Summary
Hier laten we zien hoe je intravitale microscopie uitvoert op postcapillaire venules van de muiscremaster spier. Vaak toegepast op verschillende modellen van ontsteking en sepsis, met name die veroorzaakt door chemokines en cytokines, benadrukken we de relevantie ervan in de studie van muscolopathies waarbij overdreven gespierde leukocyten infiltratie.
Abstract
Intravital microscopie (IVM) wordt veel gebruikt om fysiologische en pathofysiologische processen te monitoren binnen de leukocyten rekruteringcascade in vivo. Het huidige protocol vertegenwoordigt een praktische en reproduceerbare methode om de leukocyten endotheelinteractie te visualiseren die leidt tot het rekruteren van skeletspieren in skeletspierafgeleid weefsel in het intacte organisme van de muis. Het model is van toepassing op alle onderzoeksgebieden die zich richten op granulocyteactivering en hun rol bij ziekte.
We bieden een stapsgewijs protocol om de methode te begeleiden en mogelijke valkuilen en technische problemen te benadrukken. Het protocol behandelt de volgende aspecten: experimentele instellingen en vereist materiaal, anesthesie van de muis, dissectie van de cremaster spier evenals tracheale en halsslagader cannulation, IVM opnames en offline analyse. Gegevensformaten zoals aanhangende leukocyten, rolling flux (RF) en rolling flux fraction (RFF) worden in detail uitgelegd en passende toepassingen worden besproken. Representatieve resultaten van dystrofinedeficiënte mdx muizen worden verstrekt in de resultaten sectie.
IVM is een krachtig instrument om de rekrutering van leukocyten in vivo te beoordelen; het afzetten van bijvoorbeeld endotheel- en leukocytenfunctie kan echter een combinatie met ex vivo opstellingen zoals stroomkamerexperimenten vereisen. Bovendien kan de genetische achtergrond van dieren van belang een grote invloed hebben op de aanwerving van basislijnen, waardoor individuele aanpassing van het verstrekte protocol vereist is. Ondanks zijn beperkingen kan IVM dienen als een platform om in vitro bevindingen gemakkelijk te vertalen naar een levend gewerveld organisme.
Introduction
Intravital microscopie (IVM) is een veel toegepast instrument op het gebied van leukocytenbiologie. Leukocyten rekrutering volgt een cascade van goed gedefinieerde gebeurtenissen geïnitieerd door leukocyten vangen, rollen en hechting aan de endotheelwand, en ten slotte transmigratie en extravasatie van leukocyten naar de werkelijke plaats van ontsteking1. Elke stap wordt bemiddeld en gecontroleerd door verschillende chemokines (bijvoorbeeld IL-8/CXCL8), receptoren (bijvoorbeeld LFA-1, Mac-1) en bijbehorende endotheelcelhechtingsmoleculen (bijvoorbeeld ICAM-1, VCAM-1 en E-Selectin)2,3. De interactie van verschillende regelgevende sites, controlerende factoren en bemiddelaars van de leukocyten rekruteringcascade zoals receptor van geavanceerde glycatieeindproducten (RAGE), intercellulaire hechtingsmolecuul 1 (ICAM-1), C-X-C motief ligand (CXCL)1/2 en hun receptor CXCR2 werden ontdekt met behulp van IVM4,5,6,7,8,9.
De methode van IVM is beschreven voor veel verschillende organen en weefsels zoals de darm10, huid11, lymfeklieren12, de embryonale dooier zak13 en anderen. Echter, de meest bestudeerde methode van IVM is de cremaster model, voor het eerst beschreven bij ratten14. Terwijl nog steeds gebruikt bij ratten15, de methode wordt tegenwoordig vooral toegepast in muizen als gevolg van de hoge overvloed aan verschillende transgene lijnen. Onze groep heeft onlangs gewezen op de potentiële rol van cremaster IVM op het gebied van inflammatoire muscolopathies zoals Duchenne Spierdystrofie (DMD) bestuderen dystrophin-deficiënte mdx muizen16. Door zijn dunne verweven en gemakkelijk toegankelijke vezelsamenstelling vertegenwoordigt de cremaster spier de ideale kandidaatspier die als geheel moet worden bestudeerd met behulp van lichte of fluorescerende microscopie. Leukocyte nevenwerving en extravasatie vinden voornamelijk plaats in postcapillaire venules, die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd op een continue spierlaag in de cremaster spier.
