Summary

المضادات الحيوية Dereplication باستخدام منصة مقاومه المضادات الحيوية

Published: October 17, 2019
doi:

Summary

نحن وصف منصة التي تستخدم مكتبه من المضادات الحيوية القولونية المقاومة للمضادات الحيوية للحصول علي dereplication من المضادات. يمكن استنتاج هويه المضادات الحيوية التي تنتجها البكتيريا أو الفطريات من خلال نمو e. كولاي التي تعبر عن جين المقاومة الخاصة بها. وهذه المنصة فعاله اقتصاديا وذات كفاءه زمنيه.

Abstract

واحده من التحديات الرئيسية في البحث عن المضادات الحيوية الجديدة من مقتطفات المنتجات الطبيعية هو أعاده اكتشاف المركبات المشتركة. للتصدي لهذا التحدي ، يتم تنفيذ dereplication ، وهي عمليه تحديد المركبات المعروفة ، علي عينات من الفائدة. وأساليب الفصل بين الطرق ، مثل الانفصال التحليلي الذي يعقبه قياس الطيف الكتلي ، تستغرق وقتا طويلا وتستهلك الموارد بكثافة. لتحسين عمليه dereplication ، قمنا بتطوير منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP). و ARP هي مكتبه من حوالي 100 الجينات مقاومه المضادات الحيوية التي تم استنساخها بشكل فردي في القولونية. هذه المجموعة سلاله لديها العديد من التطبيقات ، بما في ذلك وسيله فعاله من حيث التكلفة وطريقه سهل لdereplication المضادات الحيوية. وتنطوي هذه العملية علي تخمير الميكروبات المنتجة للمضادات الحيوية علي سطح اطباق بتري المستطيلة التي تحتوي علي وسط صلب ، مما يسمح بإفراز ونشر نواتج الأيض الثانوية من خلال الوسط. بعد فتره التخمير 6 أيام, يتم أزاله الكتلة الحيوية الميكروبية, ويضاف أجار رقيقه تراكب إلى طبق بيتري لخلق سطح أملس وتمكين نمو سلالات المؤشر e. كولاي . ثم يتم تثبيت مجموعتنا من سلالات ARP علي سطح طبق بيتري الذي يحتوي علي المضادات الحيوية. يتم احتضان اللوحة التالية بين عشيه وضحيها للسماح للنمو e. كولاي علي سطح التراكب. فقط السلالات التي تحتوي علي مقاومه للمضادات حيوية معينه (أو فئة) تنمو علي هذا السطح مما يتيح التعرف السريع علي المجمع المنتج. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح للتعرف علي منتجي المضادات الحيوية المعروفة وكوسيلة للتعرف علي تلك التي تنتج المركبات الجديدة.

