Summary
Qui, mostriamo come eseguire la microscopia intravitale sulle venule post-capillari del muscolo cremaster del topo. Comunemente applicati a diversi modelli di infiammazione e sepsi, in particolare quelli indotti da chemiochine e citochine, sottolineiamo la sua rilevanza nello studio delle muscolopatie che coinvolgono infiltrazioni muscolari esagerate.
Abstract
La microscopia intravitale (IVM) è ampiamente utilizzata per monitorare i processi fisiologici e patofisiologici all'interno della cascata di reclutamento di leucociti in vivo. Il protocollo attuale rappresenta un metodo pratico e riproducibile per visualizzare l'interazione con l'endotelio leucocito che porta al reclutamento di leucociti nel tessuto derivato dal muscolo scheletrico all'interno dell'organismo intatto del topo. Il modello è applicabile a tutti i campi di ricerca che si concentrano sull'attivazione dei noulociti e sul loro ruolo nella malattia.
Forniamo un protocollo passo dopo passo per guidare attraverso il metodo e per evidenziare potenziali insidie e difficoltà tecniche. Il protocollo copre i seguenti aspetti: impostazioni sperimentali e materiale richiesto, anestesia del topo, dissezione del muscolo cremaster così come cannulation tracheale e carotide, registrazioni IVM e analisi offline. Formati di dati come leucociti aderenti, flusso di rotolamento (RF) e frazione del flusso di rotolamento (RFF) sono spiegati in dettaglio e vengono discusse le applicazioni appropriate. Risultati rappresentativi da topi mdx carenti distrofina sono forniti nella sezione risultati.
IVM è un potente strumento per valutare il reclutamento di leucociti in un ambiente in vivo; tuttavia, delineare ad esempio la funzione endoteliale e leucocito può richiedere una combinazione con configurazioni ex vivo come esperimenti di camera di flusso. Inoltre, il background genetico degli animali di interesse può influenzare notevolmente il reclutamento di base, richiedendo la messa a punto individuale del protocollo previsto. Nonostante i suoi limiti, IVM può servire come piattaforma per tradurre prontamente i risultati in vitro in un organismo vertebrato vivente.
Introduction
La microscopia intravitale (IVM) è uno strumento comunemente applicato nel campo della biologia del leucocito. Il reclutamento di leukociti segue una cascata di eventi ben definiti iniziati dalla cattura del leucocito, dal rotolamento e dall'adesione al muro endoteliale, e infine dalla trasmigrazione e dall'estramigrazione dei leucociti nel sito effettivo di infiammazione1. Ogni passo è mediato e controllato da varie chemiochine (ad esempio, IL-8/CXCL8), recettori (ad esempio, LFA-1, Mac-1) e molecole di adesione delle cellule endoteliali corrispondenti (ad esempio, ICAM-1, VCAM-1 ed E-Selectin)2,3. L'interazione di diversi siti normativi, fattori di controllo e mediatori della cascata di reclutamento di leucociti come recettore dei prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE), della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1), del motivo C-X-C ligando (CXCL)1/2 e del loro recettore CXCR2 sono stati scoperti utilizzando IVM4,5,6,7,8,9.
Il metodo di IVM è stato descritto per molti organi e tessuti diversi come l'intestino10, pelle11, linfonodi12, il sacco di tuorlo embrionale13 e altri. Tuttavia, il metodo più studiato di IVM è il modello cremaster, descritto per la prima volta nei ratti14. Mentre ancora utilizzato nei ratti15, il metodo è oggi applicato principalmente nei topi a causa dell'alta abbondanza di diverse linee transgeniche. Il nostro gruppo ha recentemente evidenziato il potenziale ruolo del cremaster IVM nel campo delle muscolopatie infiammatorie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) che studiano topi immdxliti carenti di distrofina16. Grazie alla sua sottile composizione in fibra intrecciata e facilmente accessibile, il muscolo cremante rappresenta il muscolo candidato ideale da studiare come intero supporto utilizzando microscopia leggera o fluorescente. Il reclutamento e l'estravlocazione dei leonici avvengono principalmente in venule post-capillari, che possono essere facilmente identificate su uno strato muscolare continuo nel muscolo cremante.
