Summary
Vi beskriver en plattform som utnytter et bibliotek av isogenic antibiotika resistente Escherichia coli for dereplication av antibiotika. Identiteten til en antibiotika produsert av bakterier eller sopp kan utledes av veksten av E. coli uttrykke sine respektive motstand genet. Denne plattformen er økonomisk effektiv og tidseffektiv.
Abstract
En av de viktigste utfordringene i jakten på nye antibiotika fra naturlige produkt ekstrakter er re-oppdagelsen av felles forbindelser. For å møte denne utfordringen, dereplication, som er prosessen med å identifisere kjente forbindelser, er utført på prøver av interesse. Metoder for dereplication som analytisk separasjon etterfulgt av masse massespektrometri er tidkrevende og ressurskrevende. For å forbedre dereplication prosessen, har vi utviklet antibiotikaresistens plattformen (ARP). ARP er et bibliotek på ca 100 antibiotikaresistens gener som er individuelt klonet inn Escherichia coli. Denne belastningen samlingen har mange programmer, inkludert en kostnadseffektiv og facile metode for antibiotika dereplication. Prosessen innebærer gjæring av antibiotika-produserende mikrober på overflaten av rektangulære Petri retter som inneholder solid medium, og dermed gir mulighet for utskillelsen og diffusjon av sekundære metabolitter gjennom mediet. Etter en 6 dagers gjæring periode, er den mikrobielle biomasse fjernet, og en tynn agar-overlegg er lagt til Petri parabolen å skape en glatt overflate og aktivere veksten av E. coli indikator stammer. Vår samling av ARP stammer deretter festet på overflaten av antibiotika-inneholdende Petri parabolen. Platen er neste inkubert over natten for å tillate E. coli vekst på overflaten av overlegget. Bare stammer som inneholder resistens mot en bestemt antibiotika (eller klasse) vokse på denne overflaten muliggjør rask identifisering av produserte sammensatte. Denne metoden har blitt brukt for identifisering av produsenter av kjente antibiotika og som et middel til å identifisere de produserende romanen forbindelser.
Introduction
Siden oppdagelsen av penicillin i 1928, naturlige produkter avledet fra miljømessige mikroorganismer har vist seg å være en rik kilde til antimikrobielle forbindelser1. Omtrent 80% av naturlig produkt antibiotika er avledet fra bakterier av slekten Streptomyces og andre aktinomyceter, mens de resterende 20% er produsert av fungal arter1. Noen av de vanligste antibiotika stillaser som brukes i klinikken som β-lactams, tetracykliner, rifamycins og aminoglykosider, ble opprinnelig isolert fra mikrober2. Men på grunn av fremveksten av multidrug resistente (MDR) bakterier, vår nåværende panel av antibiotika har blitt mindre effektive i behandling3,4. Disse inkluderer "ESKAPE" patogener (dvs. Vancomycin enterokokker og β-Laktam-resistente Staphylococcus aureus, klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, og Enterobacter Sp.), som er et delsett av bakterier anses å være assosiert med den høyeste risikoen ved en rekke store offentlige helsemyndigheter som verdenshelseorganisasjon3,4,5. Fremveksten og global spredning av disse MDR patogener resulterer i en konstant behov for romanen antibiotika3,4,5. Dessverre har de siste to ti årene vist at oppdagelsen av romanen antibiotika fra mikrobielle kilder er stadig vanskeligere6. Dagens tilnærminger til narkotika funnet inkluderer høy gjennomstrømming screening av bioaktive forbindelser, inkludert naturlig produkt ekstrakt biblioteker, slik at for tusenvis av ekstrakter som skal testes på et gitt tidspunkt2. Men når antimikrobielle aktivitet oppdages, er neste trinn å analysere innholdet i råolje ekstrakt å identifisere den aktive komponenten og eliminere de som inneholder kjente eller overflødige forbindelser7,8. Denne prosessen, referert til som dereplication, er avgjørende for å forebygge og/eller redusere tiden brukt på re-oppdagelsen av kjente antibiotika7,9. Selv om det er et nødvendig skritt i naturprodukt oppdagelse, er dereplication notorisk arbeidskrevende og ressurskrevende10.
