Summary
Een nieuwe draadloze techniek voor het opnemen van extracellulaire neurale signalen uit de hersenen van vrij zwemmen goudvis wordt gepresenteerd. Het opnameapparaat bestaat uit twee tetrodes, een Microdrive, een neurale datalogger en een waterdichte behuizing. Alle onderdelen zijn op maat gemaakt, met uitzondering van de datalogger en de connector.
Abstract
De neurale mechanismen voor het gedrag van vissen blijven grotendeels onbekend, hoewel vissen de meerderheid van alle gewervelde dieren vormen. De mogelijkheid om hersenactiviteit van vrij bewegende vis op te nemen, zou het onderzoek naar de neurale basis van het visgedrag aanzienlijk vooruit brengen. Bovendien is nauwkeurige controle van de opnamelocatie in de hersenen van cruciaal belang voor het bestuderen van gecoördineerde neurale activiteit tussen regio's in de hersenen van de vis. Hier presenteren we een techniek die draadloos registreert vanuit de hersenen van het vrij zwemmen van vis tijdens het beheersen van de diepte van de opnamelocatie. Het systeem is gebaseerd op een neurale logger die is gekoppeld aan een nieuw water-compatibel implantaat dat de opnamelocatie kan aanpassen door Microdrive-gestuurde tetrodes. De mogelijkheden van het systeem worden geïllustreerd door opnames van de telencephalon van Goldfish.
Introduction
Vissen zijn de grootste en meest diverse groep gewervelde dieren, en net als andere gewervelde dieren vertonen ze complexe cognitieve vaardigheden zoals navigeren, socialiseren, slapen, jagen, enz. Niettemin, de neurale mechanismen voor het gedrag van de vis blijven voor het grootste deel onbekend.
In de afgelopen decennia zijn extracellulaire opnames van geïmmobiliseerde vis voornamelijk geïmplementeerd om verschillende aspecten van de neurale basis van gedrag1,2teonderzoeken. Hoewel deze techniek geschikt is voor sommige sensorische systemen, is onderzoek naar het volledige spectrum van de neurale basis van gedrag moeilijk, zo niet onmogelijk in geïmmobiliseerde dieren. De eerste vooruitgang betrof het opnemen van de Mauthner-cellen van de tethered-zwemvis3,4. Echter, Mauthner cellen zijn onevenredig groot en de opgenomen actie potentiële amplituden, die kan gaan zo hoog als een paar mV, vergemakkelijken opname. Later, Canfield et al. beschreef een proof of concept bij het gebruik van een tethered dier om op te nemen van de telencephalon van vis5. Een andere recente techniek voor het opnemen van neurale activiteit van vis is calcium beeldvorming (Zie beoordelingen door Orger en de Polavieja6, en Vanwalleghem et al.7). Deze techniek is ontwikkeld voor gebruik met zebravis larven omdat de huid en de schedel transparant zijn tijdens de larvale fase. Deze techniek kan echter niet worden gebruikt om complexe gedragingen in latere ontwikkelingsstadia te bestuderen.
Hier presenteren we een nieuwe techniek voor het opnemen van extracellulaire neurale activiteit uit de hersenen van vrij zwemmen van vissen. Dit is een gewijzigde versie van het protocol zoals beschreven in Vinepinsky et al.8. De belangrijkste innovatie is de toevoeging van een Microdrive die het mogelijk maakt om de positie van de elektroden na de operatie te controleren. De techniek is ontworpen voor opname van de telencephalon van goudvis met behulp van een set van tetrodes die zijn aangesloten op een neurale datalogger via een Microdrive. De hele Setup is draadloos en verankerd aan de schedel van de vis. Het specifieke gewicht van het systeem wordt gelijkgesteld met het waterspecifieke gewicht door een kleine vlotter toe te voegen waarmee de vis vrij kan zwemmen.
De techniek is gebaseerd op het gebruik van een neurale datalogger die het signaal versterkt, digitaliseert en opslaat in een ingebouwd geheugenapparaat. De logger telemetrie systeem wordt gebruikt om te starten en stoppen van de opnames, en voor de synchronisatie met de videocamera. In dit protocol wordt een 16-kanaals neurale logger gebruikt, ingebed in een waterdichte doos samen met de Microdrive.
