首先分割远端气管以防止气管缩回胸切。 - 从后食道分离气管，从小鼠中取出气管。
注：支架仍将保留在小鼠气管内。 - 从气管中取出支架，在 10% 形式中固定 24 小时。
- 将正式固定小鼠气管标本嵌入石蜡中，具有优越的远端定向，以便在下一步进行气管的轴向切割。
- 使用微管切割石蜡嵌入小鼠气管的5μm部分。
注：应从远端气管开始轴向切割试样。 - 沿试样的长度每 250 μm 获得一个 5 μm 代表部分。
- 在每个代表性部分完成 H&E 染色。
- 将每张幻灯片放入二甲苯 2x 3 分钟，对幻灯片进行脱胶处理。
- 将滑片放入 100% 乙醇中 2 分钟，将 95% 乙醇放置 2 分钟，将 70% 乙醇放入 2 分钟以补充水分。
- 用自来水清洗幻灯片2分钟。
- 将滑片在血氧林中染色 3⁄5 分钟。
- 用自来水清洗幻灯片 5 分钟。
- 将幻灯片放入 1% 酸酒精中 1 分钟。
- 用自来水清洗幻灯片1分钟。
- 用0.2%氨水冲洗30s。
- 在自来水中冲洗幻灯片 5 分钟，浸在 95% 乙醇 10 倍中。
- 叶辛染色，将滑轨置于欧辛芬西尼30s。
- 将 95% 乙醇放入 5 分钟，然后绝对乙醇 2x 5 分钟，使滑片脱水。
- 放入二甲苯2x5分钟
- 使用基于二甲苯的安装介质安装滑轨。
- 测量层状的厚度，如希勒尔等人8所述。
7. 体内的支架生物相容性
- 如步骤 6.1_6.4 中所述，准备组织部分。不要从这些气管部分取出支架，以可视化炎症相对于气管流明内支架位置的变化。
- 要确定急性异物对支架的反应，请使用CD3和F4/80标记观察巨噬细胞和T细胞活性。
注：其他标记也可用于确定对支架的急性炎症反应。 - 在市售的亲水加幻灯片（材料表）上获取石蜡嵌入气管的5 μm切割部分。在每张幻灯片上放置两个部分。
注：这些部分应来自放置 PLLA-PCL 支架的气管区域。
- 要确定急性异物对支架的反应，请使用CD3和F4/80标记观察巨噬细胞和T细胞活性。
- 将幻灯片放入二甲苯 2x 中，每次 5 分钟。
- 将幻灯片放入 100% 乙醇 2x 中，每次 3 分钟。
- 将幻灯片放入 95% 乙醇中 1 分钟。
- 将幻灯片放入组织学染色架中，使其浸入抗原检索缓冲液（材料表），然后放入装有沸水的蔬菜蒸蒸机中 20 分钟。
- 从蒸架上拆下染色架并丢弃抗原回收缓冲液。
- 将缓冲液替换为 1 mL 的 PBS。
- 将幻灯片放入湿染色盒中 1 分钟。
- 丢弃 PBS，用 Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM） 孵育幻灯片 30 分钟。
- 丢弃DMEM，加入不同物种中培养的两种原抗体的混合物。用石蜡薄膜覆盖幻灯片，在4°C的黑暗室中孵育过夜。
注：在本协议中使用了兔子抗CD3和大鼠抗F4/80（材料表）。 - 在 PBS 3 中清洗幻灯片 5 分钟。
- 用与主要抗体物种（材料表）特有的二级抗体孵育幻灯片，在DMEM中，在室内温度下用10%FBS在0.5±1小时的黑暗下进行0.5±1小时。
- 在黑暗中将幻灯片在 PBS 3 中洗涤 5 分钟。
- 将滑轨安装在盖玻片上，用 4'6-二酰胺-2-phenylindole （DAPI） 安装一滴安装介质。将幻灯片存放在 20°C 或 4 °C 的黑暗中。
- 在激光扫描共聚焦显微镜和照片上观察彩色幻灯片。
- 量化与DAPI和感兴趣的抗体染色的细胞总数，以与未受伤的气管进行比较。
8. 小鼠气管定量基因表达分析
- 如步骤 6.1_6.7 所述收集小鼠气管并取出支架。
注：收获的小鼠气管可储存在-80°C冷冻室长达2年。 - 使用精细剪刀将步骤 8.1 中收获的气管组织用于干燥，并使用带有 1.4 mm 陶瓷珠（材料表）的珠磨机均质器进一步均质化，作为市售的柱基RNA提取试剂盒（材料表）的一部分。
注：珠磨机均质器设置 = 6 m/s 时一个 40 s 周期。 - 根据制造商的说明，使用基于柱的提取和纯化试剂盒（材料表）从气管解糖中提取RNA。
- 使用分光光度计（材料表）从每个样品中量化RNA。
注：使用260/230nm比评估RNA纯度，纯RNA样本读数为2.0。 - 使用逆转录酶（材料表）和热循环器从提取的RNA中创建补充DNA，具有以下设置：在25°C（注水）时5分钟，46°C30分钟（逆转录），然后95°C1分钟（逆转录酶失活）。
- 用无RAse水稀释互补DNA样品，浓度为10~25纳克/mL，用于定量实时PCR。
- 将1 μL的互补DNA（10~25纳克/mL）与10 μL的PCR主混合物（材料表）、8 μL的ddH2O和0.5 μL的10μM正向和反向引物混合，用于96孔PCR板（材料表）的一口井中的感兴趣基因。
