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Immunology and Infection

इंट्राग्लिस्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन चूहों में क्रेमास्टर मांसपेशी की ल्यूकोसाइट घुसपैठ

Published: April 15, 2020 doi: 10.3791/60509
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neonatology, Heidelberg University Children's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम दिखाते हैं कि माउस क्रेमास्टर मांसपेशी के पोस्ट-केशिका वेल्यूल्स पर इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी कैसे करें। आमतौर पर सूजन और सेप्सिस के विभिन्न मॉडलों पर लागू होता है, विशेष रूप से केमोकिन्स और साइटोकिन्स द्वारा प्रेरित, हम अतिरंजित मांसपेशियों की ल्यूकोसाइट घुसपैठ से जुड़े मस्कोलोपैथी के अध्ययन में इसकी प्रासंगिकता को उजागर करते हैं।

Abstract

इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) का व्यापक रूप से वीवो में ल्यूकोसाइट भर्ती झरना के भीतर शारीरिक और रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल माउस के अक्षुण्ण जीव के भीतर कंकाल की मांसपेशी व्युत्पन्न ऊतक में ल्यूकोसाइट भर्ती के लिए अग्रणी ल्यूकोसाइट एंडोथेलियम बातचीत की कल्पना करने के लिए एक व्यावहारिक और प्रजनन विधि का प्रतिनिधित्व करता है। यह मॉडल अनुसंधान के सभी क्षेत्रों पर लागू होता है जो ग्रैनुलोसाइट सक्रियण और रोग में उनकी भूमिका पर ध्यान केंद्रित करते हैं।

हम विधि के माध्यम से मार्गदर्शन करने और संभावित नुकसान और तकनीकी कठिनाइयों को उजागर करने के लिए कदम प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल में निम्नलिखित पहलुओं को शामिल किया गया है: प्रायोगिक सेटिंग्स और आवश्यक सामग्री, माउस का संज्ञाहरण, क्रेमास्टर मांसपेशी के विच्छेदन के साथ-साथ श्वास और कैरोटिड कैनुलेशन, आईवीएम रिकॉर्डिंग और ऑफ़लाइन विश्लेषण। अनुयायी ल्यूकोसाइट्स, रोलिंग फ्लक्स (आरएफ) और रोलिंग फ्लक्स अंश (आरएफएफ) जैसे डेटा प्रारूपों को विस्तार से समझाया जाता है और उचित अनुप्रयोगों पर चर्चा की जाती है। डिस्ट्रोफिन की कमी वाले एमडीएक्स चूहों से प्रतिनिधि परिणाम परिणाम अनुभाग में प्रदान किए जाते हैं।

आईवीएम वीवो सेटिंग में ल्यूकोसाइट भर्ती का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है; हालांकि, उदाहरण के लिए डिलिनिंग एंडोथेलियल और ल्यूकोसाइट फ़ंक्शन को प्रवाह कक्ष प्रयोगों जैसे पूर्व वीवो सेटअप के साथ संयोजन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, ब्याज के जानवरों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि बहुत बेसलाइन भर्ती को प्रभावित कर सकते हैं, प्रदान प्रोटोकॉल के व्यक्तिगत ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता होती है । अपनी सीमाओं के बावजूद, आईवीएम एक जीवित कशेरुकी जीव में इन विट्रो निष्कर्षों का आसानी से अनुवाद करने के लिए एक मंच के रूप में काम कर सकता है।

Introduction

इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी (आईवीएम) ल्यूकोसाइट जीव विज्ञान के क्षेत्र में आमतौर पर लागू उपकरण है। ल्यूकोसाइट भर्ती ल्यूकोसाइट कैप्चर, रोलिंग और एंडोथेलियल वॉल पर आसंजन द्वारा शुरू की गई अच्छी तरह से परिभाषित घटनाओं के झरने का अनुसरण करती है, और अंत में सूजन1की वास्तविक साइट पर ल्यूकोसाइट्स का ट्रांसग्रेशन और एक्सट्रावेशन। प्रत्येक चरण को विभिन्न केमोकिन (जैसे, आईएल-8/सीएक्ससीएल8), रिसेप्टर्स (जैसे, एलएफए-1, मैक-1) और इसी एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु (जैसे, ICAM-1, VCAM-1 और ई-Selectin)2,,3द्वारा मध्यस्थता और नियंत्रित किया जाता है । विभिन्न नियामक साइटों की बातचीत, ल्यूकोसाइट भर्ती के कारकों और मध्यस्थों को नियंत्रित करने वाले कैस्केड जैसे उन्नत ग्लाइसेशन एंड उत्पादों (क्रोध), इंटरसेलुलर आढ़ती अणु 1 (आईकैम-1), सी-एक्स-सी मोटिफ लिगांड (CXCL) 1/2 और उनके रिसेप्टर CXCR2 को आईवीएम4,,5,,6,,77,8.,का उपयोग करके उजागर किया गया था।

आईवीएम की विधि आंत10,त्वचा11,लिम्फ नोड्स12,भ्रूणयी जर्दी बोरी13 और अन्य जैसे कई अलग-अलग अंगों और ऊतकों के लिए वर्णित की गई है। हालांकि, आईवीएम की सबसे व्यापक रूप से अध्ययन की गई विधि क्रेमास्टर मॉडल है, जिसे पहले चूहों14में वर्णित किया गया था। जबकि अभी भी चूहों15में उपयोग किया जाता है, विधि आजकल मुख्य रूप से विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों की उच्च बहुतायत के कारण चूहों में लागू होती है। हमारे समूह ने हाल ही में डिस्ट्रोफिन की कमी वाले एमडीएक्स चूहों16का अध्ययन करते हुए डुचेर्न मस्कोलोपैथी जैसे भड़काऊ मस्कोलोपैथियों के क्षेत्र में क्रेमास्टर आईवीएम की संभावित भूमिका पर प्रकाश डाला है । अपनी पतली इंटरबुने और आसानी से सुलभ फाइबर संरचना के कारण, क्रेमास्टर मांसपेशी प्रकाश या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पूरे माउंट के रूप में अध्ययन करने के लिए आदर्श उम्मीदवार मांसपेशी का प्रतिनिधित्व करती है। ल्यूकोसाइट भर्ती और एक्सट्रावेशन मुख्य रूप से केशिका वेनुल्स के बाद होता है, जिसे क्रेमास्टर मांसपेशी में निरंतर मांसपेशियों की परत पर आसानी से पहचाना जा सकता है।

