Summary
Burada, fare cremaster kasının post-kılcal venüzlerinde intravital mikroskopinin nasıl yapılacağını gösteriyoruz. Yaygın olarak farklı inflamasyon ve sepsis modellerine, özellikle kemokinler ve sitokinler tarafından indüklenenlere uygulanan, abartılı kas lökosit infiltrasyonu içeren muscolopatilerin çalışmasında önemini vurguluyoruz.
Abstract
İntravital mikroskopi (IVM) yaygın olarak lökosit işe kaskad in vivo içinde fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri izlemek için kullanılır. Mevcut protokol, farenin bozulmamış organizması içinde elde edilen iskelet kası dokuda lökosit alımına yol açan lökosit endotel etkileşimini görselleştirmek için pratik ve tekrarlanabilir bir yöntemi temsil eder. Bu model, granülosit aktivasyonuna ve hastalıktaki rollerine odaklanan tüm araştırma alanlarına uygulanabilir.
Yöntemde rehberlik etmek ve olası tuzakları ve teknik zorlukları vurgulamak için adım adım protokol sağlıyoruz. Protokol aşağıdaki hususları kapsamaktadır: deneysel ayarlar ve gerekli malzeme, farenin anestezisi, cremaster kasının diseksiyonu, trakeal ve karotis kanülasyonu, IVM kayıtları ve çevrimdışı analiz. Yapışık lökositler, yuvarlanma akısı (RF) ve yuvarlanma akı fraksiyonu (RFF) gibi veri biçimleri ayrıntılı olarak açıklanmış ve uygun uygulamalar tartışılmıştır. Sonuç bölümünde distrofin eksikliği mdx farelerin indeks sonuçları verilmektedir.
IVM bir in vivo ortamda lökosit işe değerlendirmek için güçlü bir araçtır; ancak, örneğin endotel ve lökosit fonksiyonu için delineating akış odası deneyleri gibi ex vivo kurulumları ile bir kombinasyon gerektirebilir. Ayrıca, ilgi hayvanların genetik arka plan büyük ölçüde sağlanan protokol bireysel ince ayar gerektiren, temel işe etkileyebilir. Sınırlamalarına rağmen, IVM in vitro bulguları yaşayan bir omurgalı organizmaya kolayca çevirmek için bir platform olarak hizmet verebilir.
Introduction
İntravital mikroskopi (IVM) lökosit biyolojisi alanında yaygın olarak uygulanan bir araçtır. Lökosit işe lökosit yakalama tarafından başlatılan iyi tanımlanmış olayların bir çağlayan izler, haddeleme ve endotel duvarına yapışma, ve son olarak transmigration ve inflamasyon gerçek siteye lökosit ekstravazasyon1. Her adım çeşitli kemokinler (örneğin, IL-8/CXCL8), reseptörler (örneğin, LFA-1, Mac-1) ve ilgili endotel hücre adezyon molekülleri (örneğin, ICAM-1, VCAM-1 ve E-Selectin)2,3tarafından aracılık ve kontrol edilir. Farklı düzenleyici sitelerin etkileşimi, kontrol faktörleri ve lökosit işe mediatörleri ileri glisasyon sonu ürünleri (RAGE), hücreler arası adezyon molekülü 1 (ICAM-1), C-X-C motif ligand (CXCL)1/2 ve reseptör CXCR2 ivm4,kullanılarak ortaya çıkarıldı,5,6,7,8,9.
IVM yöntemi bağırsak10gibi birçok farklı organ ve dokular için tarif edilmiştir 10 , deri11, lenf düğümleri12, embriyonik sarısı çuval13 ve diğerleri. Ancak, IVM en yaygın olarak çalışılan yöntem cremaster modeli, ilk sıçanlaraçıklanan 14. Hala sıçanlarda kullanılırken15, yöntem günümüzde ağırlıklı olarak farklı transgenik çizgilerin yüksek bolluğu nedeniyle farelerde uygulanmaktadır. Grubumuz son zamanlarda duchenne Musküler Distrofi (DMD) distrofin eksikliği mdx fareler16çalışma gibi inflamatuar muskolopatiler alanında cremaster IVM potansiyel rolü vurgulamıştır. İnce iç içe geçmiş ve kolayca erişilebilen lif bileşimi sayesinde, cremaster kas ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak bir bütün montaj olarak çalışılması için ideal aday kas temsil eder. Lökosit işe alma ve ekstravazasyon esas olarak post-kılcal venüller yer alır, hangi kolayca cremaster kas sürekli bir kas tabakası üzerinde tespit edilebilir.