Het voordeel van in vivo beeldvorming in vergelijking met andere in vitro testen is de biologische context in een levend organisme. Tegelijkertijd kan het afdekken van celspecifieke bijdragen aan gewijzigde leukocytenwerving aanvullende in vitro modellen vereisen, zoals stroomkamers of endotheliale tests. De combinatie van meerdere methoden levert de meeste overtuigende gegevens op. Wetenschappers moeten zich bewust zijn van de beperkingen van de cremaster model als een chirurgische manipulatie zal leiden tot meer leukocyten handel en werving. Daarom is baseline recruitment moeilijk in te schatten met deze methode. Ondanks de brede toepassing, IVM van de cremaster kan een uitdaging zijn en een nieuwe setup kan tijd en middelen te vestigen. We bieden nu een eenvoudig protocol dat zal helpen om een aantal van de gemeenschappelijke fouten in IVM te voorkomen. Ook zullen beperkingen worden besproken en gratis methoden zullen worden gemarkeerd waar van toepassing.
IVM van de cremaster vertegenwoordigt een ideale aanpak die moet worden toegepast op het gebied van ontstekings- en infectieuze studies. Meer specifiek kan het cremaster-model van groot belang zijn voor wetenschappers die skeletspierbiologie bestuderen in de context van ontstekingsziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dieren werden gehuisvest onder gecontroleerde en specifieke ziekteverwekker-vrije voorwaarden bij IBF (Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung), Heidelberg. Alle hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de lokale IRB en het Regierungspraesidium Karlsruhe, Baden-Wuerttemberg, Duitsland.
1. Anesthesietoediening
- Verdoof de muis door intraperitoneale (i.p.) bolusinjectie van 125 mg/kg ketamine en 12,5 mg/kg xylazine.
- Plaats en bevestig de muis in een rugligfietspositie op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur van de muis (36,5-38 °C) te behouden. Gebruik een niet-opneembare steriele hechting (6/0) om een eenvoudige lus rond de frontale tanden te winden en de verbindingsuiteinden van de hechting aan het verwarmingskussen vast te plakken. Deze fixatie is bedoeld om de mond open te houden om verstoring van de ademhaling te voorkomen.
- Controleer de muis op de juiste diepte van anesthesie door interdigitale teenknijpen (terugtrekking mag niet worden gezien).
- Zodra voldoende anesthesie is bereikt, gaat u over tot chirurgische voorbereiding. Herhaaldelijk bevestigen anesthesie langs de lopende experiment om de 30 min. Re-toediening van geneesmiddelen zoals hierboven beschreven indien nodig.
- Equilibrate fysiologische zoutoplossing (PSS, samenstelling: 132 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgS04, 2.0 mmol/L CaCl2, 18 mmol/L NaHCO3) met 5% CO2/95% N2 gedurende 15 minuten. Bel PSS continu met 5% CO2/95% N2 gedurende het hele experiment en blijf op 37 °C.
2. Chirurgische bereiding van de luchtpijp en halsslagader (facultatief)
- Ontleed de huid van de nek gebied door zachtjes trekken van de huid met pincet in de middellijn. Gebruik een schaar om een cirkelvormige snede van 1-2 cm in diameter aan te brengen om voldoende ruimte te geven voor chirurgische voorbereiding.
- Ontleed zorgvuldig de omliggende spier-, vet- en bindweefsels met behulp van een pincet.
- Maak een dwarse snede (~ 1,3 mm) in de luchtpijp met behulp van kleine chirurgische schaar en introduceer een polyethyleenbuis (I.D x O.D. 0,034" x 0,050") in het staartuiteinde van de luchtpijp om de bovenste luchtwegen te beveiligen.
- Bevestig de buis in de luchtpijp door een enkele cirkelvormige knoophechting (6/0 USP).
- Zoek de halsslagader langs de rechterkant van de luchtpijp en ontleed het omringende weefsel van de halsslagaderwand. Als alternatief kan de halsslagader of ook de staartader worden gebruikt voor infuustoegang. Probeer letsel aan de nervus vagie te voorkomen, omdat deze zich dicht bij elkaar bevindt.