अन्य इन विट्रो परखों की तुलना में वीवो इमेजिंग में का लाभ एक जीवित जीव में इसका जैविक संदर्भ है। इसके साथ ही, ल्यूकोसाइट भर्ती में परिवर्तित करने के लिए डेलिनटिंग सेल-विशिष्ट योगदान के लिए अतिरिक्त इन विट्रो मॉडल जैसे फ्लो चैम्बर्स या एंडोथेलियल परख की आवश्यकता हो सकती है। कई तरीकों के संयोजन सबसे समझाने डेटा निकलेगा। वैज्ञानिकों को क्रेमास्टर मॉडल की सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए क्योंकि किसी भी सर्जिकल हेरफेर से ल्यूकोसाइट की तस्करी और भर्ती में वृद्धि होगी । इसलिए बेसलाइन भर्ती का अनुमान लगाना मुश्किल है। अपने व्यापक आवेदन के बावजूद, क्रेमास्टर के आईवीएम चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं और एक उपन्यास सेटअप को स्थापित करने में समय और संसाधन लग सकते हैं। अब हम एक आसान प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो आईवीएम में कुछ सामान्य गलतियों से बचने में मदद करेगा। साथ ही, सीमाओं पर चर्चा की जाएगी और जहां लागू हो, मानार्थ तरीकों पर प्रकाश डाला जाएगा।

क्रेमास्टर का आईवीएम भड़काऊ और संक्रामक अध्ययन के क्षेत्र में लागू किए जाने वाले एक आदर्श दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। अधिक विशेष रूप से, क्रेमास्टर मॉडल भड़काऊ रोग के संदर्भ में कंकाल मांसपेशी जीव विज्ञान का अध्ययन करने वाले वैज्ञानिकों के लिए उच्च रुचि का हो सकता है।

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Protocol

जानवरों को आईबीएफ (इंटरफाकुलट्रे बायोमेडिजिनिश्च फोर्सचुंगसेइनरिचतुंग), हीडलबर्ग में नियंत्रित और विशिष्ट रोगजनक-मुक्त स्थितियों के तहत रखा गया था। यहां वर्णित सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय आईआरबी और रेजिएर्ंगस्प्रासिडियम कार्ल्सरुहे, बडेन-वूर्टेमबर्ग, जर्मनी द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. एनेस्थीसिया प्रशासन

  1. 125 मिलीग्राम/किलो केटामाइन और 12.5 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन के इंट्रापेरिटोनियल (यानी) बोलस इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें।
  2. माउस (36.5-38 डिग्री सेल्सियस) के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर एक पृष्ठीय अनुघटित स्थिति में माउस को रखें और ठीक करें। ललाट दांतों के चारों ओर एक साधारण पाश हवा और टेप हीटिंग पैड के लिए सीवन के सिरों टेप करने के लिए एक गैर अवशोषक बाँझ सीवन (6/0) का प्रयोग करें । इस निर्धारण का उद्देश्य सांस लेने में अशांति से बचने के लिए मुंह खुला रखना है।
  3. इंटरडिजिटल टो चुटकी (वापसी नहीं देखी जानी चाहिए) द्वारा संज्ञाहरण की उचित गहराई के लिए माउस की जांच करें।
  4. एक बार पर्याप्त संज्ञाहरण शल्य चिकित्सा की तैयारी के लिए आगे बढ़ना है। हर 30 मिनट में चल रहे प्रयोग के साथ संज्ञाहरण की बार-बार पुष्टि करें। यदि आवश्यकता हो तो ऊपर वर्णित दवाओं को फिर से प्रशासित करें।
  5. एक्वालिबरेट शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस, संरचना: 132 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgS04,2.0 mmol/L Cacl2, 18 mmol/L NaHCO3)के साथ 5% सीओ 2/95% एन2 15 मिनट के लिए।2 प्रयोग के दौरान 5% सीओ 2/95% एन2 के साथ लगातार बुलबुला पीएसएस और 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।2

2. श्वासनली और कैरोटिड धमनी की शल्य चिकित्सा तैयारी (वैकल्पिक)

  1. मिडलाइन में चिमटी के साथ त्वचा को धीरे से खींचकर गर्दन के क्षेत्र से त्वचा को विच्छेदन करें। सर्जिकल तैयारी के लिए पर्याप्त जगह देने के लिए व्यास में 1-2 सेमी का गोलाकार कट लगाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  2. चिमटी का उपयोग करके आसपास की मांसपेशियों, वसा और संयोजी ऊतकों को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें।
  3. छोटे सर्जिकल कैंची का उपयोग करश्वासा में एक ट्रांसवर्स कट (~ 1.3 मिमी) बनाएं और ऊपरी वायुमार्ग को सुरक्षित करने के लिए श्वासनली के कॉटल अंत के अंदर एक पॉलीथीन ट्यूब (आईडी एक्स ओडी 0.034" x 0.050") पेश करें।
  4. एक गोलाकार गाँठ सीवन (6/0 यूएसपी) द्वारा श्वासनली में स्थित ट्यूब को ठीक करें।
  5. श्वासनली के दाईं ओर कैरोटिड धमनी का पता लगाएं और कैरोटिड धमनी दीवार से आसपास के ऊतकों को विच्छेदन करें। वैकल्पिक रूप से, जुगलबंदी या पूंछ नस का उपयोग i.v. एक्सेस के लिए किया जा सकता है। वागल तंत्रिका को चोट से बचने की कोशिश करें, क्योंकि यह बारीकी से स्थित है।
  6. कैरोटिड धमनी के नीचे सीवन (6/0) के दो टुकड़े पास करें। कैरोटिड धमनियों के विभाजन के करीब पहला कपाल सीवन समीपस्थ रखें और इसे स्थायी रूप से बांधें। दूसरा सीवन पहले से लगभग 5-8 मिमी डिस्टल स्थित होगा और बाद में कैरोटिड धमनी में ट्यूब को सुरक्षित करने के लिए उपयोग किया जाएगा। इसे अभी तक न बांधें।
  7. एक पॉलीथीन ट्यूब (I.D x O.D. 0.011" x 0.024 ") तैयार करें, जिसमें अंतिम भाग को नमकीन (0.9% नैल) से भरी 1 मिलीसी सिरिंज सुई में झुकाकर 30 सेमी की लंबाई के साथ। तैयारी के दौरान वायु एम्बोलाइजेशन को रोकने के लिए कठोर फ्लशिंग महत्वपूर्ण है।
  8. दूसरे सीवन के कैरोटिड धमनी को दबाने के लिए 7 मिमी पोत क्लिप का उपयोग करें।
  9. कैरोटिड धमनी में एक छोटा सा ट्रांसवर्स कट (~ 0.5 मिमी) करें और बाँझ पॉलीथीन ट्यूब पेश करें। पहले तैयार किए गए दूसरे सीवन का उपयोग करके धमनी में ट्यूब सुरक्षित करें।
  10. वेसल क्लिप निकालें और धीरे-धीरे पॉलीथीन ट्यूब से जुड़ी सिरिंज पर थोड़ा तनाव लगाएं। इस कैरोटिड कैथेटर का उपयोग अब दवाओं को प्रशासित करने या आवश्यकता पड़ने पर रक्त के नमूने लेने के लिए किया जा सकता है, यहां तक कि संबंधित उपकरणों के साथ रक्तचाप या पल्स दर की निगरानी भी संभव है।