Il vantaggio dell'imaging in vivo rispetto ad altri saggi in vitro è il suo contesto biologico in un organismo vivente. Allo stesso tempo, delineare contributi specifici per le cellule al reclutamento alterato dei leucociti può richiedere ulteriori modelli in vitro come camere di flusso o saggi endoteliali. La combinazione di più metodi produrrà i dati più convincenti. Gli scienziati dovrebbero essere consapevoli dei limiti del modello cremaster in quanto qualsiasi manipolazione chirurgica porterà ad un aumento del traffico e del reclutamento dei leucociti. Di conseguenza, l'assunzione di base è difficile da stimare con questo metodo. Nonostante la sua ampia applicazione, IVM del cremaster può essere impegnativo e una nuova configurazione può richiedere tempo e risorse per stabilire. Ora forniamo un protocollo facile che aiuterà a evitare alcuni degli errori comuni in IVM. Inoltre, le limitazioni saranno discusse e i metodi gratuiti saranno evidenziati ove applicabile.
IVM del cremaster rappresenta un approccio ideale da attuare nel campo degli studi infiammatori e infettivi. Più specificamente, il modello cremaster può essere di grande interesse per gli scienziati che studiano la biologia muscolare scheletrica nel contesto delle malattie infiammatorie.
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Protocol
Gli animali erano ospitati in condizioni controllate e specifiche prive di agenti patogeni presso l'IBF (Interfakult're Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dall'IRB locale e dal Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Germania.
1. Amministrazione dell'anestesia
- Anestesizzare il topo mediante iniezione di bolus intraperitoneale (i.p.) di 125 mg/kg di ketamina e 12,5 mg/kg di xilosina.
- Posizionare e fissare il mouse in una posizione recumbent dorsale su un pad di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea del mouse (36,5-38 gradi centigradi). Utilizzare una sutura sterile non assorbibile (6/0) per avvolgere un semplice anello intorno ai denti frontali e nastro le estremità di giunzione della sutura al pad di riscaldamento. Questa fissazione mira a mantenere la bocca aperta al fine di evitare disturbi nella respirazione.
- Controllare il mouse per la profondità appropriata di anestesia da pizzico di punta interdigitale (ritiro non dovrebbe essere visto).
- Una volta raggiunta l'anestesia sufficiente procedere alla preparazione chirurgica. Confermare ripetutamente l'anestesia lungo l'esperimento in corso ogni 30 min. Ri-somministrare i farmaci come descritto sopra se necessario.
- Soluzione salare fisiologica Equilibrate (PSS, composizione: 132 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgS04, 2,0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3)con 5% CO2/95% N2 per 15 minuti. Bolle continuamente PSS con 5% CO2/95% N2 durante l'esperimento e mantenere a 37 gradi centigradi.
2. Preparazione chirurgica della trachea e dell'arteria carotide (opzionale)
- Dissezionare la pelle dalla zona del collo tirando delicatamente la pelle con una pinzetta nella linea mediana. Utilizzare le forbici per applicare un taglio circolare di 1-2 cm di diametro per dare spazio sufficiente per la preparazione chirurgica.
- Sezionare attentamente il muscolo circostante, i tessuti grassi e connettivi usando le pinzette.
- Fare un taglio trasversale (1,3 mm) nella trachea utilizzando piccole forbici chirurgiche e introdurre un tubo di polietilene (I.D x O.D. 0.034" x 0.050") all'interno dell'estremità caudale della trachea per fissare le vie aeree superiori.
- Fissare il tubo situato nella trachea da un singolo sutura circolare (6/0 USP).
- Individuare l'arteria carotide lungo il lato destro della trachea e sezionare il tessuto circostante dalla parete dell'arteria carotide. In alternativa, la giugulare o anche la vena posteriore potrebbe essere utilizzata per l'accesso i.v. Cercate di evitare lesioni al nervo vagale, in quanto si trova vicino.