In vivo görüntülemenin diğer in vitro tahlillere göre avantajı, canlı bir organizmadaki biyolojik bağlamıdır. Aynı zamanda, değiştirilmiş lökosit işe hücre özel katkıları delineating akış odaları veya endotel tahlilleri gibi ek in vitro modeller gerektirebilir. Birden çok yöntemin birleşimi en ikna edici veri verecektir. Herhangi bir cerrahi manipülasyon artmış lökosit ticareti ve işe yol açacaktır gibi bilim adamları cremaster modelinin sınırlamaları farkında olmalıdır. Bu nedenle, temel işe bu yöntem ile tahmin etmek zordur. Geniş uygulamasına rağmen, cremaster IVM zor olabilir ve yeni bir kurulum kurmak için zaman ve kaynak alabilir. Şimdi IVM bazı yaygın hataları önlemek için yardımcı olacak kolay bir protokol sağlar. Ayrıca, sınırlamalar tartışılacak ve uygun olduğu durumlarda ücretsiz yöntemler vurgulanacaktır.
Kremaster IVM inflamatuar ve enfeksiyöz çalışmalar alanında uygulanacak ideal bir yaklaşım temsil eder. Daha spesifik olarak, cremaster modeli inflamatuar hastalık bağlamında iskelet kas biyolojisi okuyan bilim adamları için yüksek ilgi olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg'de kontrollü ve spesifik patojensiz koşullar altında barındırıldı. Burada açıklanan tüm prosedürler yerel IRB ve Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Almanya tarafından onaylanmıştır.
1. Anestezi uygulaması
- 125 mg/kg ketamin ve 12.5 mg/kg ksilazin intraperitoneal (i.p.) bolus enjeksiyonu ile fareyi anestezi edin.
- Farenin vücut Sıcaklığını korumak için fareyi ısıtma yastığına dorsal recumbent pozisyonunda yerleştirin ve düzeltin (36.5-38 °C). Ön dişlerin etrafında basit bir döngü yüzevetmek ve sütürün birleştirme uçlarını ısıtma yastığına bantlamak için emilmeyen bir steril dikiş (6/0) kullanın. Bu fiksasyon, solunumda rahatsızlık lanmaması için ağzı açık tutmayı amaçlar.
- Interdigital parmak ucutu ile uygun anestezi derinliği için fareyi kontrol edin (çekilme görülmemelidir).
- Yeterli anesteziye ulaşıldıktan sonra cerrahi hazırlık için devam edin. Devam eden deney boyunca anesteziyi tekrar tekrar onaylayın her 30 dk. Gerekirse yukarıda açıklandığı gibi ilaçları yeniden uygulayın.
- Fizyolojik tuz çözeltisini (PSS, bileşim: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3)%5 CO2/95% N2 ile 15 dakika boyunca dengeleyin. Deney boyunca PSS'yi %5 CO2/95 N2 ile sürekli kabarcıklayın ve 37 °C'de tutun.
2. Trakea ve karotis arterin cerrahi hazırlanması (isteğe bağlı)
- Orta hattacıcılarla deriyi hafifçe çekerek boyun bölgesinden deriyi inceleyin. Cerrahi hazırlık için yeterli alan vermek için çapı 1-2 cm dairesel bir kesim uygulamak için makas kullanın.
- Dikkatle cımbız kullanarak çevreleyen kas, yağ ve bağ dokuları incelemek.
- Küçük cerrahi makas kullanarak trakeaiçine enine bir kesim (~ 1,3 mm) yapın ve üst hava yollarını güvenli hale getirmek için trakeanın kaudal ucunda ki polietilen tüpü (I.D x O.D. 0.034 x 0.050") takın.
- Trakeada bulunan tüpü tek bir dairesel düğüm sütürle (6/0 USP) sabitler.
- Trakeanın sağ tarafı boyunca karotis arteri bulun ve karotis arter duvarından çevredeki dokuyu inceleyin. Alternatif olarak, juguler veya aynı zamanda kuyruk damarı i.v. erişim için kullanılabilir. Yakından bulunduğu gibi vagal sinir yaralanmasını önlemek için deneyin.