- Geef twee stukken hechting (6/0) onder de halsslagader. Plaats de eerste schedelhechting proximale, dicht bij de splitsing van halsslagaders en bind het permanent. De tweede hechting zal worden gevestigd ongeveer 5-8 mm distaal van de eerste en later worden gebruikt om de buis te beveiligen in de halsslagader. Bind het nog niet vast.
- Bereid een polyethyleenbuis (I.D x O.D. 0,011" x 0,024") met een lengte van 30 cm door het uiteinde te buigen naar een 1 mL spuitnaald gevuld met zout (0,9% NaCl). Rigoureus spoelen is belangrijk om luchtembolie tijdens de voorbereiding te voorkomen.
- Gebruik een 7 mm vaatclip om de halsslagader los van de tweede hechting te klemmen.
- Voer een kleine dwarse snede (~ 0,5 mm) in de halsslagader uit en introduceer de steriele polyethyleenbuis. Zet de buis in de slagader met behulp van de tweede hechting voorbereid voor.
- Verwijder de vatclip en breng voorzichtig een beetje spanning aan op de spuit die is aangesloten op de polyethyleenbuis. Deze halsslagader katheter kan nu worden gebruikt om drugs toe te dienen of bloedmonsters te nemen indien nodig, zelfs controle van de bloeddruk of hartslag is mogelijk met de respectieve apparaten.
3. Chirurgische voorbereiding van de cremasterspier
- Breng de muis op de verwarmingspad (samen met de verwarming pad) naar de op maat gemaakte plastic frame bedrijf het podium voor latere microscopie. Oriënteer de muis met zijn scrotum naar het microscoopstadium.
- Herbeoordeling van de diepte van anesthesie voordat u verdergaat; indien nodig een kwart tot halve dosis anesthesie opnieuw toe dienen.
- Lokaliseer het scrotum, houd het op zijn meest distale deel met behulp van pincet, trek het voorzichtig en snijd een cirkelvormige sectie van scrotale huid met ongeveer 5 mm in diameter. Zorg ervoor dat de onderliggende structuren, zoals de cremaster spier, niet worden geschaad. Zorg ervoor dat het open weefsel goed gehydrateerd blijft met een zoutoplossing.
- Ontleed los bindweefsel met behulp van twee pincet en lokaliseren beide teelballen.
- Houd een testis distally en voorzichtig beginnen te trekken uit, het verwijderen van omliggende bindweefsel stap voor stap.
- Zodra de testis is buiten, pin zijn distale einde aan de rubberen ring rond het podium. Bij exteriorisatie, hydrateer het weefsel met zoutoplossing tijdens het hele proces.
- Kritieke stap: Verwijder bindweefsel voorzichtig zonder de onderliggende cremasterspier te beschadigen. Overtollig bindweefsel kan het gezichtsvermogen in latere microscopie belemmeren en kan wazige beelden produceren.
- Pin het distale deel van de testis naar beneden en open de cremaster spier door een kleine dwarse snede (ongeveer 1 mm), gevolgd door longitudinale incisie van de zeer distale tot het proximale einde. Als gevolg hiervan moet de cremaster spier sferisch openen. Macroscopisch zichtbaar vat mag niet worden doorgesneden, omdat dit van invloed kan zijn op de hemodynamica.
- Verdeel de spier voorzichtig over het glazen podium en pin deze vast aan de rubberen ring. Zorg ervoor dat u de centrale regio niet aanraakt of beschadigt, want hier wordt microscopie uitgevoerd.
Let op: Overtollige stretch kan de bloedstroom belemmeren. - Speld de resterende testis opzij om toegang te geven tot de regio van belang. Bevochtig je herhaaldelijk met PSS om uitdroging te voorkomen. De gemonteerde spier is nu klaar voor microscopie.
4. Intravitale microscopie
- Plaats de gemonteerde cremaster spier in de rechtopstaande microscoop en uitvoeren microscopie met behulp van een 40x doelstelling.
- Gegevens verkrijgen en exporteren met behulp van hoge doorvoerimaging spectrografie.
- Voer opnames uit onder continue superfusie met voorverwarmde PSS17(35-37 °C). Breng superfusie door een kleine slang die is geplakt op de rechte doelstelling van de microscoop om continu druipen van PSS naast het doel naar beneden op het spierweefsel mogelijk te maken.