- Passare due pezzi di sutura (6/0) sotto l'arteria carotidea. Posizionare la prima propala cranica prossima, vicino alla biforcazione delle arterie carotidi e legarla in modo permanente. La seconda sutura sarà situata a circa 5-8 mm distale dal primo e successivamente utilizzato per fissare il tubo nell'arteria carotide. Non legarlo ancora.
- Preparare un tubo di polietilene (I.D. x O.D. 0.011" x 0.024") con una lunghezza di 30 cm piegando la parte finale a un ago di siringa da 1 mL riempito con salina (0,9% NaCl). Lavaggio rigoroso è importante per prevenire l'embolizzazione dell'aria durante la preparazione.
- Utilizzare una clip del recipiente di 7 mm per bloccare l'arteria carotide della seconda sutura.
- Eseguire un piccolo taglio trasversale (0,5 mm) nell'arteria carotide e introdurre il tubo sterile di polietilene. Fissare il tubo nell'arteria utilizzando la seconda sutura preparata prima.
- Rimuovere la clip del vaso e applicare delicatamente un po 'di tensione alla siringa collegata al tubo di polietilene. Questo catetere carotide può ora essere utilizzato per somministrare farmaci o prelevare campioni di sangue se necessario, anche il monitoraggio della pressione sanguigna o della frequenza cardiaca è possibile con i rispettivi dispositivi.
3. Preparazione chirurgica del muscolo cremaster
- Trasferire il mouse sul pad di riscaldamento (insieme al pad di riscaldamento) al telaio in plastica su misura tenendo il palco per la microscopia successiva. Orientare il mouse con lo scroto rivolto verso lo stadio del microscopio.
- Rivalutare la profondità dell'anestesia prima di procedere; ri-somministrare da un quarto a metà dose di anestesia, se necessario.
- Localizzare lo scroto, tenendolo nella sua parte più distale con una pinzetta, tirarlo delicatamente e tagliare una sezione circolare di pelle scrotale con circa 5 mm di diametro. Assicurarsi di non danneggiare le strutture sottostanti come il muscolo cremato. Assicurarsi di mantenere il tessuto aperto ben idratato con soluzione salina.
- Dissect tessuto connettivo sciolto utilizzando due pinzette e localizzare entrambi i testicoli.
- Tenere un testicolo e iniziare delicatamente tirarlo fuori, rimuovendo il tessuto connettivo circostante passo dopo passo.
- Una volta che il testicolo è esteriorizzato, pinala all'estremità disalare all'anello di gomma che circonda lo stage. All'esternolizzazione, idratare il tessuto con soluzione salina durante l'intero processo.
- Passaggio critico: Rimuovere con attenzione il tessuto connettivo senza danneggiare il muscolo cremaster sottostante. Il tessuto connettivo in eccesso può ostacolare la visione nella microscopia successiva e può produrre immagini sfocate.
- Pin la parte distale del testicolo verso il basso e aprire il muscolo cremaster da un piccolo taglio trasversale (circa 1 mm), seguito da incisione longitudinale dall'estremità molto distale alla fine prossimale. Di conseguenza il muscolo creman dovrebbe aprirsi sfericamente. Vascello macroscopicamente visibile non deve essere reciso, in quanto ciò può avere un impatto sull'emodinamica.
- Stendere con attenzione il muscolo sullo stadio di vetro e pin all'anello di gomma. Assicurarsi di non toccare o danneggiare la regione centrale, come microscopia verrà eseguita qui.
Attenzione: l'eccesso di stretching può ostacolare il flusso sanguigno. - Pin i testicoli rimanenti da parte per dare accesso alla regione di interesse. Assicurarsi di inumidire ripetutamente con PSS per evitare l'essiccazione. Il muscolo montato è ora pronto per la microscopia.
4. Microscopia intravitale
- Posizionare il muscolo cremaster montato al microscopio verticale ed eseguire la microscopia utilizzando un obiettivo 40x.
- Acquisire dati ed esportare utilizzando la spettrografia di imaging ad alta velocità effettiva.