- Karotis arterin altında iki parça sütür (6/0) geçirin. İlk kraniyal sütür proksimal yerleştirin, karotis arterlerin bifurkasyon yakın ve kalıcı olarak kravat. İkinci dikiş ilkinden yaklaşık 5-8 mm distal bulunacak ve daha sonra karotis arter tüp güvenli kullanılacaktır. Henüz bağlama.
- Uç kısmı tuzlu (%0,9 NaCl) dolu 1 mL şırınga iğnesine bükerek 30 cm uzunluğunda polietilen bir tüp (I.D x O.D. 0.011" x 0.024") hazırlayın. Titiz yıkama hazırlık sırasında hava embolizasyonu önlemek için önemlidir.
- İkinci sütürşah arter distal kelepçe için 7 mm damar klipsi kullanın.
- Karotis arterde küçük bir enine kesim (~0,5 mm) yapın ve steril polietilen tüpü tanıtılın. Daha önce hazırlanan ikinci sütür kullanarak arter tüp güvenli.
- Damar klibini çıkarın ve polietilen tüpe bağlı şırıngaya hafifçe biraz gerginlik uygulayın. Bu karotis kateter artık ilaç vermek veya gerekirse kan örneği almak için kullanılabilir, hatta ilgili cihazlar ile kan basıncı veya nabız oranının izlenmesi mümkündür.
3. Cremaster kas cerrahi hazırlık
- Isıtma yastığıüzerindeki fareyi (ısıtma yastığı ile birlikte) daha sonra mikroskopi için sahneyi tutan özel yapım plastik çerçeveye aktarın. Mikroskop aşamasına bakan testis torbası ile fareyi yönlendirin.
- Devam etmeden önce anesteziderinliğini yeniden değerlendirin; gerekirse dörtte bir ila yarım doz anestezi uygulayın.
- Skrotum lokalize, cımbız kullanarak en distal kısmında tutarak, yavaşça çekin ve çapı yaklaşık 5 mm ile skrotal deri dairesel bir bölümünü kesti. Cremaster kas gibi altta yatan yapılara zarar vermemeye özen Açık dokuyu tuzlu çözelti ile iyice sulu tuttuğundan emin olun.
- İki cımbız kullanarak gevşek bağ dokusunu inceleyin ve her iki testisi de yerelleştirin.
- Bir testis distally tutun ve yavaşça dışarı çekerek başlamak, adım adım çevreleyen bağ dokusu kaldırarak.
- Testis dışa doğru çıktıktan sonra distal ucunu sahneyi çevreleyen kauçuk halkaya sabitle. Dışlaştırma üzerine, tüm süreç boyunca tuzlu çözelti ile doku nemlendirin.
- Kritik adım: Dikkatle altta yatan cremaster kas zarar vermeden bağ dokusu kaldırın. Aşırı bağ dokusu daha sonra mikroskopi de görme engelleyebilir ve bulanık görüntüler üretebilir.
- Testisin distal kısmını aşağı sabitle ve cremaster kasını küçük bir enine kesim (yaklaşık 1 mm) ile açın, ardından çok distalden proksimal uca kadar uzunlamasına kesi. Sonuç olarak cremaster kas sherically açılmalıdır. Makroskopik olarak görülebilen damar kesilmemelidir, çünkü bu hemodinamik etkileyebilir.
- Dikkatle cam sahne üzerinde kas yayıldı ve kauçuk halka ya pin. Mikroskopi burada yapılacağı için merkezi bölgeye dokunmamaya veya zarar vermemeye özen göstermektedir.
Dikkat: Aşırı esneme kan akışını engelleyebilir. - İlgi çekici bölgeye erişim sağlamak için kalan testis'i bir kenara sabitle. Kurutmayı önlemek için PSS ile tekrar tekrar nemlendirin. Monte edilen kas şimdi mikroskopi için hazırdır.
4. İntravital mikroskopi
- Dik mikroskop monte cremaster kas yerleştirin ve 40x amacı kullanarak mikroskopi gerçekleştirin.
- Yüksek iş çıkışlı görüntüleme spektrografisi kullanarak veri edinin ve dışa aktarın.
- Önceden ısıtılmış (35-37 °C) PSS17ile sürekli süperfüzyon altında kayıt gerçekleştirin. PsS'nin kas dokusuna sürekli damlama sını sağlamak için mikroskobun dik hedefine bantlanmış küçük bir tüple süperfüzyon uygulayın.