3. क्रेमास्टर मांसपेशी की शल्य चिकित्सा तैयारी

  1. बाद में माइक्रोस्कोपी के लिए मंच रखने वाले कस्टम-मेड प्लास्टिक फ्रेम में हीटिंग पैड (हीटिंग पैड के साथ) पर माउस को स्थानांतरित करें। माइक्रोस्कोप चरण का सामना कर रहे अपने अंडकोश के साथ माउस उन्मुख करें।
    1. आगे बढ़ने से पहले संज्ञाहरण की गहराई का पुनर्मूल्यांकन; यदि आवश्यक हो तो संज्ञाहरण की आधी खुराक के लिए एक चौथाई फिर से प्रशासन।
  2. अंडकोश को स्थानीय कृत करें, चिमटी का उपयोग करके इसे अपने सबसे दूर भाग में रखें, इसे धीरे से खींचें और व्यास में लगभग 5 मिमी के साथ स्क्रोटल त्वचा के एक परिपत्र अनुभाग को काट दें। क्रेमास्टर मांसपेशी जैसी अंतर्निहित संरचनाओं को नुकसान न पहुंचाना सुनिश्चित करें। नमकीन समाधान के साथ खुले ऊतक को अच्छी तरह से हाइड्रेटेड रखना सुनिश्चित करें।
  3. दो चिमटी का उपयोग करढीला संयोजी ऊतक विच्छेदन और दोनों वृषण स्थानीयकरण।
  4. एक टेस्टिस को डिस्टली पकड़ो और धीरे-धीरे इसे खींचना शुरू करें, आसपास के संयोजी ऊतक को चरणबद्ध रूप से हटा दें।
  5. एक बार टेस्टिस बाहरी हो जाने के बाद, मंच के आसपास रबर की अंगूठी के लिए अपने डिस्टल अंत पिन करें। बाहरीकरण पर, पूरी प्रक्रिया के दौरान खारे समाधान के साथ ऊतक को हाइड्रेट करें।
  6. महत्वपूर्ण कदम: अंतर्निहित क्रेमास्टर मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाए बिना संयोजी ऊतक को सावधानीपूर्वक हटा दें। अतिरिक्त संयोजी ऊतक बाद में माइक्रोस्कोपी में दृष्टि में बाधा डाल सकता है और धुंधली छवियों का उत्पादन कर सकता है।
  7. टेस्टिस के डिस्टल हिस्से को नीचे पिन करें और क्रेमास्टर मांसपेशी को एक छोटे ट्रांसवर्स कट (लगभग 1 मिमी) द्वारा खोलें, जिसके बाद बहुत ही डिस्टल से समीपस्थ अंत तक देशारोहण चीरा लगाया जाता है। नतीजतन क्रेमास्टर मांसपेशी को गोलाकार खोलना चाहिए। स्थूल रूप से दिखाई देने वाले पोत को कटे नहीं रहना चाहिए, क्योंकि इससे हीमोडायडायनामिक्स प्रभावित हो सकता है।
  8. ध्यान से कांच के चरण पर मांसपेशियों को फैलाएं और रबर की अंगूठी में पिन करें। सुनिश्चित करें कि मध्य क्षेत्र को छूने या नुकसान न पहुंचाएं, क्योंकि माइक्रोस्कोपी यहां की जाएगी।
    सावधानी: अधिक खिंचाव रक्त प्रवाह में बाधा डाल सकता है।
  9. ब्याज के क्षेत्र तक पहुंच देने के लिए शेष टेस्टिस को अलग से पिन करें। सुखाने को रोकने के लिए बार-बार पीएसएस के साथ गीला करना सुनिश्चित करें। घुड़सवार मांसपेशी अब माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार है।

4. इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी

  1. ऊपर माइक्रोस्कोप में घुड़सवार क्रेमास्टर मांसपेशी रखें और 40x उद्देश्य का उपयोग करमाइक्रोस्कोपी करें।
  2. उच्च थ्रूपुट इमेजिंग स्पेक्ट्रोग्राफी का उपयोग करके डेटा और निर्यात प्राप्त करें।
  3. प्रीहीटेड (35-37 डिग्री सेल्सियस) पीएसएस17के साथ निरंतर सुपरफ्यूजन के तहत रिकॉर्डिंग करें। मांसपेशियों के ऊतकों पर नीचे उद्देश्य के साथ पीएसएस के निरंतर टपकाव की अनुमति देने के लिए माइक्रोस्कोप के ईमानदार उद्देश्य के लिए टेप किया गया है कि एक छोटे से टयूबिंग द्वारा सुपरफ्यूजन लागू करें ।
  4. केशिका वेनुल्स (दो छोटे जहाजों का संगम) की पहचान करें और 20-40 माइक्रोन के व्यास के साथ वेंल्यूल्स पर माइक्रोसर्कुलेशन को मापें।
  5. 30 एस की एक समय सीमा में क्रेमास्टर मांसपेशी से माइक्रोसर्कुलेशन की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को रिकॉर्ड करें। चूंकि रिकॉर्डिंग के दौरान मांसपेशियों के ऊतकों में मामूली संकुचन और छूट हो सकती है, इसलिए ध्यान को लगातार समायोजित करना सुनिश्चित करें। आम तौर पर, माउस लगभग 2 घंटे तक स्थिर परिसंचरण प्रदर्शित करता है। विभिन्न क्षेत्रों से विभिन्न जहाजों की कई रिकॉर्डिंग प्राप्त करना संभव है। एक या दोनों टेस्टिस का उपयोग बाद में किया जा सकता है।
    नोट: चूंकि यह सूजन का एक मॉडल है, इसमें शामिल होने के सामान्य तरीके हैं: प्रणालीगत Nआवेदन या प्रो भड़काऊ मध्यस्थों के स्थानीय स्क्रोटल इंजेक्शन के साथ-साथ उदाहरण के लिए एन-फॉरिलमेथिओनिल-ल्यूसिल-फिनाइललिन (एफएमएलपी)। स्थानीय टीएनएफ-α उत्तेजना का उपयोग आमतौर पर ल्यूकोसाइट भर्ती को ट्रिगर करने के लिए किया जाता है; एलपीएस-प्रेरित एंडोटॉक्सीमिया सिरों गंभीर प्रणालीगत सूजन का एक मॉडल है।

5. ल्यूकोसाइट दृश्य

नोट: अनुयायी और रोलिंग ल्यूकोसाइट्स को आगे की दृश्य के बिना आसानी से देखा जा सकता है। स्वतंत्र रूप से चलती ल्यूकोसाइट्स के केंद्र रेखा वेग का निर्धारण करने के लिए, अंतर धुंधला प्रदर्शन करें।

  1. यदि ईजीएफपी लेबल वाले चूहों का उपयोग किया जाता है, तो सीधे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा उनका विश्लेषण करें।
  2. गैर-ईजीएफपी लेबल माउस उपभेदों के लिए, रोडामिन धुंधला का उपयोग करें।
    1. 0.2 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन पर रोडामिन 6जी का प्रशासन करें। पर्याप्त धुंधला तीव्रता प्राप्त करने के लिए बार-बार खुराक की आवश्यकता हो सकती है। छोटे वॉल्यूम रखना सुनिश्चित करें, क्योंकि बड़ी मात्रा हीमोडायनामिक मापदंडों को प्रभावित कर सकती है।
    2. ल्यूकोसाइट्स के तत्काल धुंधला होने के लिए, कैरोटिड धमनी के माध्यम से दाग का प्रशासन करें। यदि कैरोटिड धमनी विच्छेदन नहीं किया गया है, तो एक ही खुराक18का उपयोग करके आवेदन द्वारा पर्याप्त धुंधला प्राप्त किया जा सकता है। कैरोटिड धमनी कैथेटराइजेशन के विकल्प के रूप में, किसी भी अन्य विषैले कैथेटराइजेशन को किया जा सकता है।
      नोट: ध्यान रखें कि रोडामिन धुंधला, eGFP लेबलिंग के विपरीत, फ्लोरेसेंस तीव्रता के समय क्षय के साथ-साथ उच्च सांद्रता पर ल्यूकोसाइट्स के लगभग 80% की समग्र धुंधला अधिकतम दिखाता है।
    3. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा स्वतंत्र रूप से चलती रोडामिन दाग ल्यूकोसाइट्स की कल्पना करें।

6. प्रयोग का अंत

नोट: इस प्रोटोकॉल को करने का कुल अनुमानित समय 90 - 150 मिनट होना चाहिए।

  1. सर्वाइकल अव्यवस्था से इच्छामृत्यु के साथ प्रयोग समाप्त करें।
  2. आगे के विश्लेषण ों के लिए, जैसे ट्रांसमाइग्रेशन, पीएफए में क्रेमास्टर मांसपेशी को ठीक करते हैं, जबकि अभी भी मंच पर फैला हुआ है और आवश्यकतानुसार हिटोलॉजी के लिए दाग दिया गया है।

7. ऑफलाइन विश्लेषण

  1. वीडियो प्लेबैक के दौरान सरल मामलों के रूप में निम्नलिखित मापदंडों का विश्लेषण करें।
    1. रोलिंग फ्लक्स की गणना करें [संख्या/मिन]: रोलिंग कोशिकाओं की संख्या एक काल्पनिक लाइन गुजर/
    2. आसंजन की गणना करें [संख्या/मिमी2]:देखने के क्षेत्र के भीतर पोत की दीवार के लिए चिपकने वाली कोशिकाओं की संख्या 30/संवहनी सतह [मिमी2]।
  2. इमेजजे का उपयोग करके निम्नलिखित हीमोडायनामिक और माइक्रोवैस्कुलर पैरामीटर ों को मापें।
    1. भीतरी दीवार व्यास के रूप में पोत व्यास [μm] की गणना करें।
    2. पोत की केंद्र रेखा की लंबाई के रूप में पोत की लंबाई [μm] की गणना करें।
    3. केंद्र लाइन में Equation 1 स्वतंत्र रूप से चलती ल्यूकोसाइट्स के फ्रेम-टू-फ्रेम वीडियो विश्लेषण से प्राप्त केंद्र लाइन वेग की गणना करें।
  3. अनुमान के रूप में निम्नलिखित समीकरणों का उपयोग करें।
    1. [मिमी2]में संवहनी सतह की गणना करें: पोत की लंबाई [μm] एक्स पोत व्यास [μm] x10-6।
    2. दीवार कतरनी Equation 2 दर की गणना करें: 4.9 Equation 1 x (8 एक्स सेंटर लाइन वेग x 0.625/पोत व्यास [μm]) ।
    3. गणना का मतलब Equation 1 रक्त प्रवाह वेग: केंद्र लाइन वेग Equation 1 x 0.625।
    4. कुल ल्यूकोसाइट फ्लक्स Equation 4 की गणना करें: प्रणालीगत ल्यूकोसाइट गिनती Equation 5 एक्स (मतलब रक्त प्रवाह वेग Equation 1 x 60/1000) एक्स एक्स Equation 6 एक्स।
    5. रोलिंग फ्लक्स अंश की गणना करें [%]: रोलिंग फ्लक्स/टोटल ल्यूकोसाइट फ्लक्स एक्स 100।