De Microdrive-assemblage is vervaardigd uit twee hoofdcomponenten: de Microdrive zelf en de Microdrive-behuizing (Figuur 1A, B). De behuizing houdt de Microdrive en de tetrodes, en fungeert ook als het anker tussen de schedel en de logger box (Figuur 1C). De PVC logger doos is vervaardigd met behulp van een machine proces en wordt verzegeld met behulp van een O-ring (Figuur 1E-G, zie ook aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2, en aanvullende figuur 3 voor een driedimensionaal [3D] diagram). Aan de ene kant is een stukje piepschuim bevestigd aan de logger box om het gewicht van het implantaat te compenseren en de vis te voorzien van een drijf-neutraal implantaat. De constructie van de in het protocol beschreven Microdrive volgt de door Vandecasteele et al.9 gepresenteerde procedure met een wijziging om de micro schijf aan de behuizing te bevestigen (Figuur 1a). Alle belangrijke stappen worden gepresenteerd.
De procedure beschreven in het Protocol ter voorbereiding van de schedel van de vis is vergelijkbaar met die in Vinepinsky et al.8 en wordt kort beschreven in het protocol. Een dag na de operatie, de vis zijn normaal volledig hersteld van de effecten van anesthesie en zijn klaar voor de gedrags experimenten. Merk op dat de Tetrode-locatie kan worden aangepast door de Microdrive-schroef te draaien. De schroef heeft een tussenruimte van 300 μm per volledige rotatie en een vooruitgang van 75 μm wordt aanbevolen totdat de doellocatie van de hersenen is bereikt. Een geschikte hersen Atlas moet worden geraadpleegd om het specifieke hersengebied te targeten dat van belang is. Het is raadzaam om de elektrode impedantie te testen elke keer dat de vis wordt verdotiseerd voor vervanging van de batterij of geheugenkaart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle chirurgische procedures moeten worden goedgekeurd door de plaatselijke ethische comités voor dierenwelzijn (bijv. IACUC).
1. constructie van de Microdrive-behuizing
- Om de behuizing te construeren, snijd een 1 mm brede koperen plaat in een 19 mm x 29 mm x 1 mm plaat met behulp van een zaag. Knip twee 5,5 mm spleten op elk van de lange zijden loodrecht op de rand, zodat elke spleet is 6,5 mm afstand van de smalle zijden (Figuur 2A).
- Met behulp van een tang, vouw het gebied tussen de spleten aan de lange zijden naar binnen, vouw dan het onderste deel naar binnen en de bovenzijde naar buiten om de behuizing te verkrijgen (Figuur 2B, C).
- Maak met een boor van 3 mm gaten voor schroeven in de Microdrive-behuizing.
Opmerking: Deze gaten zullen later worden gebruikt om de behuizing te bevestigen aan de logger box (Figuur 2D). - Soldeer de zijkanten van de behuizing.
- Met behulp van een fijn cirkelvormig bestand, genereert een kleine, 1,5 mm in RADIUS, halfronde spleet aan de onderkant van de behuizing (Figuur 2E).
Opmerking: Dit zal later worden gebruikt om de roestvrijstalen buis in te voegen om de elektroden te begeleiden. - Gebruik een boor van 1 mm om een gat in de achterkant van de behuizing te maken voor de tetrodes (Figuur 2F).
Opmerking: Een 3D-model van de behuizing is te vinden in de aanvullende behuizing. STL bestand.
2. bouw van de Microdrive
- Met behulp van een frees, breek een driedelige stuk uit een enkele rij mannelijke pin header strip (Figuur 1H). Met behulp van een tang, trek de middelste pin.
- Knip met behulp van een frees de resterende pennen tot 10 mm in lengte (2 mm minder dan de schroeflengte). Een andere mogelijkheid is om een langere schroef te gebruiken (zie stap 2,4).
- Boor een gat met een #65 boor door het middelste pengat. Boor een draad met een kraan van 00 − 99.
- Monteer de Microdrive en de messing platen (7,5 mm x 2,5 mm x 0,6 mm, Zie aanvullende figuur 4) zodat de koperen platen de pinnen raken. Steek een schroef (#00-90 ronde kop, 12 mm, messing) door de eerste koperen plaat, vervolgens door de schroefkop draad en de tweede koperen plaat. Plaats ten slotte een moer op de schroef en draai de gemonteerde Microdrive voorzichtig aan.
