Leukocyte infiltration af Cremaster muskel i mus vurderet af Intravital mikroskopi
Summary
Her viser vi, hvordan man udfører intravital mikroskopi på post-kapillær venules af musen cremaster muskel. Almindeligt anvendt på forskellige modeller af inflammation og sepsis, især dem, der induceres af chemokiner og cytokiner, vi fremhæve dens relevans i studiet af muscoloiatier involverer overdrevet muskuløs leukocyt infiltration.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) er almindeligt anvendt til at overvåge fysiologiske og patofysiologiske processer inden for leukocyt rekruttering kaskade in vivo. Den nuværende protokol repræsenterer en praktisk og reproducerbar metode til at visualisere leukocyte endothelium interaktion fører til leukocyt rekruttering i skeletmuskulatur afledt væv i den intakte organisme af musen. Modellen gælder for alle forskningsområder, der fokuserer på granulocyt aktivering og deres rolle i sygdom.
Vi leverer en trinvis protokol til at guide gennem metoden og til at fremhæve potentielle faldgruber og tekniske vanskeligheder. Protokollen dækker følgende aspekter: eksperimentelle indstillinger og nødvendigt materiale, anæstesi af musen, dissektion af cremaster muskel samt trakeal og carotis cannulation, IVM optagelser og offline analyse. Dataformater som klæbende leukocytter, rullende flux (RF) og rullende flux fraktion (RFF) er forklaret i detaljer og passende applikationer diskuteres. Repræsentative resultater fra dystrophin mangelfuld mdx mus er fastsat i resultatsektionen.
IVM er et effektivt værktøj til at vurdere leukocyt rekruttering i en in vivo indstilling; men delineating for eksempel endotel og leukocyt funktion kan kræve en kombination med ex vivo opsætninger som flow kammer eksperimenter. Desuden kan den genetiske baggrund for dyr af interesse i høj grad påvirke baseline rekruttering, kræver individuel finjustering af den fastsatte protokol. På trods af sine begrænsninger, iVM kan tjene som en platform til let oversætte in vitro resultater i en levende hvirveldyr organisme.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) er et almindeligt anvendt værktøj inden for leukocyt biologi. Leukocyte rekruttering følger en kaskade af veldefinerede begivenheder indledt af leukocyt fange, rullende og vedhæftning til endotelvæggen, og endelig transmigration og extravasation af leukocytter til det faktiske sted for inflammation1. Hvert trin medieres og kontrolleres af forskellige chemokiner (f.eks.2,3 Samspillet mellem forskellige regulerende steder, kontrollerende faktorer og mediatorer af leukocyt rekruttering kaskade som receptor af avancerede glykering slutprodukter (RAGE), intercellulær vedhæftning molekyle 1 (ICAM-1), C-X-C motiv ligand (CXCL)1/2 og deres receptor CXCR2 blev afsløret ved hjælp af IVM4,5,6,7,8,9.
Metoden til IVM er blevet beskrevet for mange forskellige organer og væv såsom tarmen10, hud11, lymfeknuder12, embryonale æggeblomme sæk13 og andre. Men den mest undersøgte metode til IVM er cremaster model, først beskrevet i rotter14. Mens der stadig anvendes i rotter15, metoden er i dag hovedsageligt anvendes i mus på grund af den høje overflod af forskellige transgene linjer. Vores gruppe har for nylig fremhævet den potentielle rolle cremaster IVM inden for inflammatoriske muscolopathies som Duchenne muskelsvind (DMD) studerer dystrophin-mangelfuld mdx mus16. På grund af sin tynde sammenvævede og let tilgængelige fibersammensætning repræsenterer cremaster-musklen den ideelle kandidatmuskel, der skal studeres som en hel mount ved hjælp af lys eller fluorescerende mikroskopi. Leukocyte rekruttering og ekstravasation hovedsageligt finde sted i post-kapillær venules, som let kan identificeres på en kontinuerlig muskuløs lag i cremaster muskel.
Fordelen ved in vivo-billeddannelse sammenlignet med andre in vitro-analyser er dens biologiske kontekst i en levende organisme. Samtidig kan delineating cellespecifikke bidrag til ændret leukocytrekruttering kræve yderligere in vitro-modeller som flowkamre eller endotelaser. Kombinationen af flere metoder vil give mest overbevisende data. Forskere bør være opmærksomme på begrænsningerne i cremaster model som enhver kirurgisk manipulation vil føre til øget leukocyte handel og rekruttering. Derfor er det vanskeligt at vurdere baseline rekruttering med denne metode. På trods af sin brede anvendelse, kan IVM af cremaster være udfordrende og en ny opsætning kan tage tid og ressourcer til at etablere. Vi leverer nu en nem protokol, som vil bidrage til at undgå nogle af de almindelige fejl i IVM. Begrænsninger vil også blive drøftet, og gratis metoder vil blive fremhævet, hvor det er relevant.
IVM af cremaster repræsenterer en ideel tilgang, der skal gennemføres inden for inflammatoriske og smitsomme undersøgelser. Mere specifikt, cremaster model kan være af stor interesse for forskere studerer skeletmuskulatur biologi i forbindelse med inflammatorisk sygdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM som metode er blevet udbredt til at studere forskellige celletyper i forskellige organer og er blevet udførligt beskrevet og drøftet19. Hovedformålet med denne undersøgelse er at give en effektiv tilgang til at oprette og udføre IVM i cremaster muskel. Øve metoden vil producere pålidelige og reproducerbare resultater. Således planlægning og standardisering er vigtige faktorer for at mestre teknikken. Frem for alt er teknikken meget afhængig af hæmodynamiske og mikrovaskulære parame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF) 01GL1746E som en del af PRIMAL Consortium. Forfatterne anerkender Britta Heckmann og Silvia Pezer for dygtig teknisk bistand.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