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Representative Results

प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार आईवीएम कंकाल की मांसपेशी में ल्यूकोसाइट भर्ती के झरने में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्राप्त करेगा। परिणाम अनुभाग आईवीएम द्वारा प्राप्त विशिष्ट परिणामों पर ध्यान केंद्रित करेगा और संभावित समस्याओं को उजागर करेगा जो सामना कर सकते हैं।

इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी के लिए प्रायोगिक सेटअप चित्र ा 1में उल्लिखित है । क्रेमास्टर मांसपेशी की तैयारी और संयोजी ऊतक को हटाने के लिए एक समान सतह के साथ केंद्रित सूक्ष्म छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। अतिरिक्त संयोजी ऊतक अंततः आईवीएम करते समय धुंधली सूक्ष्म छवियों(पूरक वीडियो 1)की ओर जाता है। चित्रा 2 प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों को दिखाता है जिन्हें आईवीएम का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। सबसे पहले, केशिका के बाद venules, जो व्यास में 20-40 μm के बीच होना चाहिए, दो छोटे जहाजों के संगम से पहचाने जाते हैं । केवल अनुयायी और रोलिंग ल्यूकोसाइट्स की कल्पना की जा सकती है, घूम-घूम करने वाले ल्यूकोसाइट्स को केवल रिकॉर्ड किए गए वीडियो की धीमी गति पुनरावृत्ति में ट्रैक किया जा सकता है। अनुयायी ल्यूकोसाइट्स की संख्या को 30 सेकंड के समय स्थिर ल्यूकोसाइट्स के रूप में परिभाषित किया गया है और पोत सतह(चित्रा 2)के प्रति मिमी2 को व्यक्त किया जाता है। पोत के पहले से परिभाषित क्रॉस-सेक्शन को पास करने वाले रोलिंग ल्यूकोसाइट्स की संख्या गिनी जाती है; रोलिंग वेग ऑफलाइन विश्लेषण में प्राप्त किया जा सकता है। रोलिंग रोलिंग फ्लक्स (आरएफ = एक पूर्वनिर्धारित लाइन/मिन पर रोलिंग कोशिकाओं की संख्या) के रूप में या रोलिंग फ्लक्स अंश के रूप में व्यक्त किया जा सकता है (RFF में% = आरएफ/ आरएफ परिसंचारी कोशिकाओं की संख्या पर अत्यधिक निर्भर है, जबकि आरएफएफ सफेद रक्त कोशिका गिनती (WBCs) में परिवर्तन से कम प्रभावित है । ध्यान दें कि कई मामलों में ल्यूकोसाइट पालन और रोलिंग उलटा संबंधित हैं; अनुयायी ल्यूकोसाइट्स की एक उच्च संख्या स्वतंत्र रूप से परिसंचारी कोशिकाओं के पूल को कम कर सकती है और इस प्रकार ल्यूकोसाइट रोलिंग को गीला कर सकती है।

तकनीकी चुनौतियां और संभावित नुकसान
क्रेमास्टर मांसपेशी टेस्टिस को संलग्न करती है और एक गोलाकार संरचना को इकट्ठा करती है। रिकॉर्डिंग चरण पर मांसपेशियों को माउंट करने के लिए, गोले को खोलने के लिए एक देशीयांश चीरा की आवश्यकता होती है। यह समग्र माइक्रोवेकुल्चर को प्रभावित कर सकता है क्योंकि छोटे जहाजों को कटे किया जा सकता है। रक्त प्रवाह को बदल करने के लिए पूर्वाग्रह से बचने के लिए, पुनर्व्यवस्थित करने के लिए केंद्रीय क्षेत्र का चयन करने की सलाह दी जाती है। इस क्षेत्र को न तो छुआ जाना चाहिए और न ही हेरफेर करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, माइक्रोकेटेरी रक्तस्राव और माइक्रोवेस्कुलर हीमोडायनामिक्स में परिवर्तन को रोक सकता है। आसपास के केशिकाओं का रक्त प्रवाह आम तौर पर एक मूल्यवान संकेत प्रदान करता है यदि ब्याज के क्षेत्र में तैयारी के कारण परिसंचरण प्रभावित होता है। सामान्य तौर पर, अधिक समीपस्थ जहाजों (माउस के शरीर की ओर) बेहतर माइक्रोसर्कुलेशन दिखाने के लिए करते हैं, हालांकि छवि पर कब्जा वृद्धि की गति और गड़बड़ी से जटिल हो सकता है जो जानवर की सांस लेने से होता है।

सूक्ष्म रिकॉर्डिंग के दौरान क्रेमास्टर मांसपेशी को सूखने से रोकने के लिए, ऊतक का स्थायी सुपरफ्यूजन प्रतिष्ठित है। अपर्याप्त या बाधित गीला ऊतक और प्रयोग की विफलता के सूखने में परिणाम होगा।

क्रेमास्टर ऊतक के पिनिंग इसे फैला और जगह में रखने के लिए आवश्यक है। स्ट्रेटेड मांसपेशी को समतल करने के लिए, कोमल खींचकी आवश्यकता होती है। असमान ऊतक में बहुत कम खिंचाव के परिणामस्वरूप, जो माइक्रोस्कोपी को जटिल बनाता है, अत्यधिक खिंचाव रक्त प्रवाह को प्रतिबंधित करेगा और ऊतक को नुकसान पहुंचाएगा। फिर केशिका रक्त प्रवाह ऊतक की समग्र संचार स्थिति की एक विश्वसनीय स्थिति प्रदान करता है। ऊतक बढ़ते समय खिंचाव की डिग्री निर्धारित करने के लिए अनुभव और अभ्यास की आवश्यकता होती है।