Helt siden Beutler et al. første innførte begrepet "dereplication", omfattende innsats har blitt gjort for å utvikle innovative strategier for rask identifisering av kjente antibiotika11,12. I dag er de vanligste verktøyene som brukes for dereplication inkluderer analytiske kromatografiske systemer som høy ytelse flytende kromatografi, masse massespektrometri, og kjernefysiske magnetiske resonans-baserte deteksjon metoder11,13. Dessverre krever hver av disse metodene bruk av dyrt analytisk utstyr og sofistikert data tolkning.
I et forsøk på å utvikle en dereplication metode som raskt kan utføres uten spesialisert utstyr, etablerte vi antibiotikaresistens plattformen (ARP)10. ARP kan brukes til oppdagelsen av antibiotika adjuvans, profilering av nye antibiotika forbindelser mot kjente motstands mekanismer, og dereplication av kjente antibiotika i ekstrakter avledet fra actinobacteria og andre mikrober. Her fokuserer vi på anvendelsen i antibiotika dereplication. ARP utnytter et bibliotek med isogenic Escherichia coli stammer uttrykke individuelle motstand gener som er effektive mot de vanligste re-oppdaget antibiotika14,15. Når E. coli biblioteket dyrkes i nærvær av en sekundær metabolitten-produserende organisme, identiteten til det sammensatte kan utledes av veksten av E. coli stammer som uttrykker sin tilknyttede motstanden genet10. Når ARP ble først rapportert, biblioteket besto av > 40 gener overdragelse motstand mot 16 antibiotika klasser. Den opprinnelige dereplication malen ble utformet for å omfatte en undergruppe av motstands gener per antibiotika klasse for å gi informasjon om antibiotika underklasse under dereplication prosessen. I dag er ARP består av > 90 gener som tildeler motstand til 18 antibiotika klasser. Ved hjelp av vår omfattende samling av resistens gener, en sekundær dereplication mal har blitt utviklet og er kjent som minimal antibiotikaresistens plattform (MARP). Denne malen ble opprettet for å eliminere gen redundans og å bare gi informasjon om den generelle antibiotika klassen at en dereplicated metabolitten er relatert til. I tillegg MARP malen besitter både wildtype og en hyperpermeable/utstrømming mangelfull stamme av E. coli BW25113 (E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC), sammenlignet med den opprinnelige inkarnasjonen av ARP, som bare utnytter hyperpermeable belastningen. Dette unike aspektet skaper ekstra fenotyper under dereplication, indikerer en forbindelser evne til å krysse den ytre membran av gram-negative bakterier. Her beskriver vi en robust protokoll som skal følges ved dereplicating med enten ARP og/eller MARP, fremhever de mest kritiske trinnene som skal følges, og diskuterer de ulike mulige utfall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av E. coli bibliotek glyserol Stocks (fra agar slants)
- Stripe ARP/MARP E. coli stammer fra lysogeny BULJONG (LB) agar slants på Petri retter som inneholder lb agar og riktig valgbar markør (tabell 1).
- Forbered kulturer for hver av E. coli stammer av vaksinere 3 ml lb inneholder riktig valgbar markør med en enkelt koloni. Vokser over natten ved 37 ° c med lufting (250 RPM).
- Kombiner 800 μL av kultur og 200 μL av steril 80% glyserol i en 1,8 mL cryovial. Bland ved å invertere rørene 3 − 4 ganger, og oppbevar ved-80 ° c.
2. ARP/MARP frossen lager bibliotek plate forberedelse
- Strek ARP/MARP stammer fra glyserol aksjer utarbeidet i del 1 på et nytt sett med Petri retter som inneholder LB agar og riktig valgbar markør. Grow overnatter ved 37 ° c.
- Ved hjelp av aseptisk teknikk, Pipetter 500 μL av justert Mueller Hinton buljong (MHB) fra et sterilt reservoar i hver brønn av en steril 96 dyp brønn plate.
- Med platene forberedt i trinn 2,1, bruk en applikator Stick til å vaksinere den 96 dyp brønn plate i samsvar med ARP/MARP kart (supplerende figur 1 og supplerende figur 2). Kontroller at riktig valgbar markør er lagt til hver brønn. Plasser en pustende tetnings membran over overflaten av den dype brønn platen og ruge over natten ved 37 ° c (250 RPM).