- Identificeer postcapillaire venules (samenvloeiing van twee kleinere vaten) en meet de microcirculatie op venules met een diameter van 20-40 μm.
- Neem hoge resolutie beelden van de microcirculatie van de cremaster spier in een tijdsbereik van 30 s. Aangezien er tijdens de opname lichte samentrekking en ontspanning van het spierweefsel kan zijn, zorg ervoor dat u de focus voortdurend aanpast. Over het algemeen heeft de muis de neiging om een stabiele circulatie vertonen voor ongeveer 2 uur. Het is mogelijk om verschillende opnames van verschillende schepen uit verschillende regio's te verwerven. Een of beide testis kan vervolgens worden gebruikt.
OPMERKING: Aangezien dit een ontstekingsmodel is, zijn veelvoorkomende manieren van inductie: systemische toepassing of lokale scrotale injectie van pro-inflammatoire mediators en superfusie met bijvoorbeeld N-Formylmethionyl-leucyl-fenylalanine (fMLP). N Lokale TNF-α stimulatie wordt vaak gebruikt om leukocyten werving te activeren; LPS-geïnduceerde endotoxemie is een model van SIRS ernstige systemische ontsteking.
5. Leukocytevisualisatie
LET OP: Aanhanger en rollende leukocyten kunnen gemakkelijk worden gezien zonder verdere visualisatie. Om de middenlijn snelheid van vrij bewegende leukocyten te bepalen, uit te voeren differentiële vlekken.
- Als eGFP gelabelde muizen worden gebruikt, analyseer ze dan direct met fluorescentiemicroscopie.
- Voor niet-eGFP gelabelde muisstammen, gebruik rhodamine kleuring.
- Toedienen rhodamine 6G op 0,2 mg/kg lichaamsgewicht. Herhaalde doses kunnen nodig zijn om voldoende kleurintensiteiten te bereiken. Zorg ervoor dat u kleine volumes behoudt, omdat grotere volumes van invloed kunnen zijn op hemodynamische parameters.
- Voor onmiddellijke vlekken van leukocyten, het toedienen van de vlek via de halsslagader. Als de dissectie van de halsslagader niet is uitgevoerd, kan voldoende kleuring worden bereikt door middel van een i.p. toepassing met dezelfde dosis18. Als alternatief voor halsslagader katheterisatie, kan elke andere veneuze katheterisatie worden uitgevoerd.
OPMERKING: Houd in gedachten dat rhodamine kleuring, in tegenstelling tot eGFP etikettering, toont tijd verval van fluorescentie intensiteit evenals een totale kleuring maximum van ongeveer 80% van de leukocyten bij hogere concentraties. - Visualiseer vrij bewegende rhodamine gekleurde leukocyten door fluorescentie microscopie.
6. Einde van het experiment
OPMERKING: De totale geschatte tijd om dit protocol uit te voeren moet 90 – 150 minuten zijn.
- Beëindig het experiment met euthanasie door cervicale dislocatie.
- Voor verdere analyses, zoals transmigratie, fix de cremaster spier in PFA, terwijl nog steeds uitgerekt op het podium en gekleurd voor histologie als nodig is.
7. Offline analyse
- Analyseer de volgende parameters als eenvoudige tellingen tijdens het afspelen van video's.
- Rolling flux berekenen [getal/min]: aantal rollende cellen dat een denkbeeldige lijn/min passeert
- Bereken hechting [getal/mm2]:aantal cellen dat aan de vaatwand kleven in het gezichtsveld ≥ 30 s/vasculair oppervlak [mm2].
- Meet de volgende hemodynamische en microvasculaire parameters worden gemeten met behulp van ImageJ.
- Bereken de diameter van het vat [μm] als de binnenwanddiameter.
- Bereken de lengte van het vat [μm] als de lengte van de middellijn van het vat.
- Bereken de
middenlijnsnelheid verkregen uit frame-to-frame video-analyse van vrij bewegende leukocyten in de middenlijn.
- Gebruik de volgende vergelijkingen als schatting.
- Bereken het vasculaire oppervlak in [mm2]:vatlengte [μm] x vatdiameter [μm] x π x 10-6.