Introduction

منذ اكتشاف البنسلين في 1928 ، أثبتت المنتجات الطبيعية المستمدة من الكائنات المجهرية البيئية انها مصدر غني للمركبات المضادة للميكروبات1. وتستمد حوالي 80 ٪ من المضادات الحيوية المنتجات الطبيعية من البكتيريا من جنس العقديات وغيرها من الاكاكتيميتيز ، في حين يتم إنتاج 20 ٪ المتبقية من الأنواع الفطرية1. بعض السقالات المضادات الحيوية الأكثر شيوعا المستخدمة في العيادة مثل β-اكتام, التتراسيكلين, rifamycins, و الامينوغليكوسيدس, كانت في الأصل معزولة عن الميكروبات2. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع البكتيريا المقاومة للادويه المتعددة ، أصبحت اللوحة الحالية من المضادات الحيوية اقل فعاليه في العلاج3،4. وتشمل هذه العوامل المسببة للامراض “ESKAPE” (اي ، فانكوميسين مقاومه المكورات المعوية والمكورات العنقوديةالذهبية المقاومة للاكتام ، klebsiella الرئوية، الزائفة الزنجاريه، والانتيفه باومانيي، و المعوية sp.) ، وهي مجموعه فرعيه من البكتيريا التي تعتبر مرتبطة باعلي المخاطر من قبل عدد من السلطات الصحية العامة الرئيسية مثل منظمه الصحة العالمية3،4،5. ظهور وانتشار العالمي لهذه الممرضات المدرة للادويه يؤدي إلى حاجه مستمرة للمضادات الحيوية رواية3,4,5. ومما يؤسف له ان العقدين الماضيين اثبتا ان اكتشاف المضادات الحيوية الجديدة من المصادر الميكروبية يزداد صعوبة6. وتشمل النهج الحالية لاكتشاف المخدرات الفحص عاليه الانتاجيه للمركبات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك المنتجات الطبيعية المكتبات استخراج ، مما يسمح للاف من مقتطفات ليتم اختبارها في وقت معين2. ومع ذلك ، وبمجرد الكشف عن النشاط المضاد للميكروبات ، فان الخطوة التالية هي تحليل محتويات مستخرج الخام لتحديد المكون النشط والقضاء علي تلك التي تحتوي علي مركبات معروفه أو زائده عن الحاجة7،8. هذه العملية ، التي يشار اليها باسم dereplication ، أمر حيوي لمنع و/أو خفض كبير في الوقت المستغرق في أعاده اكتشاف المضادات الحيوية المعروفة7،9. علي الرغم من ان خطوه ضرورية في اكتشاف المخدرات المنتج الطبيعي ، dereplication المعروف شاقه وكثيفه الموارد10.

من اي وقت مضي منذ beutler et al. أولا صاغ مصطلح “dereplication” ، بذلت جهود واسعه لوضع استراتيجيات مبتكره للتعرف السريع علي المضادات الحيوية المعروفة11،12. اليوم الاداات الأكثر شيوعا المستخدمة في dereplication تشمل النظم التحليلية الكروماتوغرافي مثل اللوني السائل عاليه الأداء ، والطيف الكتلي ، والنووية الرنين المغناطيسي القائم علي طرق الكشف11،13. ومن المؤسف ان كلا من هذه الأساليب يتطلب استخدام معدات تحليليه باهظه التكاليف وتفسيرات متطورة للبيانات.

في محاولة لتطوير طريقه dereplication التي يمكن تنفيذها بسرعة دون المعدات المتخصصة ، انشانا منصة مقاومه المضادات الحيوية (ARP)10. يمكن استخدام ARP لاكتشاف المواد المضادة للمضادات الحيوية ، وتنميط مركبات المضادات الحيوية الجديدة ضد أليات المقاومة المعروفة ، و dereplication من المضادات الحيوية المعروفة في مقتطفات مشتقه من البكتيريا المخاطية والميكروبات الأخرى. هنا ، ونحن نركز علي تطبيقه في dereplication المضادات الحيوية. يستخدم ARP مكتبه من سلالات القولونية ايزوسيكيا التي تعبر عن جينات المقاومة الفردية التي تكون فعاله ضد المضادات الحيوية الأكثر شيوعا أعاده اكتشاف14,15. عندما تزرع مكتبه e. القولونية في وجود كائن ثانوي المنتجة المستقلب, يمكن استنتاج هويه المجمع عن طريق نمو السلالات e. القولونية التي تعبر عن الجينات المقاومة المرتبطة بها10. عندما تم الإبلاغ عن ARP لأول مره ، كانت المكتبة تتكون من > 40 جينات تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 16. تم تصميم قالب dereplication الأصلي لتشمل مجموعه فرعيه من جينات المقاومة لكل فئة المضادات الحيوية لتوفير المعلومات المتعلقة بالمضادات الحيوية فئة فرعيه خلال عمليه dereplication. اليوم ، يتكون ARP من > 90 الجينات التي تمنح مقاومه لفئات المضادات الحيوية 18. باستخدام لدينا مجموعه واسعه من الجينات المقاومة ، وقد تم تطوير قالب dereplication الثانوية ويعرف باسم منصة مقاومه المضادات الحيوية الحد الأدنى (MARP). تم إنشاء هذا القالب للقضاء علي التكرار الجيني وببساطه توفير المعلومات المتعلقة بفئة المضادات الحيوية العامة التي ترتبط المستقلب dereplicated. بالاضافه إلى ذلك ، فان قالب MARP تمتلك كل من النوع البري وسلاله القصور الفائقة/efflux من e. كولاي BW25113 (e. كولاي BW25113 ΔbambΔtolc)، مقارنه بالتجسيد الأصلي لل ARP ، والتي فقط يستخدم سلاله فرط نفاذيه. هذا الجانب فريدة من نوعها يخلق الأنماط الظاهرية اضافيه اثناء dereplication ، مما يدل علي قدره المركبات لعبور الغشاء الخارجي للبكتيريا سلبيه الجرام. هنا ، ونحن وصف بروتوكول قويه ليتم اتباعها عند المراوغة مع اما ARP و/أو MARP ، تسليط الضوء علي الخطوات الأكثر اهميه لاتباعها ، ومناقشه مختلف النتائج الممكنة.