- Post-kılcal venülleri (iki küçük damarın birleşmesi) belirleyin ve 20-40 μm çapında venüller üzerindeki mikro sirkülasyonu ölçün.
- 30 s bir zaman aralığında cremaster kas mikrosirkülasyon yüksek çözünürlüklü görüntüleri kaydedin. Kayıt sırasında kas dokusunda hafif bir kasılma ve gevşeme olabileceğinden, odağı sürekli olarak ayarladıklarından emin olun. Genellikle, fare yaklaşık 2 saat boyunca kararlı sirkülasyon sergileme eğilimindedir. Farklı bölgelerden farklı gemilerin çeşitli kayıtlarını elde etmek mümkündür. Bir veya her iki testis daha sonra kullanılabilir.
NOT: Bu inflamasyon bir model olduğu gibi, indüksiyon ortak yolları şunlardır: sistemik uygulama veya pro inflamatuar mediatörler inskrotal enjeksiyon yanı sıra örneğin N-Formylmethionyl-lucyl-fenillalanine (fMLP) ile superfüzyon. Lokal TNF-α stimülasyon genellikle lökosit işe tetiklemek için kullanılır; LPS'ye bağlı endotoksemi SIRS şiddetli sistemik inflamasyon modelidir.
5. Lökosit görselleştirme
NOT: Yapışık ve haddeleme lökositleri daha fazla görselleştirme olmadan kolayca görülebilir. Serbestçe hareket eden lökositlerin merkez hat hızını belirlemek için diferansiyel boyama yapın.
- EGFP etiketli fareler kullanılıyorsa, bunları doğrudan floresan mikroskobu ile analiz edin.
- EGFP etiketli olmayan fare suşları için rodamin boyama kullanın.
- Rhodamine 6G'yi 0.2 mg/kg vücut ağırlığında uygulayın. Yeterli boyama yoğunlukları elde etmek için tekrarlanan dozlarda gerekebilir. Daha büyük hacimler hemodinamik parametreleri etkileyebileceğinden, küçük hacimleri sakladığından emin olun.
- Lökositlerin anında boyanışı için, karotis arter üzerinden leke uygulayın. Karotis arter diseksiyonu yapılmamışsa, aynı doz18kullanılarak i.p. uygulaması ile yeterli boyama sağlanabilir. Karotis arter kateterizasyonuna alternatif olarak başka bir venöz kateterizasyon yapılabilir.
NOT: Rhodamine boyamanın, eGFP etiketlemenin aksine, floresan şiddetinde zaman çürümesinin yanı sıra yüksek konsantrasyonlarda lökositlerin maksimum %80'inin genel olarak boyandığını gösterdiğini unutmayın. - Floresan mikroskopi ile serbestçe hareket eden rhodamine lekeli lökositleri görselleştirin.
6. Deney sonu
NOT: Bu protokolü gerçekleştirmek için genel tahmini süre 90 -150 dakika olmalıdır.
- Servikal çıkış la ötenazi ile deneyi sonlandırın.
- Transmigration gibi daha fazla analiz için, pfa'daki kremaster kaslarını düzeltin ve sahnede uzatılırken ve gerektiğinde histoloji için lekeliyken.
7. Çevrimdışı analiz
- Video oynatma sırasında aşağıdaki parametreleri basit sayımlar olarak analiz edin.
- Yuvarlanma akını hesaplama [sayı/dk]: hayali bir çizgi/dk geçen yuvarlanan hücre sayısı
- Yapışmayı hesaplayın [sayı/mm2]: görüş alanı içindeki damar duvarına yapıştırılan hücre sayısı ≥ 30 s/vasküler yüzey [mm2].
- Aşağıdaki hemodinamik ve mikrovasküler parametreleri ölçmek ImageJ kullanılarak ölçülür.
- İç duvar çapı olarak damar çapı [μm] hesaplayın.
- Geminin orta çizgi uzunluğu olarak gemi uzunluğunu [μm] hesaplayın.
- Merkez satırda
serbestçe hareket eden lökositlerin kare kare video analizinden elde edilen merkez çizgi hızını hesaplayın.
- Aşağıdaki denklemleri bir tahmin olarak kullanın.
- Vasküler yüzeyi [mm2]'de hesaplayın: damar uzunluğu [μm] x damar çapı [μm] x π x 10-6.