- Eseguire registrazioni in continua superfusione con PSS17preriscaldata (35-37 gradi centigradi). Applicare la superfusione da un piccolo tubo che è stato registrato per l'obiettivo verticale del microscopio per consentire il continuo gocciolamento di PSS insieme all'obiettivo verso il basso sul tessuto muscolare.
- Identificare le venule post-capillari (confluenza di due vasi più piccoli) e misurare la microcircolazione sulle venule con un diametro di 20-40 m.
- Registra immagini ad alta risoluzione della microcircolazione dal muscolo cremaster in un intervallo di tempo di 30 s. Come ci potrebbe essere una leggera contrazione e rilassamento del tessuto muscolare durante la registrazione, assicurarsi di regolare continuamente la messa a fuoco. Generalmente, il topo tende a mostrare una circolazione stabile per circa 2 ore. È possibile acquisire diverse registrazioni di navi diverse provenienti da diverse regioni. Uno o entrambi i testicoli possono essere utilizzati successivamente.
NOTA: Poiché si tratta di un modello di infiammazione, sono: applicazione sistemica o iniezione scrotale locale Ndi mediatori infiammatori pro, nonché superfusione con ad esempio N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLP). La stimolazione locale tNF-z è comunemente usata per innescare il reclutamento di leucociti; L'endotossiamia indotta da LPS è un modello di infiammazione sistemica grave SIRS.
5. Visualizzazione Leukocite
NOTA: I leucociti aderenti e rotondi possono essere facilmente visti senza ulteriori visualizzazioni. Per determinare la velocità della linea centrale dei leucociti in movimento libero, eseguire la colorazione differenziale.
- Se si utilizzano topi etichettati eGFP, analizzarli direttamente mediante microscopia a fluorescenza.
- Per i ceppi di topo etichettati non eGFP, utilizzare la colorazione della rodamina.
- Somministrare la rhodamina 6G a 0,2 mg/kg di peso corporeo. Dosi ripetute possono essere necessarie per ottenere intensità di colorazione sufficiente. Assicurarsi di mantenere piccoli volumi, in quanto volumi più grandi possono influenzare i parametri emodinamici.
- Per la colorazione istantanea dei leucociti, somministrare la macchia attraverso l'arteria carotide. Se la dissezione dell'arteria carotide non è stata eseguita, la colorazione sufficiente può essere ottenuta mediante applicazione i.p. utilizzando la stessa dose18. In alternativa alla cateterizzazione dell'arteria carotide, è possibile eseguire qualsiasi altra cateterizzazione venosa.
NOTA: Tenere presente che la colorazione delle roderie, a differenza dell'etichettatura eGFP, mostra il decadimento temporale dell'intensità della fluorescenza e un massimo complessivo di colorazione di circa l'80% dei leucociti a concentrazioni più elevate. - Visualizza la microscopia a rio di rotoli con macchie di rhodamina liberamente in movimento mediante microscopia a fluorescenza.
6. Fine dell'esperimento
NOTA: il tempo stimato complessivo per l'esecuzione di questo protocollo deve essere 90 – 150 minuti.
- Termina l'esperimento con eutanasia per lussazione cervicale.
- Per ulteriori analisi, come la trasmigrazione, fissare il muscolo cremaster in PFA mentre ancora allungato sul palco e macchiato per l'istologia come richiesto.
7. Analisi offline
- Analizzare i seguenti parametri come conteggi semplici durante la riproduzione video.
- Calcolare il flusso di rotolamento [numero / min]: numero di cellule che rotolano passando una linea immaginaria / min
- Calcolare l'adesione [numero/mm2]: numero di cellule adesive alla parete del vaso all'interno del campo visivo - 30 s/superficie vascolare [mm2].
- Misurare i seguenti parametri emodinamici e microvascali vengono misurati utilizzando ImageJ.
- Calcolare il diametro del vaso [m] come diametro della parete interna.
- Calcolare la lunghezza della nave [m] come lunghezza della linea centrale della nave.
- Calcola la
velocità della linea centrale ottenuta dall'analisi video fotogramma-fotogramma dei leucociti in movimento libero nella linea centrale.
- Utilizzare le equazioni seguenti come stima.