Protocol

1. اعداد المكتبة القولونية الأسهم الجلسرين (من أجار slants) خط السلالات ARP/MARP e. القولونية من مرق lysogeny (LB) أجار التعرجات علي اطباق بيتري التي تحتوي علي أجار LB وعلامة اختيار المناسبة (الجدول 1). اعداد الثقافات لكل من سلالات e. القولونية عن طريق تطعيم 3 مل من LB تحتوي ?…

Representative Results

تم الحصول علي النتائج التالية عندما تم تجميع مجموعه من سلالات الفوائد المنتجة للمضادات الحيوية باستخدام ARP و/أو MARP. ويرد في الشكل 1رسم تخطيطي لسير العمل الخاص بالdereplication ARP/marp ، وتظهر خرائط لوحه المكتبة في الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2. ?…

Discussion

يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف أعلاه علي كل من اكتشاف المركبات المضادة للميكروبات الجديدة والمواد المضادة التي يمكن استخدامها بالاقتران مع الحيوية الموجودة لإنقاذ نشاطها. منصة يستفيد من خصوصية عاليه الركيزة من أليات المقاومة والمضادات الحيوية الخاصة بهم ، إلى مركبات التخلص من النفط داخ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ودعمت البحوث في مختبر رايت المتعلقة ARP/MARP من قبل صندوق البحوث في اونتاريو والمعاهد الكندية للمنح البحوث الصحية (FRN-148463). نود ان نعترف سومير تشو للمساعدة في توسيع وتنظيم مكتبه ARP.

Materials

Agar Bio Shop AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage Sigma-Aldrich Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt Bio Shop AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton Dickinson 212322
BBL Phytone Peptone (Soytone) Becton Dickinson 211906
Calcium Carbonate Bio Shop CAR303.500
Casamino acid Bio Basic 3060
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour Sarstedt 72.379.992
D-glucose Bio Shop GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm Fisher Scientific 14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous Commercial Alcohols P016EAAN
Glass Beads, Solid Fisher Scientific 11-312C
Glycerol Bio Shop GLY001.4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Instant sealing sterilization pouch Fisher Scientific 01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich F7002-250G
Kanamycin Sulfate Bio Shop KAN201.50
LB Broth Lennox Bio Shop LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size Millipore-Sigma HAWP00010 10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base Sarstedt 82.1582.001
New Brunswick Innova 44 Eppendorf M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Fisher Scientific 264728 with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams Sarstedt 82.1473.001
Pinning tools ETH Zurich Custom order
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potato starch Bulk Barn 279
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium Nitrate Fisher Scientific S343-500
Wood Applicators Dukal Corporation 9000
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2

References

  1. Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
  2. Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
  3. Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
  4. Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
  5. Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
  6. Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
  7. Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
  8. Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
  9. Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
  10. Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
  11. Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  12. Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
  13. Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
  14. Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
  15. Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).

Play Video

Cite This Article
Zubyk, H. L., Cox, G., Wright, G. D. Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform. J. Vis. Exp. (152), e60536, doi:10.3791/60536 (2019).

View Video