- Bereken de
wandschuifsnelheid : 4,9 x (8 x middenlijnsnelheid x 0,625/vatdiameter [μm]). - Bereken de gemiddelde doorbloedingssnelheid : middenlijnsnelheid x 0,625.
- Bereken de
totale leukocytenflux : systemische leukocytentelling 
x (gemiddelde doorbloedingssnelheid x 60/1000) x π x 
. - Bereken rollende fluxfractie [%]: rollende flux/totale leukocyteflux x 100.
middenlijnsnelheid verkregen uit frame-to-frame video-analyse van vrij bewegende leukocyten in de middenlijn.
wandschuifsnelheid : 4,9 
totale leukocytenflux : systemische leukocytentelling 
x (gemiddelde doorbloedingssnelheid 
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVM volgens het meegeleverde protocol zal unieke inzichten opleveren in de cascade van leukocyten rekrutering in skeletspieren. De resultaten sectie zal zich richten op typische resultaten verkregen door IVM en wijzen op potentiële problemen die kunnen tegenkomen.
De experimentele opstelling voor intravitale microscopie wordt beschreven in figuur 1. Voorbereiding van de cremaster spier en verwijdering van bindweefsel is cruciaal om gerichte microscopische beelden met een uniform oppervlak te verkrijgen. Overtollig bindweefsel leidt uiteindelijk tot wazige microscopische beelden(Supplemental Video 1)bij het uitvoeren van IVM. Figuur 2 toont representatieve microscopische beelden die kunnen worden verkregen met behulp van IVM. Ten eerste worden postcapillaire venules, die tussen de 20-40 μm in diameter moeten liggen, geïdentificeerd door samenvloeiing van twee kleinere vaten. Alleen aanhangende en rollende leukocyten kunnen worden gevisualiseerd, circulerende leukocyten mogen alleen worden gevolgd in slow motion replay van opgenomen video's. Het aantal aanhangende leukocyten wordt gedefinieerd als stationaire leukocyten over een tijd van 30 seconden en uitgedrukt per mm2 van het scheepsoppervlak (figuur 2). Het aantal rollende leukocyten dat een eerder gedefinieerde doorsnede van het vaartuig passeert, wordt geteld; rollende snelheden kunnen worden verkregen in offline analyse. Het rollen kan worden uitgedrukt als rollende flux (RF = aantal rollende cellen over een vooraf gedefinieerde lijn/min) of als rollende fluxfractie (RFF in % = RF/totale leukocytenflux langs het vat). RF is sterk afhankelijk van het aantal circulerende cellen, terwijl RFF minder wordt beïnvloed door veranderingen in het aantal witte bloedcellen (WBC's). Merk op dat in veel gevallen leukocyten therapietrouw en rollen zijn omgekeerd gerelateerd; een groot aantal aanhangende leukocyten kan de pool van vrij circulerende cellen verminderen en zo leukocytenrollen dempen.
Technische uitdagingen en mogelijke valkuilen
De cremaster spier omsluit de testis en assembleert een bolvormige structuur. Om de spier op het opnamestadium te monteren, is een longitudinale incisie nodig om de bol te openen. Dit kan van invloed zijn op de algehele microvasculatuur als kleine schepen kunnen worden afgesneden. Om vooringenomenheid te voorkomen bij een veranderde bloedstroom, is het raadzaam om het centrale gebied te kiezen voor het opnieuw ordenen. Dit gebied mag niet worden aangeraakt of gemanipuleerd. Bovendien kan microcautery bloedingen en veranderingen in de microvasculaire hemodynamica voorkomen. De bloedstroom van omliggende haarvaten geeft over het algemeen een waardevolle hint als de circulatie wordt beïnvloed als gevolg van de voorbereiding binnen het gebied van belang. In het algemeen hebben meer proximale bloedvaten (naar het lichaam van de muis) de neiging om een betere microcirculatie te vertonen, maar het vastleggen van het beeld kan worden gecompliceerd door verhoogde beweging en verstoringen die het gevolg zijn van de ademhaling van het dier.
Om te voorkomen dat de cremaster spier uitdrogen tijdens microscopische opname, permanente superfusie van het weefsel is eminent. Onvoldoende of onderbroken bevochtiging zal resulteren in het drogen van het weefsel en falen van het experiment.