- Duvar kesme hızını
hesaplayın : 4,9 x (8 x merkez hattı hızı x 0,625/damar çapı [μm]). - Ortalama kan akış hızını hesaplayın : merkez çizgi hızı x 0,625.
- Toplam lökosit akı
hesaplamak : sistemik 
lökosit sayısı x (ortalama kan akımı hızı 
x 60/1000) x π x . - Yuvarlanma akı fraksiyonu [%]: yuvarlanma akısı/toplam lökosit akısı x 100.
serbestçe hareket eden lökositlerin kare kare video analizinden elde edilen merkez çizgi hızını hesaplayın.
hesaplayın : 4,9 x 
hesaplamak : sistemik 
lökosit 
x 60/1000) x π x .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVM sağlanan protokol uyarınca iskelet kası lökosit işe çağlayan içine benzersiz anlayışlar verecektir. Sonuçlar bölümünde IVM tarafından elde edilen tipik sonuçlar üzerinde durulacak ve karşılaşılabilecek olası sorunları vurgulayacaktır.
İntravital mikroskopi için deneysel kurulum Şekil 1'deözetlenmiştir. Cremaster kas hazırlanması ve bağ dokusunun çıkarılması tek tip bir yüzey ile odaklanmış mikroskobik görüntüler elde etmek için çok önemlidir. Aşırı bağ dokusu sonunda bulanık mikroskobik görüntülere yol açar(Ek Video 1) IVM yaparken. Şekil 2, IVM kullanılarak elde edilebilen temsili mikroskobik görüntüleri göstermektedir. İlk olarak, çapı 20-40 m arasında olması gereken post-kılcal venüller, iki küçük damarın birleşmesi ile tanımlanır. Sadece yapışık ve yuvarlanan lökositler görselleştirilebilir, dolaşımdaki lökositler sadece kaydedilen videoların yavaş çekim tekrarında izlenebilir. Yapışık lökosit sayısı 30 saniyelik bir süre içinde sabit lökosit olarak tanımlanır ve damar yüzeyinin mm 2 başına ifade edilir(Şekil2). Geminin daha önce tanımlanmış bir kesitini geçen yuvarlanan lökosit sayısı sayılır; haddeleme hızları çevrimdışı analizde elde edilebilir. Yuvarlanma akısı (RF = önceden tanımlanmış bir çizgi/dk üzerinde yuvarlanan hücre sayısı) veya yuvarlanma akı fraksiyonu olarak ifade edilebilir (RFF in % = RF/total lökosit ler damardan geçer). RF dolaşımdaki hücrelerin sayısına son derece bağlıdır, RFF ise beyaz kan hücresi sayılarında (WBCs) değişikliklerden daha az etkilenir. Birçok durumda lökosit yapışma ve haddeleme ters ilişkili olduğunu unutmayın; yapışık lökositlerin yüksek sayıda serbestçe dolaşan hücrelerin havuzunu azaltabilir ve böylece lökosit haddeleme nemlendirebilir.
Teknik zorluklar ve potansiyel tuzaklar
Cremaster kas testis içine ve küresel bir yapı yığlar. Kasın kayıt aşamasına monte edilebilmek için küreyi açmak için uzunlamasına bir kesi gereklidir. Küçük damarlar kopabileceğinden bu durum genel mikrovaskülatürü etkileyebilir. Değişmiş kan akışını önyargı önlemek için, yeniden sipariş için merkezi alanı seçmek için tavsiye edilir. Bu alana ne dokunulmalı ne de manipüle edilmelidir. Ayrıca, mikrokoter kanama ve mikrovasküler hemodinamik değişiklikleri önleyebilir. Çevreleyen kılcal damarların kan akışı genellikle etki alanı ilgi alanı içinde hazırlık nedeniyle etkilenirse değerli bir ipucu sağlar. Genel olarak, daha proksimal damarlar (farenin vücuduna doğru) daha iyi mikrosirkülasyon göstermek eğilimindedir, ancak görüntü yakalama artan hareket ve hayvanın nefes kaynaklanan bozukluklar tarafından karmaşık olabilir.
Mikroskobik kayıt sırasında cremaster kasının kurumasını önlemek için dokunun kalıcı süperfüzyonu çok önemlidir. Yetersiz veya kesintiye uğramış nemlendirme, dokunun kurumasına ve deneyin başarısızlığa uğramaya neden olur.