注：每口井的总体积应为20μL。96孔板上的每口井应只包含一个样品和一个感兴趣的基因。 - 对所有感兴趣的基因重复步骤8.1_8.7，并运行三重基因的每个样本。
注：胶原蛋白1、胶原蛋白3和参考基因β-肌蛋白的基因特异性正向和反向引物（材料表）通常用于研究纤维化标记物。 - 将 96 孔板放在实时定量 PCR 机器上，并启动以下协议：在 95°C 下变性 15 s，在 60°C 下扩展 60 s，40 个周期。
- 将每个感兴趣的基因的基因产品检测的周期阈值 （CT） 标准化为所有样本的参考基因 β-actin 的 CT 值，以获得每个 GOI 的 μCT。然后，比较每个GOI的待处理和未经处理样本的Β值，以生成βCT。
注： 当存在预定数量的基因产物 （μRn） 时，周期阈值是扩增曲线上的点。应为每个感兴趣的基因确定每个反应的μRn值，并应落在扩增曲线的线性部分。
注：[CT] CT （GOI） = CT（参考基因）;[CT ] [CT] [CT] - 通过计算2+CT，计算经过处理的样本和未经处理的样本之间的基因表达的相对变化，作为折叠变化的表达。
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Representative Results
本研究中使用的可生物降解PLLA-PCL支架结构中装有拉帕霉素，能够在生理条件下以一致和可预测的方式消除拉帕霉素（图1）。图 2显示了围绕 22 G 血管仪铸造的 PLLA-PCL 支架，用于 LTS 的鼠模型。为了确定气管中拉帕霉素洗脱对衰减纤维化是否有效，可以通过基因表达分析、流细胞测定、免疫荧光和ELISA来评估纤维化相关基因表达和急性炎症标记的测量变化。用上述方法成功地将小型支架植入小鼠气管。方法的示意图如图3所示。图 4显示了气管中微型生物相容性支架的原位，如支架上的黑色标记所示，该标记通过半透明小鼠气管进行可视化。在最初的实验中，使用0.8毫米的紫外镜来确认支架在气管中的放置是有帮助的。21天后，为了确认支架的透射放置是有效的，支架没有从原来的位置移动，颈部切口重新打开，以确定支架的位置。如图4B所示，支架的黑色染料标记显示支架在气管中保持其位置。用支架治疗21天后气管切除如图4C所示。
图5显示了使用免疫荧光染色进行急性和慢性炎症标志物的生物相容性测试的代表性图像。这表明PLLA-PCL支架结构（不含雷帕霉素）不是免疫反应，由放置后存在的免疫细胞数量最少决定。需要注意的是，在这种方法中，使用了正常未受伤的气管，并放置了不含拉帕霉素的PLLA-PCL支架来确定对构造本身的炎症反应。
接下来，为了确定拉帕霉素-脱脂PLLA-PCL支架是否有效减轻疤痕，我们之前在急性炎症和纤维化6标记物中展示了基因表达的变化。具体来说，减少90.3倍（SEM = 26.0;n = 4;p < 0.01） 第 4 天 col1a1 的减少，以及急性炎症标记 INF-*、CD11b、Arg-1 和 IL-1B6。虽然某些基因的褶皱变化差异并不显著，但随着小鼠群的增加，有可能达到显著性。为了确定气管是否由于药物洗脱组织学而发生变化，或者气管是否由于支架的径向力作用而改变，我们证明，与那些没有雷帕霉素-脱毒支架的气管相比，用雷帕霉素-脱毒支架治疗的气管的拉米纳皮气的宽度有所下降。
图1：拉帕霉素PLLA-PCL洗脱。含有1%拉帕霉素的PLLA-PCL结构在14天内展示了一致和可预测的拉帕霉素释放。数据点表示采样洗脱的平均值 = SEM （n = 3）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：支架铸造。（A） PLLA-PCL 溶液允许绕22G的血管干燥。（B） 石膏随后被从血管器中取出.（C） 支架被切割到3毫米长度，用于小鼠型号6。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：小鼠的异位支架放置。（A） 支架被装上一个空的气管，并横向放入气管中。（B） 支架上的黑色染料标记可通过转颈切口看到，以确认其在小鼠气管中的位置。（C） 代表绘制支架原位在患病小鼠气管6。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：支架的原位图像。（A-B）带有黑色染料标记的支架可以在鼠气管原位看到。（C） 在21天6号收获后支架和鼠喉愈合复合物的图像。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：支架生物相容性。F4/80（巨噬细胞、红色色度）和CD3（绿色色度、T淋巴细胞）在第4天的免疫荧光染色显示（A）未受伤的气管和（B）气管中最小的炎症细胞，带PLLA-PCL支架。这与（C） 受伤的气管形成对比， 拉皮纳丙酮增厚， 存在许多细胞，F4/80 和 CD3 染色6。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