- Calcolare la superficie vascolare in [mm2]:lunghezza del recipiente [m] x diametro del recipiente [m] x x 10-6.
- Calcolare la
velocità di taglio della parete : 4,9 x (velocità della linea centrale 8 x x 0,625/diametro del vaso [m]). - Velocità media del flusso sanguigno : velocità della linea centrale x 0,625.
- Calcolare il
flusso totale di leucociti : 
conteggio leucocito sistemico x (velocità media 
del flusso sanguigno x 60/1000) x x . - Calcolare la frazione del flusso di rotolamento [%]: flusso di rotolamento/flusso di leucociti ox 100.
velocità della linea centrale ottenuta dall'analisi video fotogramma-fotogramma dei leucociti in movimento libero nella linea centrale.
velocità di taglio della parete : 
flusso totale di leucociti : 
conteggio leucocito sistemico x (velocità 
del flusso sanguigno x 60/1000) x x .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVM in base al protocollo fornito fornirà informazioni uniche sulla cascata di reclutamento di leucociti nel muscolo scheletrico. La sezione dei risultati si concentrerà sui risultati tipici ottenuti da IVM ed evidenzierà i potenziali problemi che possono verificarsi.
La configurazione sperimentale per la microscopia intravitale è descritta nella Figura 1. La preparazione del muscolo cremaster e la rimozione del tessuto connettivo è fondamentale per ottenere immagini microscopiche mirate con una superficie uniforme. Il tessuto connettivo in eccesso porta infine a immagini microscopiche sfocate (Supplemental Video 1) durante l'esecuzione di IVM. La figura 2 mostra immagini microscopiche rappresentative che possono essere ottenute utilizzando IVM. In primo luogo, le venule post-capillari, che dovrebbero avere un diametro compreso tra i 20 e i 40 m, sono identificate dalla confluenza di due vasi più piccoli. Solo i leucociti aderenti e rotondi possono essere visualizzati, i leucociti circolanti possono essere tracciati solo nella riproduzione al rallentatore dei video registrati. Il numero di leucociti aderenti è definito come leucociti stazionari in un tempo di 30 secondi ed espresso per mm2 della superficie del vaso (Figura 2). Viene contato il numero di leucociti laminazione che passano una sezione trasversale precedentemente definita della nave; velocità di rotolamento possono essere ottenute in analisi offline. Il rotolamento può essere espresso come flusso di rotolamento (RF - numero di cellule laminazione su una linea/min predefinita) o come frazione di flusso di rotolamento (RFF in % - RF/totale leucociti che passano il vaso). La RF dipende fortemente dal numero di cellule circolanti, mentre la RFF è meno influenzata dai cambiamenti nei conteggi dei globuli bianchi (WBC). Si noti che in molti casi l'aderenza leucocite e la laminazione sono inversamente correlati; un elevato numero di leucociti aderenti può ridurre il pool di cellule liberamente circolanti e quindi smorzare il rotolamento del leucocito.
Sfide tecniche e potenziali insidie
Il muscolo cremato racchiudono i testicoli e assemblano una struttura sferica. Per montare il muscolo sulla fase di registrazione, è necessaria un'incisione longitudinale per aprire la sfera. Ciò può influire sulla microvascolatura complessiva in quanto piccoli vasi potrebbero essere recisi. Per evitare pregiudizi al flusso sanguigno alterato, si consiglia di scegliere l'area centrale per il riordino. Quest'area non deve essere toccata né manipolata. Inoltre, il microcauterio può prevenire sanguinamento e cambiamenti nell'emodinamica microvascolare. Il flusso sanguigno dei capillari circostanti fornisce generalmente un suggerimento prezioso se la circolazione è influenzata dalla preparazione nel campo di interesse. In generale, i vasi più prossimali (verso il corpo del topo) tendono a mostrare una migliore microcircolazione, tuttavia la cattura dell'immagine può essere complicata da un aumento del movimento e disturbi che derivano dalla respirazione dell'animale.
Per evitare che il muscolo cremaster si secchi durante la registrazione microscopica, la superfusione permanente del tessuto è eminente. Insufficiente o interrotto inumidimento si tradurrà in essiccazione del tessuto e fallimento dell'esperimento.