Cremaster doku sabitleme gerilmiş ve yerinde tutmak için gereklidir. Burlanmış kas düzleştirmek için, nazik germe gereklidir. Çok az esneme, mikroskobu zorlaştıran düzensiz doku, aşırı germe kan akışını kısıtlar ve dokuzarar verir. Yine kılcal kan akımı dokunun genel dolaşım durumu güvenilir bir durum sağlar. Doku montajı nda germe derecesini belirlemek için deneyim ve pratik gereklidir.
Uzun hazırlık süreleri organizmanın genel inflamatuar durumunu ve önyargı verilerini etkileyecektir. Bu nedenle, deneyi tasarlarken ilgi sorununa odaklanıp hazırlık sürelerini gerektiği kadar kısa tuttuğundan emin olun. Hiçbir ilaç uygulaması, monitör veya kan testleri cremaster doku tekil bir hazırlık gerekli ise yeterli olabilir.
Çoğu ortamda, farklı deneysel gruplar vahşi tip hayvanlarla karşılaştırılacaktır. Hemodinamik ve mikrovasküler parametrelerin deney grupları arasında benzer olduğundan emin olmak çok önemlidir(Tablo 1). Çok sayıda parametre, kardiyak çıkış, damar çapı, merkez hat hızı, duvar kesme hızı ve sirkülasyon lökosit sayısı da dahil olmak üzere in vivo lökosit alımını etkileyebilir. Tablo 1 iki farklı transgenik fare çizgisinden, distrofin eksik mdx faresinden ve lys-eGFP faresinden (nötrofiller ve makrofajlarda lys promotörü altında eGFP ifade eden) verileri görüntüler. Damar çapı gibi parametreler araştırmacı tarafından kontrol edilebilirken, merkez çizgisi hızı ve kesme hızı bireysel deney grubunun hemodinamiklerine veya fare zorlanmalarına bağlıdır. Açıkça, merkez çizgisi hız ve duvar kesme oranı mdx ve lys-eGFP fareler(Tablo 1)arasında anlamlı olarak farklı olan IVM verilerinin anlamlı bir karşılaştırmasını imkansız hale getirerek (Welch'in düzeltmesi ile t-testi ile istatistiksel analiz, önem P < 0.05 olarak belirlenmiştir). Merkez hızı kardiyak çıkış, periferik vasküler direnç ve intravasal hacim den etkilenir. Örneğin, karotis kateter ile verilen rhodamine veya başka bir deneysel madde nin büyük bir hacim likülatör merkez hattı hızını artırır ve lökosit yakalama ve haddeleme inhibe(Ek Video 2). Aksine, kardiyak yetmezlik, derin anestezi veya hipotermi post-kılcal akışı azaltabilir. Anlamlı sonuçlar çıkarmak ve önyargıyı azaltmak için IVM verilerinin çevrimdışı analizine yaklaşmadan önce, anlamlı sonuçlar alabilmek ve önyargıyı azaltmak için veri kalitesi gereksinimleri (örneğin fizyolojik aralıklar içindeki hemodinamik parametreler) tanımlanmalıdır.
Merkez çizgisinin hızını belirlemek için serbestçe dolaşan lökositlerin görselleştirilmesi gerekir. Floresan lökositler (lys-eGFP farelerde olduğu gibi) kullanılabilir veya lökositler rhodamine gibi floresan reaktiflerle boyalanmalıdır (Şekil 3). Rhodamine karotis kateter veya i.p. enjeksiyonu ile uygulanabilir. Rhodamine yavaş yavaş diğer hücre tipleri tarafından da alınır bu yana, dozaj ve zaman bir titrasyon esastır. Aşırı dosing ve uzun aralıklarla mikroskopi sırasında önemli arka plan üretecektir.
Son olarak, farklı fare suşlarının biyolojik çeşitliliğine dikkat çekmek isteriz. Genetik olarak değiştirilmiş suşların yanı sıra, genel olarak kabul edilen yabani tip suşlar fizyolojik varyans gösterebilir. Şekil 4, yaygın olarak kullanılan siyah 6 (C57BL/6) ile siyah 10 (C57BL/10ScSn) fareleri karşılaştırır. Siyah 6 fare, her iki suş da yabani tip olarak anılacaktır olsa da, lökositlerin siyah 10 fareye göre gelişmiş yuvarlanma, yapışma ve transmigration olduğunu açıkça göstermektedir (Tukey'nin post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA ile istatistiksel analiz; p < 0.05 olarak belirlenmiştir). Bu nedenle, doğru genetik arka plan düşünülmelidir, özellikle transgenik fareler kullanırken. Deneysel ayarımızda, siyah 6 fare ve transgenik mdx farenin (siyah 10 arka plan) karşılaştırılması, distrofin eksikliği olan mdx farelerinin geliştirilmiş inflamatuar durumunu doğru siyah 10 yabani tip arka plan üzerinde gizler (Şekil 4).
