Summary

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

Published: April 15, 2020
doi:

Summary

כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.

Abstract

מיקרוסקופ אינטרטל (IVM) משמש רבות לניטור תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזילוגיים בתוך הדירוג הvivo של הגיוס הלוקואני. הפרוטוקול הנוכחי מייצג שיטה מעשית ומנויית כדי להמחיש את האינטראקציה האנדוקובית לוקיציט המובילה לגיוס לוקיציט ברקמת שריר השלד בתוך האורגניזם השלם של העכבר. המודל ישים לכל תחומי המחקר המתמקדים בהפעלת גרנולוציט ותפקידם במחלות.

אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול להנחות דרך השיטה ולהדגיש מלכודות פוטנציאליות וקשיים טכניים. הפרוטוקול מכסה את ההיבטים הבאים: הגדרות ניסיוני וחומר נדרש, הרדמה של העכבר, חיתוך של שריר cremaster, כמו גם הקנה הנשימה והעורק הראשי, הקלטות IVM וניתוח לא מקוון. תבניות נתונים כמו לוקיציטים מדומה, שטף מתגלגל (RF) ושבר שטף מתגלגל (RFF) מוסברים בפירוט ויישומים מתאימים נדונים. תוצאות הנציג מעכברים mdx לקוי הדיסטרופין מסופקים בסעיף התוצאות.

IVM הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך גיוס לוקיציט ב vivo הגדרה; עם זאת, התיחום למשל לפונקציה אנדותל ולוקיציט עשוי לדרוש שילוב עם הגדרות vivo ex כמו ניסויים בתאי הזרימה. יתרה מזאת, הרקע הגנטי של בעלי העניין עשוי להשפיע במידה ניכרת על גיוס בסיסי, המחייב כוונון משובח של הפרוטוקול המסופק. למרות המגבלות שלה, IVM עשוי לשמש פלטפורמה לתרגם בקלות ממצאים בעלי מבחנה מחוץ לאורגניזם חי בעלי חוליות.

Introduction

מיקרוסקופ אינטרטל (IVM) הוא כלי מיושם נפוץ בתחום הביולוגיה הלוקוציט. גיוס לוקיציט מלווה במפל של אירועים מוגדרים היטב, שיזמו לכידת הלוקוציט, גלגול והדבקה לקיר האנדותל, ולבסוף העברת הגירה והעברה של לוקיציטים לאתר בפועל של דלקת1. כל צעד מתווך ונשלט על ידי נוגדנים שונים (למשל, IL-8/CXCL8), קולטנים (g., lfa-1, Mac-1) ומולקולות הדבקה של תא אנדותל המקביל (g., icam-1, vcam-1 ו-e-selectin)2,3. האינטראקציה של אתרים רגולאטורים שונים, מקדמי שליטה ומגשרים של גיוס לוקיציט מדורגים כמו קולטן של מוצרים מתקדמים לסוף גליקטיון (זעם), מולקולה הדבקה משולבת 1 (icam -1), c-X-c מוטיב ליגנד (cxcl) 1/2 והקולטן שלהם CXCR2 נחשפו באמצעות ivm4,5,6,7,8,9

השיטה של IVM תוארה עבור איברים ורקמות שונים רבים כגון המעי10, עור11, בלוטות הלימפה12, שק החלמון העובריים13 ואחרים. עם זאת, שיטת המחקר הנרחב ביותר של IVM הוא מודל cremaster, המתואר לראשונה חולדות14. בעוד שימוש עדיין בחולדות15, השיטה מיושמת כיום בעיקר בעכברים בשל שפע גבוה של קווים טרנסגניים שונים. הקבוצה שלנו הדגישה לאחרונה את התפקיד הפוטנציאלי של מאסטר cremaster בתחום של מוסקולוטים דלקתיים כמו Duchenne ניוון שרירים (DMD) ללמוד הדיסטרופין לקויה עכברים16. בשל שזור דק ונגיש בקלות הרכב סיבים, שריר cremaster מייצג את השריר האידיאלי המועמד ללמוד כמו הר שלם באמצעות מיקרוסקופ אור או פלורסנט. גיוס לוקיציט ומיון מתמשך מתקיימים בעיקר בעזרת שכבות פוסט-קפיריות, שיכולות להיות מזוהות על שכבת שרירים רציפה בשריר הקרמאסטר.