- Soldeer de pennen samen met de koperen platen en de moer met de punt van de schroef.
- Soldeer de Microdrive in de Microdrive behuizing op vier punten aan de zijkanten van de Microdrive koperen platen.
- Snijd een roestvrijstalen buis van 6 mm lang met een binnendiameter van 1,5 mm en een andere roestvrijstalen buis van 3 mm lang met een inwendige diameter van 1,2 mm. Poets de uiteinden van de buizen om scherpe uiteinden te voorkomen.
- Lijm de 6 mm lange buis aan de kleine halfronde gleuf aan de onderkant van de Microdrive behuizing met behulp van epoxy. Lijm het 3 mm lange roestvrijstaal aan de pinheader, bekleed met de 6 mm lange buis op de behuizing.
- Snijd twee 5 cm lange siliconenbuis segmenten met een diameter van 0,64 mm en een 5 cm lange polyimide buis met een diameter van 0,250 mm.
- Steek de drie buizen in de twee roestvrijstalen buizen. Lijm de buizen aan de roestvrijstalen buis bevestigd aan de pinheader met behulp van Cyanoacrylaat lijm. Schroef de Microdrive helemaal omhoog en knip de overtollige slang van de boven-en onderkant van de twee stalen buizen.
Opmerking: De Microdrive met de behuizing is nu klaar voor gebruik (Figuur 1C).
3. de Tetrode array voorbereiden
- Voor het fabriceren van een twee-Tetrode implantaat met vier elektroden op elke Tetrode, bereid acht draden, elke 12 cm lang, Formvar geïsoleerd, uit 25 μm diameter wolfraam draad.
Opmerking: Hetzelfde ontwerp is geschikt voor vier tetrodes. - Plaats een houder voor een 16-kanaals elektrode-interfacekaart (EIB-16) PCB (Zie tabel met materialen) onder de Microscoop.
- Gebruik een zacht getipt pincet en een lichtere, verwijder de coating van elk van de acht draden aan de ene kant met behulp van de vlam.
Opmerking: Dit is om ervoor te zorgen dat de draad later correct op de PCB-connector wordt aangesloten. - Duw een draad in een van de gaten in de EIB-16 met de gecoate kant in het gat. Plaats een speld en druk erop met behulp van een tang. Controleer de connectiviteit door de weerstand tussen de PIN en de ongecoate zijde van de draad te meten.
Opmerking: De weerstand is op de orde van tientallen Ohm. - Herhaal stap 3,4 met alle acht draden.
- Tape twee groepen van vier draden samen met behulp van duct tape aan het einde van elke draad.
Opmerking: Elke groep zal later aan elkaar worden gelijmd om een Tetrode te vormen. - Snijd een stukje wolfraam draad 12 cm lang met een diameter van 50 μm. Sluit deze aan op een van de EIB-16-aansluitingen.
Opmerking: Deze draad zal dienen als de referentie-elektrode. - Snijd twee kale zilveren draden van 12 cm lang met een diameter van 75 μm die als grond voor de opname logger zal dienen. Soldeer de twee draden op de massaverbinding in de EIB-16.
- Houd de EIB-16 boven een gemotoriseerd draai apparaat en plaats het kanaal uiteinde van een groep van vier draden op de gemotoriseerde afstem inrichting. Breng 130 rondes met de klok mee, gevolgd door 20 linksom draaiingen. Breng Cyanoacrylaat lijm aan om de Tetrode te bedekken.
- Wacht tot de lijm te genezen. Snijd de Tetrode dicht bij de duct tape.
- Herhaal de stappen 3,9 en 3,10 met de tweede Tetrode.
Opmerking: Dit produceert de afgewerkte twee-Tetrode array (afbeelding 1D).
4. het implantaat monteren
- Schroef de Microdrive helemaal naar beneden.
- Met behulp van 1 x 3M Phillips ronde kop schroeven, bevestig de EIB-16 aan de PVC-plaat.
- Met behulp van soft-end pincet, Trek alle tetrodes en draden door het gat in de voorkant van de logger box cover.