Il pinning del tessuto cremaster è necessario per mantenerlo allungato e in posizione. Per appiattire il muscolo striato, è necessario uno stretching delicato. Troppo poco allungamento si traduce in tessuto irregolare, che complica la microscopia, eccessivo stretching limiterà il flusso sanguigno e danneggiare il tessuto. Ancora una volta il flusso sanguigno capillare fornisce uno stato affidabile della condizione circolatoria complessiva del tessuto. L'esperienza e la pratica è necessaria per determinare il grado di allungamento durante il montaggio del tessuto.
Lunghi tempi di preparazione influenzeranno lo stato infiammatorio generale dell'organismo e i dati di distorsione. Pertanto, assicurarsi di concentrarsi sulla questione di interesse durante la progettazione dell'esperimento e mantenere i tempi di preparazione più brevi possibile. Se nessun ausiliare la droga, monitor o esami del sangue sono necessari una preparazione singolare del tessuto cremaster può essere sufficiente.
Nella maggior parte degli ambienti, diversi gruppi sperimentali saranno confrontati con animali di tipo selvatico. È di fondamentale importanza assicurarsi che i parametri emodinamici e microvascolari siano simili tra i gruppi sperimentali(Tabella 1). Una moltitudine di parametri può influenzare il reclutamento di leucociti in vivo, tra cui uscita cardiaca, diametro del recipiente, velocità della linea centrale, velocità di taglio della parete e il numero di leucociti circolanti. La tabella 1 mostra i dati provenienti da due diverse linee di topo transgenico, il topo mdx carente distrofico e il mouse lys-eGFP (esprimendo eGFP sotto il promotore di lisci in neutrofili e macrofagi). Mentre parametri come il diametro del recipiente possono essere controllati dall'investigatore, la velocità dell'asse e la velocità di taglio dipendono dall'emodinamica del singolo gruppo sperimentale o dalla deformazione del topo. Chiaramente, la velocità della linea di base e la velocità di taglio a parete sono significativamente diverse tra mouse mdx e lys-eGFP (Tabella 1) rendendo impossibile un confronto significativo dei dati IVM (analisi statistica t-test con la correzione di Welch, significato è stato impostato su P < 0.05). La velocità della linea d'asse è influenzata dall'uscita cardiaca, dalla resistenza vascolare periferica e dal volume intravasale. Ad esempio, un grande volume di rodamina o qualsiasi altra sostanza sperimentale somministrata tramite il catetere carotide aumenta la velocità della linea centrale post-retta e inibisce la cattura e la rotolamento dei leucociti (Video supplementare 2). Al contrario, l'insufficienza cardiaca, l'anestesia profonda o l'ipotermia possono diminuire il flusso post-capillare. Prima di affrontare l'analisi offline dei dati IVM, devono essere definiti i requisiti di qualità dei dati (ad esempio i parametri emodinamici all'interno di intervalli fisiologici), al fine di trarre conclusioni significative e ridurre la distorsione.
Per determinare la velocità della linea d'asse, i leucociti liberamente circolanti devono essere visualizzati. Entrambi, possono essere utilizzati leucociti fluorescenti (come nei topi lys-eGFP) o i leucociti devono essere tinto con reagenti fluorescenti come la rodomina (Figura 3). La rhodamina può essere applicata tramite il catetere carotide o come iniezione i.p.. Dal momento che la rodamina è gradualmente assorbito da altri tipi di cellule pure, una titolazione di dosaggio e tempo è essenziale. Il dosaggio in eccesso e lunghi intervalli produrranno uno sfondo significativo durante la microscopia.