Şekil 1: Cremaster kas üzerinde IVM şematik deneysel kurulum. Anesteziden sonra trakea kanüle edilir ve karotis artere bir kateter yerleştirilir. Cremaster kas maruz kalır ve ışık mikroskobu veya floresan mikroskop kullanarak dik bir mikroskop üzerinde intravital mikroskopi için hazırlanır. Videolar daha sonra çevrimdışı çözümleme için elde edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İntravital mikroskopiden ardışık çerçeveli post-kılcal venüle segmenti. Sol sütun ışık mikroskobik görüntüler gösterir, daha iyi görselleştirme için damar noktalı çizgilerle özetlenmiştir. Venule konfluent kaplar (kırmızı yıldızlarla işaretlenmiş) ve <40 m damar çapı ile tanımlanır. Sağ sütunda, kırmızı lökositleri gösteren, karşılık gelen sol görüntünün şematik bir gösterimi gösterilmiştir. İlk dört satır, zaman içinde aynı geminin ardışık görüntülerini gösterir. Alt sıra yapışık lökositleri gösterir. Şematik gösterimde, bireysel lökositler ve yuvarlanma mesafesi işaretlenir. Milimetre başına çevrimdışı analizde, yuvarlanma akısı ve yuvarlanma hızı hesaplanabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Haddeleme lökositleri floresan belirteçlerin transgenik ekspresyonu veya rhodamine ile ikincil boyama ile görüntülenebilir. EGFP lökositve rhodamine etiketli lökositlerin n = 3'er hayvandan lökosit alımının temsili mikroskobik görüntüleri. LYS-eGFP transgenik farelerden lys promotörü altında eGFP ifade eden yuvarlanan nötrofiller immünororesans mikroskopi (sol kolon) ile doğrudan tespit edilebilir. Floresan yapıcıiçermeyen lökositler intravenöz veya rodamin intraperitoneal enjeksiyon (sağ kolon) ile boyanabilir. Özellikle, rhodamine sadece nötrofiller tarafından alınan değil, önemli ölçüde daha fazla arka plan veren. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı transgenik ve yabani tip fare suşlarında lökosit alımının karşılaştırılması. (A) Yuvarlanan akı fraksiyonu, (B) yapvit ve (C)lökosit transmigration siyah 6 (C57BL/6J), siyah 10 (C57BL/10ScSnJ) ve mdx fareler (C57BL/10ScSn-Dmdx J) arasında karşılaştırıldığında ortalama + SEM. Siyah 6 fareler siyah farelere göre gelişmiş lökosit gösterir.mdx Benzer şekilde, mdx fareler siyah 10 ile karşılaştırıldığında daha fazla işe sahip, ancak siyah 6 yabani tip fareler ile karşılaştırıldığında değil. Bu veriler doğru genetik kontrollerin tahsisinin önemini göstermektedir. Grup başına en az n = 3 hayvandan elde edilen veriler. Tukey'in post-hoc analizi ile tek yönlü ANOVA ile istatistiksel analiz. Önemi P < 0.05 olarak belirlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Fare tuş | №. farelerin | №. venules venules | Damar çapı | Merkez çizgisi hızı | Duvar kesme oranı | Sistemik WBC |
| N | n | Μm | μm/s | s-1 | /μl | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 ± 4 | 1150 ± 50 | 1010 ± 100 | 5200 ± 300 |
| lys-eGFP | 3 | 15 | 27 ± 2 | 2220 ± 90 | 2030 ± 90 | 5800 ± 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
Tablo 1: İki farklı transgenik fare hattından ilgili hemodinamik ve mikrovasküler parametreler. Distrofin ve lys-eGFP farelerden yoksun mdx fareleriçin damar çapı, merkez hat hızı, duvar kesme hızı ve sistemik WBC'ler görüntülenir. Bu örnekte mdx fareler (C57BL/10J, siyah 10 arka plan) ve lys-eGFP fareler (C57BL/6J, siyah 6 arka plan) istatistiksel olarak farklı merkez çizgisi hızı ve duvar kesme hızı gösterir ve IVM kullanılarak karşılaştırılmamalıdır. Grup başına en az n = 3 hayvandan alınan örnek veriler ortalama ± SEM olarak sunulur. Önemi P < 0.05 olarak belirlenmiştir.