- Met behulp van de 2 x 6M Phillips platte kop schroeven, bevestig de PVC-plaat aan de logger box cover. Houd de EIB-16-connector in de juiste richting zodat de logger op de EIB-16 kan worden gemonteerd. Zorg ervoor dat de EIB-16 is vastgezet om bewegings artefacten in het opgenomen signaal te voorkomen.
- Sluit de draden aan op de doos met behulp van epoxy. Breng zo weinig mogelijk aan omdat de primaire afdichting later wordt uitgevoerd door kamertemperatuur (RTV).
- Bevestig de Microdrive behuizing met 2 mm schroeven aan de logger box cover.
- Rijg de tetrodes en alle draden door het gat aan de achterkant van de Microdrive behuizing. Rijg de tetrodes door de twee siliconen buisjes in de Microdrive. Rijg de 50 μm wolfraam draad door de polyimide buis in de Microdrive.
- Lijm de tetrodes en draden aan hun buizen door het aanbrengen van Cyanoacrylaat lijm aan de bovenkant van de buizen, om ervoor te zorgen dat de beweging consistent is met de Microdrive. Schroef de Microdrive helemaal naar boven.
- Breng zachte Petroleum aan (Zie tabel met materialen) op de blootgestelde Tetrode en draden in de Microdrive behuizing om beweging te voorkomen.
- Snijd een 12 mm x 14,5 mm Petri schaal bodem venster met een verwarmd scheermesje. Bevestig het venster aan de voorkant van de Microdrive behuizing met epoxy. Houd de grond draden buiten het raam.
- Breng RTV coating aan op de blootgestelde tetrodes en draden tussen de logger box cover en de Microdrive behuizing.
- Nadat de RTV is genezen, sluit de doos met een klein gewicht binnen en dompel in water 's nachts om ervoor te zorgen dat er geen Waterlekkage in de doos.
- Snijd de tetrodes en referentie draad naar de gewenste lengte met behulp van een scherpe schaar.
- Bevestig het gemarkeerde geëxtrudeerde piepschuim (Zie tabel met materialen) aan de doos. Pas de grootte ervan aan, zodat het drijfvermogen evenwichtig wordt ondergedompeld in een waterbad.
- Dompel de Tetrode tips in platina zwarte oplossing en gebruik een directe stroom (-0,2 μA) om de elektroden te Coat en de impedantie van de elektroden naar wens in te stellen. Gebruik een multi-elektrode impedantie tester (Zie tabel met materialen) voor coating-en impedantie metingen.
Opmerking: In de goudvis pallium is een waarde van 40 kOhm het beste. Afhankelijk van de toepassing kan de elektrode impedantie worden aangepast door de platina zwarte coating10,11aan te passen.
5. anesthesie voorbereiding — 1% MS-222 Stock Solution
Let op: Anesthesie voorbereiding omvat het gebruik van poedervorm MS-222, een kankerverwekkend. Vandaar dat de stappen 5,2 en 5,3 moeten worden uitgevoerd in een chemische afzuigkap met behulp van handschoenen.
- Voeg 100 mL water toe aan een buis die meer dan 100 mL kan bevatten.
- In een chemische kap, plaats een wegwerp weegplaat op een schaal. Voeg 1 g MS-222 poeder toe met behulp van een spatel en voeg het poeder vervolgens toe aan de buis.
- Schud de buis goed.
Opmerking: In vloeibare vorm kan MS-222 worden gebruikt buiten de chemische motorkap die handschoenen draagt, maar er is geen masker voor nodig. - Plaats een wegwerp weegplaat op een weegschaal. Voeg 2 g natriumbicarbonaat toe met behulp van een spatel en voeg het poeder vervolgens toe aan de buis. Schud de buis goed.
6. de vis schedel voorbereiden
Opmerking: In dit stadium is de vis klaar voor implantatie chirurgie. Zorg er vóór de operatie voor dat alle componenten en benodigdheden door de juiste procedures zijn gesteriliseerd. Voor deze stap is een uit water U-vormige vishouder nodig. In dit protocol wordt een aluminium houder gebruikt die een 15 cm kop op staart lange goudvis past. Dit systeem houdt de vissen uit het water terwijl de kieuwen met zuurstof water worden geperfectioneerd. Zie voor meer informatie Vinepinsky et al.8.