लंबे समय तक तैयारी का समय जीव और पूर्वाग्रह डेटा की समग्र भड़काऊ स्थिति को प्रभावित करेगा। इसलिए, प्रयोग डिजाइन करते समय रुचि के प्रश्न पर ध्यान केंद्रित करना सुनिश्चित करें और तैयारी के समय को आवश्यक के रूप में कम रखें। यदि कोई दवा प्रशासन, मॉनिटर या रक्त परीक्षण की आवश्यकता है क्रेमास्टर ऊतक की एक विलक्षण तैयारी पर्याप्त हो सकता है ।

अधिकांश सेटिंग्स में, विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों की तुलना जंगली प्रकार के जानवरों से की जाएगी। यह सुनिश्चित करना निर्णायक महत्व पूर्ण है कि हीमोडायनामिक और माइक्रोवैस्कुलर पैरामीटर प्रायोगिक समूहों(तालिका 1)के बीच समान हैं। पैरामीटरों की एक भीड़ हृदय उत्पादन, पोत व्यास, केंद्र लाइन वेग, दीवार कतरनी दर और परिसंचारी ल्यूकोसाइट्स की संख्या सहित विवो में ल्यूकोसाइट भर्ती को प्रभावित कर सकती है। तालिका 1 दो अलग-अलग ट्रांसजेनिक माउस लाइनों, डिस्ट्रोफिन की कमी वाले एमडीएक्स माउस और लिस-ईजीएफपी माउस (न्यूट्रोफिल्स और मैक्रोफेज में एलवाईएस प्रमोटर के तहत ईजीएफपी व्यक्त करना) से डेटा प्रदर्शित करता है। जबकि पोत व्यास जैसे मापदंडों को अन्वेषक द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है, सेंटरलाइन वेग और कतरनी दर व्यक्तिगत प्रयोगात्मक समूह या माउस तनाव के हीमोडायनामिक्स पर निर्भर करती है। जाहिर है, सेंटरलाइन वेग और दीवार कतरनी दर एमडीएक्स और lys-eGFP चूहों(तालिका 1)के बीच काफी अलग है आईवीएम डेटा असंभव की सार्थक तुलना कर रही है (वेल्च के सुधार के साथ टी-टेस्ट द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण, महत्व पी एंड एलटी; 0.05 पर सेट किया गया था)। सेंटरलाइन वेग कार्डियक आउटपुट, परिधीय संवहनी प्रतिरोध और इंट्रावासल वॉल्यूम से प्रभावित होता है। उदाहरण के लिए, कैरोटिड कैथेटर के माध्यम से दिए गए रोडामिन या किसी अन्य प्रयोगात्मक पदार्थ की एक बड़ी मात्रा पोस्ट केशिका सेंटरलाइन वेग को बढ़ाती है और ल्यूकोसाइट कैप्चर और रोलिंग(पूरक वीडियो 2)को रोकती है। इसके विपरीत, कार्डियक विफलता, गहरी संज्ञाहरण या हाइपोथर्मिया के बाद केशिका प्रवाह में कमी आ सकती है। आईवीएम डेटा के ऑफ़लाइन विश्लेषण के निकट आने से पहले, सार्थक निष्कर्ष निकालने और पूर्वाग्रह को कम करने के लिए डेटा गुणवत्ता (उदाहरण के लिए शारीरिक श्रेणियों के भीतर हीमोडायनामिक पैरामीटर) की आवश्यकताओं को परिभाषित किया जाना चाहिए।

सेंटरलाइन वेग निर्धारित करने के लिए, स्वतंत्र रूप से घूम ल्यूकोसाइट्स की कल्पना करने की आवश्यकता है। या तो फ्लोरोसेंट ल्यूकोसाइट्स (जैसे lys-eGFP चूहों) का उपयोग किया जा सकता है या ल्यूकोसाइट्स को रोडामाइन(चित्रा 3)जैसे फ्लोरोसेंट रिएजेंट्स के साथ रंगे जाना चाहिए। रोडाडीन कैरोटिड कैथेटर के माध्यम से या एक आईपी इंजेक्शन के रूप में लागू किया जा सकता है। चूंकि रोडामिन को धीरे-धीरे अन्य सेल प्रकारों द्वारा भी लिया जाता है, इसलिए खुराक और समय का एक टिट्रेशन आवश्यक है। अतिरिक्त खुराक और लंबे अंतराल माइक्रोस्कोपी के दौरान महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि का उत्पादन करेंगे।

अंत में, हम विभिन्न माउस उपभेदों की जैविक विविधता को इंगित करना पसंद करते हैं। आनुवंशिक रूप से परिवर्तित उपभेदों के अलावा, आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं जंगली प्रकार के उपभेदों शारीरिक विचरण दिखा सकते हैं। चित्रा 4 आमतौर पर नियोजित काले 6 (C57BL/6) की तुलना काले 10 (C57BL/10ScSn) चूहों से करता है । काले 6 चूहों स्पष्ट रूप से काले 10 चूहों की तुलना में ल्यूकोसाइट्स के बढ़े हुए रोलिंग, आसंजन और ट्रांसफ्यूजन (तुकी के बाद तदर्थ परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण; महत्व पी एंड एलटी; ०.०५ में स्थापित किया गया था), भले ही दोनों उपभेदों को जंगली प्रकार के रूप में संदर्भित किया जाएगा । इसलिए, सही आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर विचार किया जाना चाहिए, खासकर ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करते समय। हमारी प्रायोगिक सेटिंग में, काले 6 चूहों और ट्रांसजेनिक एमडीएक्स चूहों (काले 10 पृष्ठभूमि) की तुलना काफी हद तक अपने सही काले 10 जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि(चित्रा 4)पर डिस्ट्रोफिन की कमी वाले एमडीएक्स चूहों की बढ़ी हुई भड़काऊ स्थिति को छुपादेगी।