היתרון של הדמיה vivo לעומת אחרים מחוץ לבית הספר הוא ההקשר הביולוגי שלה באורגניזם חי. במקביל, מציינת תרומות ספציפיות לתאים לגיוס לוקמיה משתנה עשויה לדרוש תוספת של מודלים להפריה חוץ-גופית כגון תאי זרימה או אנדותל אסמאל. השילוב בין שיטות מרובות יניב את הנתונים המששכנעים ביותר. מדענים צריכים להיות מודעים למגבלות של מודל cremaster כמו כל מניפולציה כירורגית יוביל להגדלת הסחר בסמים וגיוס. מכאן, הגיוס הבסיסי קשה להעריך עם שיטה זו. למרות היישום הרחב שלה, IVM של cremaster יכול להיות מאתגר וכיוונון הרומן עשוי לקחת זמן ומשאבים כדי להקים. כעת אנו מספקים פרוטוקול קל אשר יסייע להימנע כמה טעויות נפוצות ב-IVM. כמו כן, יידונו מגבלות ושיטות מסוימות יהיו מודגשות במידת הצורך.

האגודה מייצגת גישה אידיאלית ליישום בתחום של מחקרים דלקתיים וזיהומיות. באופן ספציפי יותר, מודל cremaster עשוי להיות עניין גבוה למדענים לימוד ביולוגיה שריר השלד בהקשר של מחלות דלקתיות.

Protocol

בעלי חיים היו תחת מבוקרת וספציפי התנאים ללא הפתוגן בבית IBF (ביופקולטציזיסיאיסמליסספיאדיבאיזשיונגאבריסגריסיוריסיימאנטאינטונג), חאידלברג. כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על-ידי ה-IRB המקומי והרגראשיפראססרוסיה קרלסרוהה, באדן-Wuerttemberg, גרמניה. 1. מינהל הרדמה מורדם העכבר על י?…

Representative Results

IVM לפי הפרוטוקול המסופק תניב תובנות ייחודיות לתוך המפל של גיוס לוקיציט שריר השלד. סעיף התוצאות יתמקד בתוצאות אופייניות המתקבלות על-ידי IVM וידגיש בעיות פוטנציאליות שעלולות להיתקל בהן. התוכנית הניסיונית למיקרוסקופיה הינה מחולקת באיור 1. הכנת שריר cremaster והסרת ?…

Discussion

IVM כשיטה נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד סוגים שונים של תאים באיברים שונים ותיאר בהרחבה ודנו19. המטרה העיקרית של מחקר זה היא לספק גישה יעילה להגדיר ולבצע IVM בשריר cremaster. תרגול השיטה יפיק תוצאות אמינות ומיוצרות. לפיכך, תכנון וסטנדרטיזציה הם גורמי מפתח לשלוט בטכניקה. מעל לכל, הטכניקה תלו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה היה נתמך על ידי הממשלה הפדרלית הגרמני של החינוך והמחקר (BMBF) 01GL1746E כחלק הקונסורציום הראשוני. המחברים מכירים ברטה הירמן וסילביה Pezer לקבלת סיוע טכני מיומן.

Materials

Material
Ketanest S Pfizer Pharma GmbH PZN: 08509909 anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine
Xylazine CP-Pharma GmbH Article-nr.: 1205  anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)
Saline Solution B. Braun Melsungen  PZN 02737756 surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride
Syringe needle Omnican F B. Braun Melsungen  REF 9161502 surgical preparation 
Suture 6/0 USP Resorba REF 4217 surgical preparation 
Polyethylene tube #10  BD GmbH Supplier No. 427401 surgical preparation 
Polyethylene tube #90  BD GmbH Supplier No. 427421 surgical preparation 
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich Chemie GmbH CAS Number 989-38-8  leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate
Setup Equipment
Upright microscope  Olympus  BX51W1 microscopy
40-fold objective  Zeiss Achroplan 40 × /0.80 W microscopy
ImSpector software Lavision Biotec GmbH ver. 4.0.469 software
ImageJ National Institute of Health, USA ver. 1.51j8 software

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  2. Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
  3. Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
  4. Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
  5. Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
  6. Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
  7. Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
  8. Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
  9. Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
  10. Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  11. Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
  12. von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
  13. Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
  14. Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
  15. Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
  16. Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
  17. Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
  18. Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
  19. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  20. Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).

Play Video

Cite This Article
Kranig, S. A., Lajqi, T., Tschada, R., Braun, M., Kuss, N., Pöschl, J., Hudalla, H. Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (158), e60509, doi:10.3791/60509 (2020).

View Video