Ek Video 1: Cremaster kas üzerinde bağ dokusunun yetersiz çıkarılması mikroskobik etkisi. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (Indirmek için sağ tıklayın).
Ek Video 2: Hipervolemi veya hipotansiyon ile kan akışını değiştirdi. Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (Indirmek için sağ tıklayın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IvM bir yöntem olarak yaygın olarak farklı organlarda farklı hücre tipleri çalışma için kullanılan ve yaygın olarak tarif edilmiş ve tartışıldı19. Bu çalışmanın temel amacı, cremaster kas ivm kurmak ve gerçekleştirmek için etkili bir yaklaşım sağlamaktır. Yöntemin pratik güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretecektir. Bu nedenle, planlama ve standardizasyon tekniği ana için önemli faktörlerdir. Her şeyden önce, teknik çok yakından izlenmesi ve kontrol edilmesi gereken hemodinamik ve mikrovasküler parametreler, bağlıdır. Bu nedenle, gruplar arasında farklı hemodinamik yanıltıcı sonuçlar verecektir.
Fizyolojik ve patolojik durumların incelenmesindeki rolüne rağmen, IVM tek başına belirli hücre tiplerinin inflamasyonda lökosit alımına bireysel katkısını tamamen çözemeyebilir. Bunu yapmak için, diğer tamamlayıcı yöntemler IVM ile kombine edilebilir. Örneğin, akış odası deneyleri gibi ex vivo yöntemleri endotel veya lökosit etkileri arasında çizgi olabilir. Ayrıca, akış odaları insan lökositler için kemirgen bulguları çevirmek için mükemmel kurulumları vardır, örneğin yeni doğan bebeklerde20. Ayrıca, FACS veya immünohistokimya gibi in vitro yöntemler IVM deneylerini tamamlamalıdır. Her yöntem, çok az kafa karıştırıcı etkenle birlikte denetitilmiş bir ortamdan edinilen belirli bilgileri ekleyebilir.
Burada sunulan travmatik kremaster hazırlık mümkün olduğunca yakından inflamasyon fizyolojik temel koşulları benzer. Ancak, zorunlu cerrahi hazırlık kendisi inflamasyon bir uyarıcı, hangi yorumlanması için dikkate alınması gereken. Cremaster doku Farmakolojik TNF stimülasyonu travmatik cerrahi uyarıcı16ötesinde inflamatuar işe artırmak için ek bir mod sağlayabilir. Ayrıca, farklı fare suşları standart uyaranlara karşı değiştirilmiş tepkiler gösterebilir. Biz bile ortak yabani tip suşları lökosit işe farklı temel devletler sergileyebilir göstermiştir. Bu, doğru genetik denetimler atamanın ve deneyleri planlarken yeni deney grupları için temel veriler oluşturmanın önemini gösterir. Transgenik suşlar bu gün son derece bol olduğundan, aynı suşları bile üreme bağlı olarak zaman içinde farklı olabilir muhtemeldir.
Birlikte ele alındığında, IVM farenin biyolojik bağlamında lökosit işe izlemek için güçlü bir araçtır ve ex vivo ve in vitro teknikleri ile birlikte olmalıdır. Ayrıca, cremaster IVM belirli hücre boyama, inflamatuar stimülasyon veya farmakolojik manipülasyon ve ön tedavi de dahil olmak üzere farklı modları çeşitli sağlar. Bu nedenle, özellikle inflamasyon alanında ve özellikle inflamatuar kaslarda farklı farmakolojik aracıların ve bunların biyolojik etkilerini klinik öncesi çalışmalarda değerlendirmek için bir platform görevi görebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Almanya Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (BMBF) 01GL1746E tarafından PRIMAL Konsorsiyumu'nun bir parçası olarak desteklenmiştir. Yazarlar britta Heckmann ve Silvia Pezer usta teknik yardım için kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