Infine, ci piace sottolineare la diversità biologica di diversi ceppi di topo. Oltre ai ceppi geneticamente modificati, anche i ceppi di tipo selvatico generalmente accettati possono mostrare varianza fisiologica. Figura 4 confronta i topi neri 6 (C57BL/6) comunemente utilizzati con i topi neri 10 (C57BL/10ScSn). I topi neri 6 mostrano chiaramente il rotolamento migliorato, l'adesione e la trasmigrazione dei leucociti rispetto ai 10 topi neri (analisi statistica di unidirezionale di ANOVA con il test post-hoc di Tukey; significato è stato impostato a P < 0.05), anche se entrambi i ceppi sarebbero stati indicati come tipo selvaggio. Pertanto, corretto background genetico dovrebbe essere considerato, soprattutto quando si utilizzano topi transgenici. Nella nostra impostazione sperimentale, un confronto di topi neri 6 e topi mdx transgenici (nero 10 sfondo) nasconderebbe in gran parte lo stato infiammatorio potenziato di topi mdxli carenti di distrofina rispetto al loro sfondo nero 10 di tipo selvaggio (Figura 4).
Figura 1: Configurazione sperimentale schematica di IVM sul muscolo cremaster. Dopo l'anestesia, la trachea viene cannulata e un catetere viene posto nell'arteria carotidea. Il muscolo cremaster è esposto e preparato per la microscopia intravitale su un microscopio verticale utilizzando microscopia leggera o microscopia fluorescente. I video vengono ottenuti per un'analisi offline successiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: segmento venule rappresentativo post-capillare dalla microscopia intravitale con telai sequenziali. La colonna di sinistra mostra immagini microscopiche chiare, per una migliore visualizzazione il vaso è delineato con linee tratteggiate. La venule è identificata da vasi confluenti (contrassegnati da asterischi rossi) e da un diametro del vaso di <40 m. La colonna di destra raffigura una rappresentazione schematica dell'immagine sinistra corrispondente, che mostra i leucociti in rosso. Le prime quattro file mostrano immagini sequenziali della stessa nave nel tempo. La fila inferiore indica i leucociti aderenti. Nella rappresentazione schematica, i singoli leucociti e la loro distanza di rotolamento sono contrassegnati. Nell'analisi offline possono essere calcolate l'aderenza per millimetro quadrato, è possibile calcolare il flusso di rotolamento e la velocità di rotolamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: I leucociti rotanti possono essere visualizzati mediante espressione transgenica di marcatori fluorescenti o da colorazione secondaria con rhodamina. Immagini microscopiche rappresentative del reclutamento di leucociti di leucociti eGFP e di rodociti etichettati con leucociti da n . 3 animali ciascuno. I neutrofili rotolanti che esprimono eGFP sotto il promotore lys da topi transgenici lys-eGFP possono essere rilevati direttamente mediante microscopia immunofluorescente (colonna sinistra). I leucociti senza produttori fluorescenti possono essere macchiati da iniezione endovenosa o intraperitinale di rodosina (colonna destra). In particolare, la rodomia non è assorbita esclusivamente dai neutrofili, dando sostanzialmente più sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto del reclutamento di leucociti in diversi ceppi di topo transgenici e selvatici. (A) Frazione di flusso rotante, (B) l'adesione e la trasmigrazione(C)dei leucociti è confrontata tra 6 neri (C57BL/6J), 10 neri (C57BL/10ScSnJ) e topi mdxti (C57BL/10ScSn-DmmdxdJ), indicati come media : SEM. Allo stesso modo, i topi mdxi hanno un reclutamento maggiore rispetto al nero 10, ma non rispetto ai 6 topi di tipo selvatico neri. Questi dati dimostrano l'importanza di assegnare controlli genetici corretti. Dati di almeno n - 3 animali per gruppo. Analisi statistica di unidirezionale ANOVA con l'analisi post-hoc di Tukey. Significato è stato impostato a P < 0.05. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Deformazione del mouse | No. di topi | No. di venule | Diametro della nave | Velocità dell'asse | Tasso di taglio a parete | Sistematico WBC |
| N | N | Μm | m/s | s-1 (in questo modo) | //l | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 - 4 | 1150 X 50 | 1010 x 100 | 5200 X 300 |
| lys-eGFP | 3 | 15 | 27 : 2 2 | 2220 X919 | 2030 X 90 | 5800 X 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
Tabella 1: Parametri emodinamici e microvascolari pertinenti da due diverse linee di topo transgeniche. Diametro della nave, velocità della linea centrale, velocità di taglio a parete e WBC sistemici vengono visualizzati per topi mdxi privi di distrofina e topi lys-eGFP. In questo esempio i mouse mdxi (C57BL/10J, black 10 background) e i mouse lys-eGFP (C57BL/6J, black 6 background) mostrano la velocità dell'asse e la velocità di taglio della parete statisticamente diverse e non devono essere confrontati con IVM. I dati esemplari provenienti da almeno n 3 animali per gruppo sono presentati come media : seM. Analisi statistica per t-test non accoppiato con la correzione di Welch. Significato è stato impostato a P < 0.05.