- Plaats de vis in een 0,02% MS-222 waterbad gedurende 20 minuten totdat de vis in slaap is.
- Gebruik steriele handschoenen om de vissen uit het water te halen en in de houder te plaatsen.
Opmerking: Het zuurgegeneerde water dat de vis gebruikt, bevat MS-222 met een concentratie van 0,02%, zodat de vis tijdens de operatie verdooniseerd blijft. - Gebruik een steriele spatel, breng lidocaïne 5% pasta op de huid boven de aangewezen plaats voor chirurgie voor 10 min, verwijder dan de lidocaïne.
Opmerking: Raadpleeg een geschikte hersen Atlas om de specifieke hersenregio te targeten. - Met behulp van een steriele 15 Blade scalpel, verwijder de huid boven de schedel in de regio van het implantaat.
- Met behulp van een tandheelkundige boor met 0,7 mm boor boren, boor 4 gaten in de schedel. Steek een 1 mm schroef (3 mm lang) in elk gat en breng Cyanoacrylaat lijm aan op de gaten vlak voor het inbrengen van de schroef.
- Gebruik een tandheelkundige burnisher om tand cement toe te passen op de schroeven en aan de periferie van de blootgestelde schedel.
- Maak met behulp van de tandheelkundige boor een gat van 5 mm diameter in de schedel boven het hersengebied van belang. Verwijder het vetweefsel tussen de schedel en de hersenen en stel het doel van de hersenregio bloot met fijne pincet en zacht tissuepapier. Zorg ervoor dat u de grote bloedvaten onder de schedel niet beschadigt.
Opmerking: Tegen het einde van dit stadium is de vis bereid om de sonde te implanteren. Alleen de belangrijkste stappen die specifiek zijn voor dit protocol worden hier beschreven. Verschillende postoperatieve procedures (zoals gedetailleerde documentatie over de gezondheid van het dier en sterilisatie van de chirurgische hulpmiddelen en het gebied) worden niet gepresenteerd of besproken omdat ze van toepassing zijn op alle operaties met vis of kleine dieren.
7. implanteren van de sonde
Opmerking: Om de laatste stap in het protocol te voltooien, een manipulator die het implantaat op zijn plaats kan houden terwijl het in de hersenen wordt ingebracht, is nodig.
- Gebruik de manipulator om het deksel van de logger Box vast te houden met de tetrodes naar beneden gericht naar de hersenen van de vissen.
- Buig de referentie-elektrode zodanig dat wanneer de tetrodes in de hersenen worden verlaagd, de referentie buiten de hersenen blijft.
- Snijd de gronden zodanig dat ze in de schedel passen. Sluit eventueel één massadraad aan op een van de schedel schroeven.
- Verlaag het implantaat zodanig dat de elektroden in de hersenen worden ingebracht, terwijl het onderste deel van de Microdrive-behuizing zich in de buurt van de schedel bevindt.
- Begin met het bevestigen van het implantaat aan de schedel door een kleine hoeveelheid tand cement tussen de behuizing en de dichtstbijzijnde schedel schroef toe te passen.
- Nadat het eerste deel van het tand cement is genezen, breng dan tand cement aan en sluit het gat boven de schedel en de gehele blootgestelde schedel.
Opmerking: Meestal zijn verschillende rondes van tandheelkundige toepassingen nodig om de gehele blootgestelde schedel te bedekken. - Installeer de logger en de batterij in de doos en verzegel de doos met alle schroeven.
- Breng antibiotica en lokale pijnstillers aan volgens het type vis dat voor de experimenten wordt gebruikt.
- Spoel de kieuwen van de vis met zoet water totdat de vis begint te ontwaken. Verwijder de vis uit de houder en plaats deze terug in de thuis tank.