- Kontroller at det ikke er noen forurensede brønner ved å henvise til ARP/MARP-kartet. Gjenta hvis forurenset. Ved hjelp av en flerkanals pipettehjelper kan du overføre 100 μL fra hver brønn på den dype brønn platen til en steril 96-vel rund bunnplate. Gjenta dette trinnet for å opprette flere frosne lager bibliotek plater.
Merk: Det er best å forberede minst 5 bibliotek plater om gangen for å holde fra gjentatte trinn 2.1 − 2.4 i tilfelle frossen lager bibliotek plate forurensning. - Finish gjør ARP/MARP frosne lager bibliotek platene ved pipettering 100 μL av sterile 50% glyserol i hver brønn og bland ved forsiktig pipettering opp og ned.
- Dekkplatene med sterile aluminiums pakninger og sikre at hver brønn er individuelt forseglet.
- Number platene og dedikere bare en frossen lager bibliotek plate for vaksinere nye maler på et gitt tidspunkt. Oppbevar resten som back-ups i tilfelle frossen lager bibliotek plate forurensning.
- Plasser plate lokket oppå aluminiums forseglingen og oppbevar ved-80 ° c.
3. Seed kultur og Dereplication plate forberedelse
- Ved hjelp av en applikator pinne, vaksinere 3 mL Streptomyces antibiotika medium (Sam) (eller andre passende medium for organismen testes) i et reagensrør som inneholder en steril glass perle (å bryte opp mycel) med den produserende stamme som skal dereplicated. For Streptomyces, forsiktig skrape sporer fra overflaten av en koloni.
- Ved hjelp av samme tre applikator Stick, stripe en sterilitet kontroll på en Petri parabolen inneholder Bennett ' s agar.
- Ruge frø kulturen ved 30 ° c med lufting i 6 dager (250 RPM) og ruge av sterilitet på 30 ° c i 6 dager.
Merk: Se tabell 2 for Sam og Bennett ' s Media oppskrifter. Instruksjonene ovenfor er egnet for de fleste aktinomyceter. Alter vekst medier som nødvendig for andre bakterier og sopp. - Forbered dereplication plater med aspirating 23 mL varm Bennett ' s agar inn i en serologisk pipette og dispensere 20 mL jevnt over overflaten av en rektangulær Petri parabolen (tabell over materialer), slik at resten av mediet i pipette for å hindre luftboble formasjon.
Merk: Sørg for at overflaten som brukes til å helle plater er nivå og utføre dette trinnet før agar har avkjølt for mye; en flat overflate er viktig for låsing av biblioteket i de neste fasene. - Roter forsiktig platen til mediet dekker alle deler av platen og ikke forstyrr den til agar har satt helt.
- Forbered nitrocellulose membran ark (tabell av materialer) ved hjelp av en rektangulær Petri oppvask deksel som tracing mal slik at arkene passer overflaten av dereplication plate. Skjær arkene og autoklav dem i en steril veske.
Merk: Denne membranen gjør det mulig for organismer å sporulate på overflaten, mens sekundære metabolitter kan skilles ut i mediet nedenfor. Når vokst, er membranen fjernet for å gi en ren overflate for dereplication. Den tettere passform at membranen papiret har på overflaten av Bennett ' s agar, renere det dereplication resultatet. - Sjekk sterilitet kontroll platen for å sikre at ingen forurensninger er til stede etter 6 dager med inkubasjons. Hvis forurensning-fri, fjerne lokket på den rektangulære Petri parabolen og pipette 200 μL av frø kultur på overflaten av Bennett ' s agar.
- Jevnt spre kulturen over overflaten av hele platen ved hjelp av en steril bomullsdott.
- Plasser nitrocellulose membran utarbeidet i trinn 3,6 over toppen av kulturen på overflaten av Petri parabolen. Begynn med å samkjøre den nederste kanten av membranen til den nederste kanten av Petri parabolen, og sakte bruke membranen fra den nederste kanten til den øverste kanten av platen.