Het vastmaken van het cremasterweefsel is noodzakelijk om het uitgerekt en op zijn plaats te houden. Om de gestreepte spier plat te maken, is voorzichtig rekken vereist. Te weinig rek resulteert in oneffen weefsel, wat microscopie bemoeilijkt, overmatig rekken zal de bloedstroom beperken en het weefsel schaden. Opnieuw zorgt capillaire bloedstroom voor een betrouwbare status van de algehele bloedsomlooptoestand van het weefsel. Ervaring en praktijk is nodig om de mate van stretch te bepalen bij het monteren van het weefsel.
Lange bereidingstijden zullen de algehele ontstekingstoestand van het organisme en biasgegevens beïnvloeden. Zorg er daarom voor dat u zich tijdens het ontwerpen van het experiment op de kwestie van belang concentreert en de voorbereidingstijden zo kort houdt als nodig is. Als er geen toediening van geneesmiddelen, monitor of bloedonderzoek nodig zijn, kan een enkelvoud preparaat van cremasterweefsel voldoende zijn.
In de meeste instellingen zullen verschillende experimentele groepen worden vergeleken met wilde dieren. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat hemodynamische en microvasculaire parameters vergelijkbaar zijn tussen experimentele groepen (Tabel 1). Een veelheid van parameters kan van invloed zijn leukocyten werving in vivo, met inbegrip van cardiale output, diameter van het vat, middellijn snelheid, wandschaar snelheid en het aantal circulerende leukocyten. Tabel 1 toont gegevens van twee verschillende transgene muislijnen, de dystrofinedemdx-muis en de lys-eGFP-muis (eGFP uitdrukken onder de lys promotor in neutrofielen en macrofagen). Terwijl parameters zoals de diameter van het vat door de onderzoeker kunnen worden gecontroleerd, zijn de middenlijnsnelheid en de afschuifsnelheid afhankelijk van de hemodynamica van de individuele experimentele groep of de muisstam. Het is duidelijk dat de middenlijnsnelheid en de wandschuifsnelheid aanzienlijk verschillen tussen mdx en lys-eGFP-muizen (tabel 1) waardoor een zinvolle vergelijking van IVM-gegevens onmogelijk is (statistische analyse door t-test met de correctie van Welch, significantie werd vastgesteld bij P < 0,05). De middenlijnsnelheid wordt beïnvloed door cardiale output, perifere vasculaire weerstand en intravaaal volume. Bijvoorbeeld, een groot volume van rhodamine of een andere experimentele stof gegeven via de halsslagader verhoogt post capillaire middellijn snelheid en remt leukocyten vangen en rollen (Supplemental Video 2). Integendeel, hartfalen, diepe anesthesie of onderkoeling kan de postcapillaire stroom verminderen. Alvorens offline analyse van IVM-gegevens te benaderen, moeten vereisten van gegevenskwaliteit (bijvoorbeeld hemodynamische parameters binnen fysiologische bereiken) worden gedefinieerd om zinvolle conclusies te trekken en bias te verminderen.
Om de middenlijnsnelheid te bepalen, moeten vrij circulerende leukocyten worden gevisualiseerd. Ofwel kunnen fluorescerende leukocyten (zoals bij lys-eGFP-muizen) worden gebruikt of moeten leukocyten worden geverfd met fluorescerende reagentia zoals rhodamine (Figuur 3). Rhodamine kan worden aangebracht via de halsslagader katheter of als een i.p. injectie. Aangezien rhodamine geleidelijk wordt opgenomen door andere celtypes ook, een titratie van de dosering en tijd is essentieel. Overtollige dosering en lange intervallen zal produceren aanzienlijke achtergrond tijdens microscopie.