Figure 1
चित्रा 1:क्रेमास्टर मांसपेशी पर आईवीएम का योजनाबद्ध प्रयोगात्मक सेटअप। संज्ञाहरण के बाद, श्वासनली को कैरोटिड धमनी में रखा जाता है। क्रेमास्टर मांसपेशी को प्रकाश माइक्रोस्कोपी या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी के लिए उजागर और तैयार किया जाता है। वीडियो बाद में ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए प्राप्त किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अनुक्रमिक फ्रेम के साथ इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी से प्रतिनिधि के बाद केशिका वेनुल सेगमेंट। बाएं कॉलम में प्रकाश सूक्ष्म छवियों को दिखाया गया है, बेहतर दृश्य के लिए पोत को बिंदीदार रेखाओं के साथ रेखांकित किया गया है। इस वेनुल की पहचान कन्फ्लोरेंट जहाजों (लाल तारकद्वारा चिह्नित) और 40 माइक्रोन के पोत व्यास से की जाती है। सही कॉलम में इसी बाईं छवि का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दर्शाया गया है, जिसमें लाल रंग में ल्यूकोसाइट्स दिखाई देते हैं। पहली चार पंक्तियां समय के साथ एक ही पोत की अनुक्रमिक छवियां दिखाती हैं । नीचे पंक्ति अनुयायी ल्यूकोसाइट्स इंगित करता है। योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व में, व्यक्तिगत ल्यूकोसाइट्स और उनकी रोलिंग दूरी चिह्नित की जाती है। प्रति वर्ग मिलीमीटर ऑफ़लाइन विश्लेषण पालन में, रोलिंग फ्लक्स के साथ-साथ रोलिंग वेग की गणना की जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: रोलिंग ल्यूकोसाइट्स फ्लोरोसेंट मार्कर की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति या रोडामाइन के साथ माध्यमिक धुंधला द्वारा कल्पना की जा सकती है। ईजीएफपी ल्यूकोसाइट्स और रोडामिन लेबल ल्यूकोसाइट्स की ल्यूकोसाइट भर्ती की प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियां प्रत्येक एन = 3 जानवरों से ल्यूकोसाइट्स लेबल। रोलिंग न्यूट्रोफिल ्स जो लायस-ईजीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों से एलईएस प्रमोटर के तहत ईजीएफपी को व्यक्त करता है, सीधे इम्यूनोफ्लोरेसेंट माइक्रोस्कोपी (बाएं कॉलम) द्वारा पता लगाया जा सकता है। फ्लोरोसेंट निर्माताओं के बिना ल्यूकोसाइट्स को रोडामाइन (सही कॉलम) के नसों या इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन से दाग दिया जा सकता है। विशेष रूप से, रोडाइन को विशेष रूप से न्यूट्रोफिल द्वारा नहीं लिया जाता है, जिससे काफी अधिक पृष्ठभूमि मिल जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न ट्रांसजेनिक और जंगली प्रकार माउस उपभेदों में ल्यूकोसाइट भर्ती की तुलना। (A)रोलिंग फ्लक्स अंश,(बी)आसंजन और(सी)ल्यूकोसाइट्स के ट्रांसफ्यूजन की तुलना काले 6 (C57BL/6J), ब्लैक 10 (C57BL/10ScSnJ) और एमडीएक्स चूहों (C57BL/10ScSn-DmdmdxJ) के बीच की तुलना में है, जो मतलब + SEM. ब्लैक 6 चूहों काले 10 चूहों की तुलना में बढ़ाया ल्यूकोसाइट भर्ती दिखाया गया है । इसी तरह, एमडीएक्स चूहों में काले 10 की तुलना में अधिक भर्ती होती है, लेकिन काले 6 जंगली प्रकार के चूहों की तुलना में नहीं। यह डेटा सही आनुवंशिक नियंत्रण आवंटित करने के महत्व को दर्शाता है । प्रति समूह कम से कम एन = 3 जानवरों से डेटा। तुकी के बाद तदर्थ विश्लेषण के साथ एक तरह से ANOVA द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण । महत्व पी एंड एलटी; 0.05 पर स्थापित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

माउस तनाव नहीं. चूहों की नहीं. वेणुल्स की पोत व्यास सेंटरलाइन वेग दीवार कतरनी दर प्रणालीगत डब्ल्यूबीसी
एन एन सुक्ष्ममापी μm/s एस -1 /μl
Mdx 3 12 28 ± 4 1150 ± 50 1010 ± 100 5200 ± 300
lys-eGFP 3 15 27 ± 2 2220 ± 90 2030 ± 90 5800 ± 100
पी 0.83 0.0005 0.0016 0.13

तालिका 1: दो अलग-अलग ट्रांसजेनिक माउस लाइनों से प्रासंगिक हीमोडायनामिक और माइक्रोवेस्कुलर पैरामीटर। वेसल व्यास, सेंटर लाइन वेग, दीवार कतरनी दर और प्रणालीगत डब्ल्यूबीसी डिस्ट्रोफिन और lys-eGFP चूहों की कमी एमडीएक्स चूहों के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं । इस उदाहरण में एमडीएक्स चूहों (C57BL/10J, काले 10 पृष्ठभूमि) और lys-eGFP चूहों (C57BL/6J, काले 6 पृष्ठभूमि) सांख्यिकीय अलग केंद्र वेग और दीवार कतरनी दर दिखाने के लिए और आईवीएम का उपयोग कर तुलना नहीं की जानी चाहिए । प्रति समूह कम से कम एन = 3 जानवरों से अनुकरणीय डेटा मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। वेल्च के सुधार के साथ अपेयर टी-टेस्ट द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण। महत्व पी एंड एलटी; 0.05 पर स्थापित किया गया था।

पूरक वीडियो 1: क्रेमास्टर मांसपेशियों पर संयोजी ऊतक को अपर्याप्त हटाने का सूक्ष्म प्रभाव। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

पूरक वीडियो 2: या तो हाइपरवोलेमिया या हाइपोटेंशन द्वारा बदल रक्त प्रवाह। कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