- Bruk en steril bomullspinne for å glatte ut eventuelle luftbobler som kan ha dannet mellom membranen-agar grensesnitt, slik at membranen er flush til agar.
- Sett lokket tilbake på den rektangulære Petri parabolen og legg den opp ned i en forseglet plastpose. Ruge ved 30 ° c i 6 dager.
4. Dereplication tallerken MHB overlegg og ARP/MARP bibliotek plate forberedelse
- Etter 6 dager, Fjern dereplication plate fra 30 ° c inkubator. Ved hjelp av steril pinsett (autoklaveres eller sprayet grundig med 70% etanol), forsiktig fjerne nitrocellulose membranen fra overflaten av Bennett ' s agar.
Merk: Dette trinnet vil fjerne hydrofobe sporer og mycelier vokst på overflaten av membranen for å gi en ren overflate for dereplication, tilrettelegging trinn 4,2. - Som beskrevet i trinn 3,4, må du sørge for at arbeidsflaten er jevn og bruke en serologisk pipette for å aspirer 23 mL varme justert MHB agar. Lag et overlegg ved å fordele 20 mL jevnt over overflaten på den dereplication platen, og la resten av mediet være i pipette for å forhindre luftboble dannelse.
- Roter forsiktig platen til mediet dekker alle områder og ikke forstyrr det før agar har satt helt. Når avkjølt og befestet, returner dereplication platen til den forseglede plastposen og oppbevar den opp ved 4 ° c over natten.
Merk: Dette trinnet gir mulighet for diffusjon av sekundære metabolitter fra gjæret Bennett ' s medium inn i MHB agar overlegg. Hvis nitrocellulose membranen ikke var forberedt på riktig måte vil det være spore vekst rundt kantene av platen, som har hydrofobe egenskaper som avviser MHB agar. Ikke hell overlegget oppå disse sporene fordi det kan føre til forurensning av overlegget. - På samme dag som overlappingen helles, vaksinere en ny ARP/MARP-mal ved pipettering 100 μL justert MHB i hver brønn på en 96-brønn plate.
Merk: For å redusere risikoen for kontaminering ved dereplication, bruk en enkelt ARP/MARP-biblioteks plate til å bare dereplicate 2 − 3 dereplication plater. Derfor vaksinere nok 96-vel ARP/MARP plater basert på antall stammer som vil bli dereplicated. - Ta den frosne lager ARP/MARP biblioteket plate ut av-80 ° c fryser. Fjern aluminiums forseglingen før kondens begynner å dannes på undersiden, og dermed redusere sjansen for forurensende nærliggende brønner i biblioteket plate.
- Ved hjelp av sterile 96-brønn låsing verktøy (eller andre former for inoculation utstyr), forsiktig PIN fra den frosne lager ARP/MARP bibliotek plate og vaksinere den friske MHB-inneholdende 96-brønn plater. For å minimere forurensning under dereplication, må du forberede så mange ARP-eller MARP-biblioteks plater som trengs for å bare dereplicate 2 − 3 dereplication plater per biblioteks plate. Sterilisere festeverktøy mellom vaksinere hver plate.
- Sett en ny steril aluminiumsforsegling på den frosne malen en gang fullført og returner den til-80 ° c fryser. Plasser inokulert 96-platene inne i en forseglet plastpose og ruge ved 37 ° c med lufting (250 RPM) i 18 timer.
Merk: Ny frossen lager bibliotek plater kan tilberedes fra dette trinnet etter at ingen forurensning er tilstede. Legg glyserol til platen før lagring ved-80 ° c som beskrevet i trinn 2,5.
5. Dereplicating ved hjelp av ARP/MARP
- Fjern ARP/MARP-malen fra inkubator og sikre at ingen forurensninger er til stede. Alltid dereplicate ved hjelp av en mal som er ferskt tilberedt og ikke direkte fra den frosne lager.
- Fjern dereplication platene fra 4 ° c og la det likevekt til romtemperatur. Hvis det er kondens, åpne lokkene og la det tørke i et sterilt miljø.