Tot slot wijzen we graag op de biologische diversiteit van verschillende muizenstammen. Naast genetisch veranderde stammen, kunnen ook algemeen aanvaarde wilde typestammen fysiologische variantie tonen. Figuur 4 vergelijkt veelgebruikte zwarte 6 (C57BL/6) met zwarte 10 (C57BL/10ScSn) muizen. Zwarte 6 muizen tonen duidelijk verbeterde rollen, hechting en transmigratie van leucocyten in vergelijking met zwarte 10 muizen (statistische analyse door eenrichtingsANOVA met Tukey's post-hoc test; significantie werd vastgesteld bij P < 0,05), hoewel beide stammen wild type zouden worden genoemd. Daarom moet een juiste genetische achtergrond worden overwogen, vooral bij het gebruik van transgene muizen. In onze experimentele setting zou een vergelijking van zwarte 6 muizen en transgene mdx muizen (zwarte 10 achtergrond) grotendeels de verbeterde ontstekingstoestand van dystrophin edystroine mdx muizen verbergen over hun juiste zwarte 10 wilde type achtergrond (Figuur 4).
Figuur 1: Schematische experimentele opstelling van IVM op cremaster spier. Na anesthesie wordt de luchtpijp kannuguleerd en wordt een katheter in de halsslagader geplaatst. De cremaster spier wordt blootgesteld en voorbereid voor intravitale microscopie op een rechtopstaande microscoop met behulp van licht microscopie of fluorescerende microscopie. Video's worden verkregen voor latere offline analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatief postcapillair venulesegment van intravitale microscopie met sequentiële frames. De linkerkolom toont lichte microscopische beelden, voor een betere visualisatie wordt het vat geschetst met stippellijnen. De venule wordt geïdentificeerd door confluente vaten (gemarkeerd met rode sterretjes) en een vatdiameter van <40 μm. De rechterkolom toont een schematische weergave van de bijbehorende linkerafbeelding, met leukocyten in het rood. De eerste vier rijen tonen sequentiële beelden van hetzelfde schip in de tijd. De onderste rij geeft aanhangende leukocyten aan. In de schematische weergave worden individuele leukocyten en hun rolafstand gemarkeerd. In offline analyse hechting per vierkante millimeter, rollende flux en rollende snelheid kunnen worden berekend. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Rollende leukocyten kunnen worden gevisualiseerd door transgene expressie van fluorescerende markers of door secundaire kleuring met rhodamine. Representatieve microscopische beelden van de rekrutering van eGFP-leukocyten en rhodamine met het label leukocyten van n = 3 dieren per stuk. Rollende neutrofielen die eGFP uitdrukken onder de lys promotor van lys-eGFP transgene muizen kunnen direct worden gedetecteerd door immunofluorescentie microscopie (linkerkolom). Leukocyten zonder fluorescerende makers kunnen worden gekleurd door intraveneuze of intraperitoneale injectie van rhodamine (rechterkolom). Met name rhodamine wordt niet uitsluitend opgenomen door neutrofielen, waardoor aanzienlijk meer achtergrond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van de rekrutering van leukocyten in verschillende transgene en wilde muisstammen. (A) Rolling flux fractie, (B) adhesie en (C) transmigratie van leucocyten wordt vergeleken tussen zwart 6 (C57BL/6J), zwart 10 (C57BL/10ScSnJ) en mdx muizen (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ), weergegeven als gemiddelde + SEM. Zwarte 6 muizen vertonen verbeterde leukocyten werving in vergelijking met zwarte 10 muizen. Op dezelfde manier hebben mdx-muizen een grotere rekrutering in vergelijking met zwarte 10, maar niet in vergelijking met zwarte 6 wilde typemuizen. Deze gegevens tonen het belang aan van de toewijzing van correcte genetische controles. Gegevens van ten minste n = 3 dieren per groep. Statistische analyse door eenrichtings-ANOVA met tukey's post-hoc analyse. Significance werd ingesteld op P < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| De spanning van de muis | №. van muizen | №. van venules | Diameter van het vaartuig | Middenlijnsnelheid | De sheartarief van de muur | Systemische WBC |
| N | N | Μm | μm/s | s-1 | /μl | |
| Mdx | 3 | 12 | 28 ± 4 | 1150 ± 50 | 1010 ± 100 | 5200 ± 300 |
| lys-eGFP | 3 | 15 | 27 ± 2 | 2220 ± 90 | 2030 ± 90 | 5800 ± 100 |
| P | 0.83 | 0.0005 | 0.0016 | 0.13 |
Tabel 1: Relevante hemodynamische en microvasculaire parameters van twee verschillende transgene muislijnen. De diameter van het vat, de snelheid van de middellijn, de wandschuifsnelheid en de systemische WBC's worden weergegeven voor mdx-muizen die dystrofine en lys-eGFP-muizen missen. In dit voorbeeld tonen mdx muizen (C57BL/10J, zwarte 10 achtergrond) en lys-eGFP muizen (C57BL/6J, zwarte 6 achtergrond) statistisch verschillende middenlijnsnelheid en wandschuifsnelheid en mogen niet worden vergeleken met IVM. Voorbeeldige gegevens van ten minste n = 3 dieren per groep worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse door ongepaarde t-test met de correctie van Welch. Significance werd ingesteld op P < 0,05.