Opmerking: De vis is volledig hersteld binnen 60 min na de operatie. - Zorg ervoor dat de vis vrij kan zwemmen met het implantaat (Figuur 3, aanvullende video 1). Indien nodig, pas de grootte van de geëxtrudeerde piepschuim boven de logger doos zodat de vis gemakkelijk kan balanceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens een opnamesessie zwom de goudvis vrij in een vierkante watertank terwijl de neurale activiteit in zijn telencephalon werd opgenomen. Het doel van deze experimenten was om te bestuderen hoe de neurale activiteit van afzonderlijke cellen het gedrag van de vis bepaalt. Om dit te doen, stekelige activiteit moest worden geïdentificeerd in de opgenomen gegevens. De hersenactiviteit, tijdens de opname, werd gedigitaliseerd op 31.250 Hz en High-Pass gefilterd op 300 Hz door de datalogger. Vervolgens, offline, een band-pass filter (300 − 5000 Hz) werd toegepast op de signalen, en de elektronisch RAW gegevens werden gescheiden in elke Tetrode kanalen en het referentie kanaal (Figuur 4a). Vervolgens werden gemeenschappelijke Spike-sorteer algoritmen12 gebruikt om de activiteit van één cel te karakteriseren. Eerst werd elk kanaal handmatig gefilterd op de minimale piek amplitude drempel (ten opzichte van het geluidsniveau van elk kanaal). Vervolgens, omdat de tips van de tetrodes zich niet in dezelfde site bevinden en de referentie-elektrode buiten de hersenen lag, werden pieken die in meer dan één Tetrode of in het referentie kanaal verschenen, ook gefilterd. De gefilterde gegevens werden vervolgens handmatig geclusterd en gefilterd op vorm, lengte, Inter-Spike interval (de tijd tussen de daaropvolgende actie potentialen moet zich houden aan de refractaire periode van neuronen), en door de principal component Analysis (PCA). Voorbeelden van clusters met één cel versus meerdere eenheden en ruis groepen worden weergegeven in afbeelding 4.
Figuur 1: implantaat assemblage. (A) Microdrive, gemaakt van een pinheader, koperen platen en een schroef. B) Microdrive behuizing, gemaakt van een enkele koperen plaat door vouwen. C) Microdrive-assemblage met de Microdrive (a) en de behuizing (B). D) de Tetrode-array is gemaakt met behulp van de EIB-16, twee tetrodes, een referentie-elektrode en de gronden die met een connector zijn verbonden (Zie tabel met materialen). (E) en (F) de Microdrive implantaat assemblage is aangesloten op de waterdichte logger box cover. De Tetrode assemblage connector bevindt zich in de doos en de tetrodes zijn gelijmd aan de Microdrive. G) de basis van de logger Box waar de logger en de batterij zich bevinden. De O-ring rond de basis wordt gebruikt voor afdichting. (H) enkele rij mannelijke PIN headers strip. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Microdrive behuizing vouwtechniek. A) beginmet een 1 mm brede messing plaat en maak vier spleten. B) het middelste deel van de zijde naar binnen vouwen. C) Vouw het bovenste deel achteruit en het onderste deel naar binnen. (D) boor drie 3 mm gaten in de bovenkant. (E) graveer een halve cirkel van 1 mm op de bodem. (F) boor een gat van 1 mm in het midden van de bovenzijde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: opnemen van een vrij gedragen goudvis. A) de tetroden worden geïmplanteerd in de hersenen van de vissen en de assemblage is verbonden met de schedel van de vis. (B) de doos is verzegeld met de logger binnenin. (C-E) Een vis zwemmen vrij met de vergadering na de operatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve resultaten. A) registratie0,5 s lang van een vrij zwemvis 24 h na de operatie. Het signaal wordt gefilterd met behulp van een band-pass filter (300 − 10000 Hz). Er is geen hoge amplitude ruis in de referentie-elektrode, wat duidt op een gebrek aan bewegings artefacten. Er zijn geen actie potentialen in de tweede Tetrode (groene kanalen). De eerste elektrode gegevens worden weergegeven in de bruine kanalen. Blauwe en rode sterren geven pieken aan van blauwe en rode clusters, respectievelijk weergegeven in de deelvensters B en C. B) Spike vormen van twee verschillende clusters van enkelvoudige neuronen, opgenomen uit Tetrode 1. C) projectie op de eerste drie hoofdbestanddelen van de gegevens van de eerste Tetrode van alle Spike-kandidaten die de drempel overschreden hebben. Blauwe en rode clusters corresponderen met blauwe en rode Spike vormen van panel B. grijze stippen vertegenwoordigen neurale ruis of multi unit-activiteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende video 1: zwem patronen: voorbeeld van goudvis per dag voor implantatie chirurgie (links) en een dag na (rechts). Video toont soortgelijke zwem patronen, wat aangeeft dat de vis niet wordt belemmerd door een operatie. Video snelheid is x 1.8. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Aanvullend figuur 1: diagram van de hoofdkamer van de logger box. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 2: diagram van het deksel van de logger box. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 3: diagram van het deksel van de EIB-16 kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 4: diagram van de koperen plaat die wordt gebruikt voor de Microdrive. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand 1: behuizings diagram. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol Details van de stappen die betrokken zijn bij het implanteren van een Tetrode array in de telencephalon van vrij zwemmen goudvis. Deze techniek implementeert een neurale logger die versterkt en registreert de signalen verkregen van maximaal 16 kanalen samen met een Microdrive die de positie van de Tetrode in de hersenen aanpassen. De Microdrive maakt het mogelijk om de positie in de hersenen aan te passen om de opname te optimaliseren.
Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor opname uit andere hersengebieden (Zie Vinepinsky et al.8 voor opname van de optische Tectum met een vergelijkbare techniek) of een ander waterdier 15 cm lang of groter (ongeveer gelijk aan een goudvis hoofd tot staart, ~ 100 gram gewicht). Bovendien kan het protocol worden aangepast om met elke datalogger te werken, zolang deze communiceert met een frequentie die water kan binnendringen. De logger gebruikt hier communiceert met behulp van een radiofrequentie van 900 MHz en kan communiceren door middel van ongeveer 20 cm water. Een radiofrequentie van 2,4 GHz kan ook doordringen tot ~ 15 cm zoet water. Lagere frequenties en andere alternatieven kunnen nog betere resultaten geven13,14,15. Het protocol hier gepresenteerd gebruikt een twee-Tetrode array met acht opnamekanalen. Bovendien kan het protocol worden aangepast om andere meetgeometrieën te verwerken, zoals een draad array16 of silicone sondes9.
Er zijn verschillende voordelen voor het gebruik van een datalogger over een volledige telemetrieregistratie systeem of een tethered systeem. Ten eerste voegt draadloze communicatie ruis toe aan de opname. Daarom zal volledige overdracht van de gegevens de signaalkwaliteit verminderen. Bovendien, logboekregistratie van de gegevens zorgt ervoor dat er geen gegevens verloren gaan als de communicatie mislukt. Bovendien zorgen draadloze systemen ervoor dat de vis vrij kan zwemmen, in tegenstelling tot bij tethered dieren. Tot slot, dit protocol werd ontwikkeld om actie potentialen op te nemen, maar kan ook worden gebruikt om lokale veld potentialen op te nemen door het instellen van de logger analoge high-pass filter op 1 Hz in plaats van 300 Hz. Een nadeel van de logger is de noodzaak om de gegevens fysiek te downloaden en de batterij te vervangen wanneer deze naar beneden loopt.
De Microdrive voorgesteld in het protocol verhoogt aanzienlijk de kans op het opnemen van één cel activiteit. Zonder het Microdrive-apparaat worden de geïmplanteerde tetrodes ongeveer in dezelfde opname plaats in de hersenen geplaatst gedurende de hele tijd dat de vis wordt getest. Hierdoor wordt de kans op het opnemen van meerdere enkelvoudige neuronen van dezelfde vis fysiek beperkt, waardoor de opname opbrengst per vis wordt beknot. Het feit dat de specifieke opname plaats in de hersenen blijft onbekend tot na de operatie versterkt de noodzaak van een beweegbaar apparaat dat het mogelijk maakt om de elektroden in de hersenen na fixatie ook te verplaatsen.
Een belangrijk kenmerk van dit protocol dat voor de duidelijkheid is weggelaten, is de bepaling van de elektrode impedantie. De elektrode impedantie kan worden aangepast door de selectie van de draaddiameter (d.w.z. een hogere diameter leidt tot lagere impedantie), draad samenstelling (bv., wolfraam of Nichroom) en elektrode coating (bijvoorbeeld Platinum Black voor wolfraam en goud voor nichrome) die draden met lagere diameters en lagere impedantie oplevert. Omdat al deze parameters essentieel zijn voor het succes van neuronale opnames, wordt de lezer sterk aangemoedigd om de enorme literatuur over dit onderwerp te raadplegen, waaronder Harris et al.17.