- Ved hjelp av sterile låsing verktøy (eller annet inoculation utstyr), PIN fra ARP/MARP bibliotek plate på overflaten av MHB agar overlegg av dereplication platene. Vær forsiktig så du ikke Pierce den agar. Sterilisere festeverktøy mellom vaksinere hver dereplication plate.
- Etter at du har plassert malen på overflaten av dereplication platene, må du la malen inokulum tørke i 3 − 5 min. Plasser inokulert dereplication platene opp-ned i en forseglet plastpose og ruge over natten ved 37 ° c.
- Analyser dereplication resultater neste dag ved å sammenligne vekst på dereplication platen med brønner som samsvarer med ARP/MARP-kartet (tabell 3 og Tabell 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende resultater ble oppnådd når en samling av antibiotika-produserende stammer av interesse ble dereplicated ved hjelp av ARP og/eller MARP.
Et diagram av ARP/MARP dereplication arbeidsflyt er avbildet i figur 1, og bibliotek plate kart er vist i supplerende figur 1 og supplerende figur 2. Figur 2 demonstrerer en positiv dereplication resultat der miljø ekstrakt WAC 8921 er identifisert som en kloramfenikol produsent. Figur 3 viser en mangel på ARP-vekst helt, noe som indikerer tilstedeværelsen av enten en ukjent antibiotika eller en mindre vanlig antibiotika som ikke er rede for i ARP/MARP bibliotek plate. Figur 4 demonstrerer en vekstmønster som er unik for MARP grunn av sin utnyttelse av både wildtype E. coli BW25113 og en hyperpermeable og utstrømming mangelfull mutant E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC. Dette resultatet antyder tilstedeværelsen av en sammensatt med antimikrobielle aktivitet som ikke er i stand til å overgå en intakt ytre membran. Figur 5 viser en E. coli vekstmønster som antyder feil sterilisering av låsing verktøy og figur 6 viser et eksempel på ARP/MARP frosset lager bibliotek plate forurensning. Figur 7 demonstrerer hva som skjer hvis agar overlegg er gjennomboret under dereplication. Endelig, Figur 8 viser MHB overlegg relatert forurensning som kan oppstå under dereplication prosessen.
Figur 1: en skjematisk fremstilling av dereplication prosessen. Den produserende belastningen som skal dereplicated er stripete på en rektangulær Petri parabolen som en plen og en nitrocellulose membran er plassert på toppen. Platen er da inkubert for 6 dager der den produserende-stamme relatert biomasse vokser på overflaten av membranen mens og sekundære metabolitter produseres utskilles i Petri parabolen Media. Etter en 6-dagers gjæring periode, er membranen fjernet og en MHB overlegg er lagt til overflaten av antibiotika-inneholdende medier for å gi en glatt overflate for låsing. ARP/MARP E. coli -biblioteket, som er ordnet i en 96-brønn plateformat i henhold til ARP/MARP-kart, festes deretter på overflaten av overlegget. Etter å ha incubating skuffen over natten ved 37 ° c, vil veksten av E. coli- stammer som uttrykker spesifikk motstands gener indikere identiteten til den sammensatte produserte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Dereplication av en kjent antibiotika. Den produserende belastningen WAC 8921 ble dereplicated ved hjelp av ARP-malen. Veksten av E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC PGDP1:Cat på overflaten av MHB agar overlegg indikerer at WAC 8921 er en kloramfenikol produsent. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Dereplication av ukjent antibiotika. Den produserende belastningen WAC 9941 ble dereplicated ved hjelp av ARP-malen. En mangel på E. coli bibliotek vekst ble sett på overflaten av den rektangulære Petri parabolen, noe som indikerer at enten WAC 9441 er å produsere en ukjent antimikrobielle sammensatte eller en sjelden antibiotika som ikke er beregnet for i ARP. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: identifisering av et antimikrobielle stoff som ikke kan krysse av en intakt ytre membran. Den produserende belastningen WAC 4178 ble dereplicated ved hjelp av MARP malen. Stammer av e. coli BW25113 er i stand til å vokse på overflaten av den sekundære metabolitten-inneholdende medier, mens alle stammer av e. coli BW25113 ΔbamBΔtolC kan ikke vokse. Dette tyder på at WAC 4178 produserer en antimikrobielle sammensatte som ikke kan krysse en intakt ytre membran. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: forurensning på grunn av ikke-sterile festeverktøy. Den produserende belastningen WAC 7094 ble dereplicated ved hjelp av ARP-malen. Tilstedeværelsen av E. coli bibliotek vekst i områder som ikke har en tildelt E. coli stamme antyder at festeverktøy brukes til å vaksinere den MHB agar overlegg av rektangulære Petri parabolen var ikke riktig sterilisert. Dette resulterer i overføring av ukjente E. coli stammer over overlegget. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: forurensning på grunn av en forurenset frosset lager ARP/MARP-mal. Den produserende belastningen WAC 3683 ble dereplicated ved hjelp av ARP-malen. Tre distinkte E. coli koloniene vokste på den rektangulære Petri parabolen overflaten: to samsvarer med E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC uttrykke stat, a Streptothricin Resistance enzym, og den andre tilsvarer E. coli BW25113 ΔBamBΔtolC uttrykke Vim-2SS, en β-Laktam motstand enzym. På grunn av mangel på replikere BlaVIM2ss koloni vekst, i tillegg til mangelen på kryss motstand kjent for å forekomme mellom disse to antibiotika klasser, kan det antas at en annen stamme enn E. coli ΔbamBΔ tolC pGDP1: BlaVIM2ss vokser i de respektive frosne biblioteket plate godt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: GJENNOMBORET MHB agar overlegg. Den produserende belastningen WAC 5106 ble dereplicated ved hjelp av ARP-malen. Denne belastningen ble funnet å være en Streptomycin produsent, som indikert av veksten av E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC pGDP3:Aph (6)-IA. Punktering hull kan sees på overflaten av MHB agar overlegg langs omkretsen av platen. Selv om dette ikke påvirker dereplication resultater, kan det gjøre dataene vanskelige å tolke ved første øyekast. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: forurensning av MHB agar overlegg. Forurenset MHB agar produserer en uregelmessig vekstmønster på overflaten av overlegget som blir synlig etter incubating platen over natten ved 37 ° c. Selv om E. coli vekst kan fortsatt være synlig gjennom forurensning, er det anbefalt å gjenta eksperimentet før ekstrapolere data fra platen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Plasmider | Valgbar markør |
| pGDP1 | Kanamycin 50 μg/mL |
| pGDP2 | |
| pGDP3 | Ampicillin 100 μg/mL |
| pGDP4 | |
| Ingen | - |
Tabell 1: valgbare markører som brukes i pGDP plasmider-serien. Stripe ARP/MARP E. coli stammer på lb agar Petri retter som inneholder den riktige valgbar markør på riktig konsentrasjon for hver plasmider.
| Media | Ingrediensen | Beløpet |
| Sam | Glukose | 15 g |
| Soya peptone | 15 g | |
| Nacl | 5 g | |
| Gjærekstrakt | 1 g | |
| CaCO3 | 1 g | |
| Glyserol | 2,5 mL | |
| ddH2O | Til 1 L | |
| Bennett ' s | Potetstivelse | 10 g |
| Casamino syrer | 2 gram med | |
| Gjærekstrakt | 1,8 g | |
| Czapek mineral Mix | 2 mL med | |
| Agar (valgfritt) | 15 g | |
| ddH2O | Til 1 L | |
| Czapek mineral Mix | KCl | 10 g |
| MgSO4∙ 7H2O | 10 g | |
| NaNO3 | 12 g | |
| FeSO4∙ 7H2O | 0,2 g | |
| Konsentrert HCl | 200 μL | |
| ddH2O | Til 100 mL |
Tabell 2: oppskrifter for Sam og Bennett ' s Media, og Czapek mineral mix. Juster SAM og Bennett til pH 6,8 før autoklavering, og filter sterilisere Czapek mineral mix.