आईवीएम का उपयोग विभिन्न अंगों में विभिन्न कोशिका प्रकारों का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से किया गया है औरइसे 19पर व्यापक रूप से वर्णित और चर्चा की गई है । इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य क्रेमास्टर मांसपेशी में आईवीएम स्थापित करने और प्रदर्शन करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करना है। विधि का अभ्यास विश्वसनीय और प्रजनन योग्य परिणाम का उत्पादन करेगा। इस प्रकार, तकनीक में महारत हासिल करने के लिए योजना और मानकीकरण प्रमुख कारक हैं। सबसे बड़ी बात यह है कि यह तकनीक हीमोडायनामिक और माइक्रोवैस्कुलर मापदंडों पर बहुत निर्भर है, जिसपर बारीकी से नजर रखने और नियंत्रित करने की जरूरत है । इस प्रकार, समूहों के बीच विभिन्न हीमोडायनामिक्स भ्रामक परिणाम देंगे।

शारीरिक और रोग की स्थिति का अध्ययन करने में अपनी भूमिका के बावजूद, अकेले आईवीएम सूजन में ल्यूकोसाइट भर्ती के लिए विशिष्ट सेल प्रकारों के व्यक्तिगत योगदान को पूरी तरह से नहीं सुलझा सकता है। ऐसा करने के लिए, अन्य पूरक तरीकों को आईवीएम के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, फ्लो चैंबर प्रयोगों जैसे पूर्व वीवो विधियां एंडोथेलियम या ल्यूकोसाइट के प्रभावों के बीच रेखांकित हो सकती हैं। इसके अलावा, फ्लो कक्ष मानव ल्यूकोसाइट्स में कृंतक निष्कर्षों का अनुवाद करने के लिए उत्कृष्ट सेटअप हैं, उदाहरण के लिए नवजात शिशुओं में20। इसके अलावा, एफएसीएस या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसे इन विट्रो विधियों को आईवीएम प्रयोगों का पूरक होना चाहिए। प्रत्येक विधि छोटे भ्रामक कारकों के साथ एक नियंत्रित वातावरण से प्राप्त विशिष्ट जानकारी जोड़ सकती है।

यहां प्रस्तुत दर्दनाक क्रेमास्टर तैयारी यथासंभव बारीकी से सूजन की शारीरिक आधारभूत स्थितियों जैसा दिखता है। फिर भी, अनिवार्य शल्य चिकित्सा तैयारी ही सूजन का एक प्रोत्साहन है, जो व्याख्या के लिए विचार किया जाना चाहिए । क्रेमास्टर ऊतक की फार्माकोलॉजिकल टीएनएफ उत्तेजना दर्दनाक सर्जिकल उत्तेजना16से परे भड़काऊ भर्ती को बढ़ावा देने के लिए एक अतिरिक्त मोड प्रदान कर सकती है। इसके अलावा, विभिन्न माउस उपभेदों मानकीकृत उत्तेजनाओं के प्रति बदल प्रतिक्रियाएं दिखा सकते हैं। हमने दिखा दिया है कि आम जंगली प्रकार के उपभेद भी ल्यूकोसाइट भर्ती के विभिन्न आधारभूत राज्यों का प्रदर्शन कर सकते हैं। यह सही आनुवंशिक नियंत्रण निर्दिष्ट करने के महत्व को दर्शाता है, और प्रयोगों की योजना बनाते समय नए प्रयोगात्मक समूहों के लिए बेसलाइन डेटा स्थापित करता है। चूंकि ट्रांसजेनिक उपभेद इन दिनों अत्यधिक प्रचुर मात्रा में हैं, इसलिए यह संभावना है कि प्रजनन के आधार पर समय के साथ भी एक ही उपभेद भिन्न हो सकते हैं।

एक साथ लिया, आईवीएम माउस के जैविक संदर्भ में ल्यूकोसाइट भर्ती की निगरानी करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है और पूर्व वीवो और इन विट्रो तकनीकों के साथ होना चाहिए। इसके अलावा, क्रेमास्टर आईवीएम विशिष्ट सेल धुंधला, भड़काऊ उत्तेजना या औषधीय हेरफेर और प्रीट्रीटमेंट सहित विभिन्न मोड की एक किस्म की अनुमति देता है। इस प्रकार यह विभिन्न औषधीय मध्यस्थों और प्रीक्लीनिकल अध्ययनों में उनके जैविक प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक मंच के रूप में काम कर सकता है, विशेष रूप से सूजन के क्षेत्र में और अधिक विशेष रूप से भड़काऊ मस्कुलोपैथी में।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को प्राइमल कंसोर्टियम के हिस्से के रूप में जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री ऑफ एजुकेशन एंड रिसर्च (बीएमबीएफ) 01GL1746E द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक निपुण तकनीकी सहायता के लिए ब्रिटा हेकमैन और सिल्विया पेजर को स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Ketanest S Pfizer Pharma GmbH PZN: 08509909 anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine
Xylazine CP-Pharma GmbH Article-nr.: 1205  anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride)
Saline Solution B. Braun Melsungen  PZN 02737756 surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride
Syringe needle Omnican F B. Braun Melsungen  REF 9161502 surgical preparation 
Suture 6/0 USP Resorba REF 4217 surgical preparation 
Polyethylene tube #10  BD GmbH Supplier No. 427401 surgical preparation 
Polyethylene tube #90  BD GmbH Supplier No. 427421 surgical preparation 
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich Chemie GmbH CAS Number 989-38-8  leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate
Setup Equipment
Upright microscope  Olympus  BX51W1 microscopy
40-fold objective  Zeiss Achroplan 40 × /0.80 W microscopy
ImSpector software Lavision Biotec GmbH ver. 4.0.469 software
ImageJ National Institute of Health, USA ver. 1.51j8 software

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References

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 158 इंट्रावेटल माइक्रोस्कोपी ल्यूकोसाइट्स क्रेमास्टर आसंजन सूजन कंकाल की मांसपेशी एमडीएक्स
इंट्राग्लिस्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन चूहों में क्रेमास्टर मांसपेशी की ल्यूकोसाइट घुसपैठ
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Kranig, S. A., Lajqi, T., Tschada,… More

Kranig, S. A., Lajqi, T., Tschada, R., Braun, M., Kuss, N., Pöschl, J., Hudalla, H. Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (158), e60509, doi:10.3791/60509 (2020).

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