Aanvullende video 1: Microscopisch effect van onvoldoende verwijdering van bindweefsel op cremaster spier. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullende video 2: Veranderde bloedstroom door hypervolemie of hypotensie. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IVM als methode is veel gebruikt om verschillende celtypes in verschillende organen te bestuderen en is uitgebreid beschreven en besproken19. Het belangrijkste doel van deze studie is om een efficiënte aanpak te bieden voor het opzetten en uitvoeren van IVM in de cremaster spier. Het beoefenen van de methode zal betrouwbare en reproduceerbare resultaten opleveren. Planning en standaardisatie zijn dus belangrijke factoren om de techniek onder de knie te krijgen. Bovenal is de techniek zeer afhankelijk van hemodynamische en microvasculaire parameters, die nauwlettend moeten worden gecontroleerd en gecontroleerd. Als zodanig zal verschillende hemodynamica tussen groepen misleidende resultaten opleveren.
Ondanks zijn rol bij het bestuderen van fysiologische en pathologische aandoeningen, kan IVM alleen niet volledig ontrafelen individuele bijdrage van specifieke celtypen aan leukocyten werving bij ontsteking. Daartoe kunnen andere complementaire methoden worden gecombineerd met IVM. Ex vivo-methoden zoals stroomkamerexperimenten kunnen bijvoorbeeld afzetten tussen effecten van het endotheel of de leukocyten. Ook zijn de stroomkamers uitstekende opstellingen om knaagdierbevindingen te vertalen naar menselijke leukocyten, bijvoorbeeld bij pasgeboren baby's20. Verder moeten in vitro methoden zoals FACS of immunohistochemie een aanvulling vormen op IVM-experimenten. Elke methode kan specifieke informatie toevoegen die is verkregen uit een gecontroleerde omgeving met weinig verstorende factoren.
De traumatische cremaster voorbereiding hier gepresenteerd lijkt fysiologische baseline voorwaarden van ontsteking zo dicht mogelijk. Toch is de verplichte chirurgische voorbereiding zelf een stimulans van ontsteking, die moet worden overwogen voor interpretatie. Farmacologische TNF-stimulatie van het cremasterweefsel kan een extra modus bieden om de inflammatoire rekrutering te stimuleren buiten de traumatische chirurgische stimulus16. Verder kunnen verschillende muisstammen veranderde reacties op gestandaardiseerde stimuli vertonen. We hebben aangetoond dat zelfs gemeenschappelijke wilde soorten stammen verschillende basislijnstaten van leukocyten werving kunnen vertonen. Dit toont het belang van het toewijzen van correcte genetische controles, en het vaststellen van basisgegevens voor nieuwe experimentele groepen bij het plannen van experimenten. Aangezien transgene stammen tegenwoordig zeer overvloedig zijn, is het waarschijnlijk dat zelfs dezelfde stammen in de loop van de tijd kunnen verschillen, afhankelijk van de fokkerij.
Samen is IVM een krachtig instrument om de rekrutering van leukocyten in de biologische context van de muis te monitoren en moet gepaard gaan met ex vivo- en in vitro-technieken. Verder, cremaster IVM maakt een verscheidenheid van verschillende modi, waaronder specifieke cel kleuring, ontstekingsstimulatie of farmacologische manipulatie en voorbehandeling. Als zodanig kan het dienen als een platform om verschillende farmacologische bemiddelaars en hun biologische effecten in preklinische studies te evalueren, vooral op het gebied van ontsteking en meer specifiek in ontstekingsspieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) 01GL1746E als onderdeel van het PRIMAL Consortium. De auteurs erkennen Britta Heckmann en Silvia Pezer voor bekwame technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), New York, N.Y. 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