Video supplementare 1: Effetto microscopico di rimozione insufficiente del tessuto connettivo sul muscolo cremaster. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
Video supplementare 2: Flusso sanguigno alterato da ipervolemia o ipotensione. Fare clic qui per visualizzare questo video (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Discussion
IVM come metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare diversi tipi di cellule in diversi organi ed è stato ampiamente descritto e discusso19. L'obiettivo principale di questo studio è quello di fornire un approccio efficiente per impostare ed eseguire IVM nel muscolo cremaster. Praticare il metodo produrrà risultati affidabili e riproducibili. Pertanto, la pianificazione e la standardizzazione sono fattori chiave per padroneggiare la tecnica. Soprattutto, la tecnica dipende molto dai parametri emodinamici e microvascali, che devono essere attentamente monitorati e controllati. Di conseguenza, le diverse emodinamiche tra i gruppi produrranno risultati fuorvianti.
Nonostante il suo ruolo nello studio delle condizioni fisiologiche e patologiche, l'IVM da sola potrebbe non svelare completamente il contributo individuale di specifici tipi di cellule al reclutamento di leucociti nell'infiammazione. A tale scopo, altri metodi complementari possono essere combinati con IVM. Ad esempio, i metodi ex vivo come gli esperimenti della camera di flusso possono delineare tra gli effetti dell'endotelio o del leucocito. Inoltre, le camere di flusso sono eccellenti configurazioni per tradurre le scoperte dei roditori in leucociti umani, ad esempio nei neonati20. Inoltre, i metodi in vitro come FACS o immunohistochimica dovrebbero integrare gli esperimenti IVM. Ogni metodo può aggiungere informazioni specifiche acquisite da un ambiente controllato con pochi fattori di confusione.
La preparazione traumatica del cremastro qui presentata assomiglia più da vicino alle condizioni fisiologiche di base dell'infiammazione. Eppure, la preparazione chirurgica obbligatoria stessa è uno stimolo di infiammazione, che deve essere considerato per l'interpretazione. La stimolazione TNF farmacologica del tessuto cremaster può fornire una modalità aggiuntiva per aumentare il reclutamento infiammatorio oltre lo stimolo chirurgico traumatico16. Inoltre, diversi ceppi del mouse possono mostrare risposte alterate verso stimoli standardizzati. Abbiamo dimostrato che anche i ceppi di tipo wild comuni possono presentare diversi stati di base di reclutamento di leucociti. Ciò dimostra l'importanza di assegnare controlli genetici corretti e di stabilire dati di base per nuovi gruppi sperimentali durante la pianificazione degli esperimenti. Poiché i ceppi transgenici sono molto abbondanti in questi giorni, è probabile che anche gli stessi ceppi possano differire nel tempo a seconda dell'allevamento.
Nel loro insieme, IVM è un potente strumento per monitorare il reclutamento di leucociti nel contesto biologico del mouse e deve essere accompagnato da tecniche ex vivo e in vitro. Inoltre, cremaster IVM consente una varietà di diverse modalità, tra cui colorazione cellulare specifica, stimolazione infiammatoria o manipolazione farmacologica e pretrattamento. Come tale può servire come piattaforma per valutare diversi mediatori farmacologici e i loro effetti biologici in studi preclinici soprattutto nel campo dell'infiammazione e più specificamente nelle muscolopatie infiammatorie.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF) 01GL1746E nell'ambito del Consorzio PRIMAL. Gli autori riconoscono Britta Heckmann e Silvia Pezer per un'abile assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
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