成功构建和使用体内药物脱脂支架最关键的步骤是：1） 确定理想药物洗脱率的最佳 PLLA-PCL 比率，2） 确定要洗脱的药物的适当浓度，3） 塑造支架在体内使用血管周围，在LTS感应后，在未造成致命气道阻塞的情况下，将支架横向输送到小鼠体内。
虽然在气道病的动物模型中使用支架进行药物输送的方法有多种，但在病害鼠模型中开发能够药物输送的生物相容支架是首次。在开发这种方法的送药方法时，对该方法进行了一些修改。重要的是要确定适当的PLLA-PCL组合物，用于制造机械刚性足以放入气管的支架，并保留在气管中，尽管存在生理分泌物。PLA-PCL 的 70：30 组成物被确定用于支架构造与血管化成型，因为它可以成功地在预熟的性质中洗去拉帕霉素，在我们的小鼠模型中以安全可靠的方式放置，并且不会在生理上降解条件。此方法的一个困难和可能依赖于制造商的部分是围绕血管的支架成型。最初，在构建体内支架时，将22G血管垫放在玻璃移液器的尖端内，将聚合物溶液倒入血管移液器和玻璃移液器之间的空间中，形成中间的空间。然而，这种方法产生的支架壁通常太薄，无法可靠地放入气管中。目前成型支架的方法对气管的局限性是依赖制造商保持一致性，并且需要一丝不苟地注意细节，以确保支架生产中的同质性。铸造支架之间厚度差异的可能性需要在今后的研究中加以处理。通过进一步研究，我们希望为22G的血管仪设计一个模具，该模具被另一种玻璃或非腐蚀性材料包围，使血管仪和玻璃围盖之间的空间为50 μm，我们确定该支架的壁厚足够。便于放入气管。
使用生物相容性支架研究药物输送到受影响的气管有几个好处。总体而言，由金属或硅胶组成的支架被涂上含有药物的聚合物，已被证明能产生造粒组织和对气管中已经伤痕累累的部分的进一步炎症反应。这种方法，质疑使用完全由生物材料制成的支架，是生物相容性，也释放免疫调节药物以可靠的方式是有利的。PLLA-PCL支架在鼠模型中也证明具有生物相容性，不会引起急性炎症反应。在研究可以对抗纤维化的药物时，使用完全由生物相容性材料组成的支架，如该方法所述的PLLA-PCL是有利的。
使用这种方法构建可用支架的优点和容易性是，PLLA-PCL的组成可以变化，从而允许混在组合物中的药物的释放配置文件的差异。先前对PLLA-PCL材料的研究表明，PLLA-PCL混合物的变化会导致材料进一步降解，从而加快药物释放速度。此外，使用这种方法来构建支架，可以放置在小鼠是有利的，因为大多数气道疾病支架研究是在较大的动物10，11，12。使用鼠标模型，可以修改不同的疾病模式，并允许测试在疾病状态的药物脱毒支架是理想的。在患病状态下测试药物脱毒支架，并能够将其功效与无病动物的疗效进行比较，可以增强实验的严格性。这种方法还显示了如何对气道进行药物脱毒支架的横向放置，而不是以前的研究，即支架是手术植入的。
本研究展示了一个非常有用的平台，用于在小型动物模型中进行支架开发和测试。然而，必须考虑用于人类主体的其他因素。鉴于支架的坚固和刚性，它可能无法通过导引柔性支气管镜放置，但需要与直接喉镜和硬性支气管镜进行横向放置。理想情况下，支架将放置在气道膨胀气球后，以帮助缓解恢复。从患者安全的前景考虑，支架迁移的可能性是一个很大的问题，因为它可能导致危及生命的气道妥协。其次，还必须考虑粘液或血液积累次要的支架阻塞的可能性。需要进一步的测试和开发，以尽量减少这些风险。
未来的研究可以利用这种方法测试PLLA-PCL混合物中的不同药物，以进一步了解不同的免疫抑制治疗如何减轻气管中的疤痕形成。由于这种支架可以放置在小鼠身上，因此也可以测试使用对疤痕形成基因进行遗传修饰的较大小鼠或小鼠。未来的实验还可以包括了解在支架长期植入（3~6个月）后气管的变化，以及气管流明的变化以及炎症标记和纤维化的基因表达特征标记。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
国家卫生研究院耳聋和其他通信障碍研究所，奖励编号为1K23DC014082和1R21DC017225（亚历山大·希勒尔）。这项研究还得到了三科学会和美国外科医生学会（亚历山大·希勒尔）、美国医学会基金会、伊利诺伊州芝加哥（Madhavi Duvvuri）和T32 NIDCD培训赠款（凯文·莫茨）的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
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- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
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