Let op het belang van de referentie-elektrode bij het opsporen van mogelijke externe geluidsbronnen in het systeem. De referentie-elektrode is een relatief lage impedantie-elektrode die in de schedel wordt ingebracht, maar zich buiten de hersenen bevindt. Omdat het niet in aanraking komt met hersenweefsel, registreert het de handtekening van het signaal, die bestaat uit thermisch geluid, bewegings artefacten en externe ruis. De belangrijkste geluidsbronnen in dit systeem zijn bewegings artefact en communicatie geluiden die kunnen worden bestuurd en getimed door de logger. Deze geluiden kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd door de handtekening die ze opleggen aan het signaal van de referentie-elektrode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar Nachum Ulanovsky en de leden van het Ulanovsky Lab voor al hun hulp. Daarnaast zijn we heel blij met tal Novoplansky-Tzur voor nuttige technische assistentie. We erkennen de financiële steun van het ISRAËLISCH SCIENCE FOUNDATION-FIRST-programma (Grant nr. 281/15) en de Helmsley liefdadigheids Trust via het landbouw-, biologisch-en cognitief robotica-initiatief van de Ben-Gurion Universiteit van de Negev.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.7 mm round drill bits | Compatible with the drill. | ||
| 15 blade Scalpel | Sigma-Aldrich | ||
| 16 channel PCB board | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1x3M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 1x3M phillips round head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 27 cm x 19 cm x 1 mm brass plate | See Figure 2 | ||
| 2x6M phillips flat head screws | Stainless steel. Any type. | ||
| 3140 RTV coating | Dow Crowning | 2767996 | |
| 75 µm Silver wire | A-M Systems | ||
| Brass machine screws #00-90 | 947-1006 | ||
| Brass plates 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm | A 3D drawing is provided. See supplementary 1 | ||
| Coated Tungsten wire 25µm | California Fine Wire Company | 5000160 | Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000) |
| Coated Tungsten wire 50 µm | A-M Systems | 795500 | Can be replaced with any other wire with low impedance |
| Cyanoacrilic glue | |||
| Dental Burnisher | ComDent UK | Any small sterille stainless-still tool will do. | |
| Dental cement - GCFujiPLUS | GC | 431011 | Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other. |
| Dental drill or nail polish drill | Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement. | ||
| Drill bit #65 | 947-65 | ||
| Fast curing epoxy | Any 5 min curing epoxy can be used here. | ||
| Logger box with O-ring sealing | A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger. | ||
| Motorized turning device | Custom made as described in "open ephys" website. Can also be purchusaed from neurolynx ("Tetrode Spinner 2.0") or bulit by other means. | ||
| Mouselog-16 Neural logger | Deuteron Technologies Ltd | There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98% |
| Nano-Z plating | White Matter LLC | The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics. | |
| PCB pins | Neurlynx | Neuralynx EIB Pins | |
| Polymide tubing 250 µm | A-M Systems | 822000 | |
| Rechargable battery | 3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time. | ||
| Silicone tubing 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| Stainless steel 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| Sudium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Tap #00-90 | 947-1301 | ||
| Vaseline | Any type of soft petroleum skin protectant can be used here. |
References
- Jacobson, M., Gaze, R. M. Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).
- Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish. Nature Communications. 6, 6476 (2015).
- Zottoli, S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).
- Canfield, J. G., Rose, G. J. Activation of Mauthner neurons during prey capture. Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).
- Canfield, J. G., Mizumori, S. J. Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish. Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).
- Orger, M. B., de Polavieja, G. G. Zebrafish behavior: opportunities and challenges. Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).
- Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K.
- Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish. Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568 (2012).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black. Frontiers in Neuroengineering. 3, 5 (2010).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz. Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks & Systems. , Arlington, VA. (2015).
- Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz. IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).
- Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band. Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).
- Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).
- Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. Improving data quality in neuronal population recordings. Nature Neuroscience. 19 (9), 1165 (2016).