| Antibiotika klasse | Antibiotika | Motstands-genet | E. coli-stamme | Vel posisjon |
| Aminoglykosider | Streptomycin | Aph (3 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 |
| 2-Deoxystreptamine | rmtB | ΔbamBΔtolC BW25113 | F3, C10 | |
| Apramycin | apmA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | |
| Spectinomycin | Aph (9)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | |
| β-lactams | Penicillin | NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 |
| Cefalosporin | ||||
| Carbapenam | ||||
| Linkosamider | Linkosamider | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 |
| Makrolider | Makrolider | ermC | ||
| Type B-Streptogramins | Type B-Streptogramins | ermC | ||
| Type A Streptogramins | Type A Streptogramins | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 |
| Streptothricin | Streptothricin | STAT | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetracykliner | Tetracycline | tet (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Chloramphenicols | Chloramphenicols | Katten | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| Polymyxins | Polymyxins | MCR-1 | vill-type BW25113 | C6, F7 |
| Echinomycins | Echinomycins | uvrA | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 |
| Sideromycins | Albomycin | fhuB mutant | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| Tuberactinomycins | Viomycin | vph | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 |
| N/a | N/a | N/a | vill-type BW25113 | C1, C12, F1, F12, E5, D8 |
| N/a | N/a | N/a | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabell 3: brønn betegnelse tabell for MINIMALE ARP-stammer. Denne tabellen viser hvilken brønn av en 96 brønn plate som hver av de minimale ARP-stammene kan bli funnet i, i henhold til det minimale ARP bibliotek plate kartet. Tabellen viser også hvilken antibiotika klasse hvert gen tildeler motstand til. Vær oppmerksom på at noen gener kan gi motstand mot mer enn en antibiotika i den gitte antibiotika klassen.
| Antibiotika klasse | Antibiotika | Motstands-genet | E. coli-stamme | Vel posisjon |
| Aminoglykosider | Streptomycin | Aph (3 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B2, G11 |
| Aph (6)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C6, F7 | ||
| Spectinomycin | Aph (9)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A2, H11 | |
| Gentamicin | AAC (3)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A3, H10 | |
| Ant (2 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | A5, H8 | ||
| Aph (2 ' ')-ID | ΔbamBΔtolC BW25113 | A4, H9 | ||
| Arma | ΔbamBΔtolC BW25113 | A6, H7 | ||
| AAC (6 ')-Aph (2 ' ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B5, G8 | ||
| Kanamycin | Aph (3 ')-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B4, G9 | |
| Aph (3 ')-Illa | ΔbamBΔtolC BW25113 | B3, G10 | ||
| Hygromycin | Aph (4)-IA | ΔbamBΔtolC BW25113 | B6, G7 | |
| β-lactams | Amoxicillin | TEM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F6, C7 |
| Ceftazidim | CTX-M-15 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F5, C8 | |
| Oxacillin | OXA-10 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G5, B8 | |
| OXA-48 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H5, A8 | ||
| Meropenem | IMP-7ss | ΔbamBΔtolC BW25113 | G4, B9 | |
| KPC-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | G6, B7 | ||
| NDM-1 | ΔbamBΔtolC BW25113 | H6, A7 | ||
| Imipenem | VIM-2 | ΔbamBΔtolC BW25113 | F4, C9 | |
| Linkosamider | Linkosamider | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| lnu (A) | ΔbamBΔtolC BW25113 | C5, F8 | ||
| Makrolider | Makrolider | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| mphA | ΔbamBΔtolC BW25113 | C3, F10 | ||
| mphB | ΔbamBΔtolC BW25113 | C2, F11 | ||
| Type B-Streptogramins | Type B-Streptogramins | ermC | ΔbamBΔtolC BW25113 | C4, F9 |
| VGB | ΔbamBΔtolC BW25113 | D4, E9 | ||
| Type A Streptogramins | Type A Streptogramins | vatD | ΔbamBΔtolC BW25113 | D5, E8 |
| Streptothricin | Streptothricin | STAT | ΔbamBΔtolC BW25113 | D3, E10 |
| Tetracykliner | Tetracycline | tet (M) | ΔbamBΔtolC BW25113 | E5, D8 |
| Chloramphenicols | Chloramphenicols | Katten | ΔbamBΔtolC BW25113 | E4, D9 |
| Fosfomycins | Fosfomycins | fosA | ΔbamBΔtolC BW25113 | H4, A9 |
| Rifamycins | Rifamycins | Arr | ΔbamBΔtolC BW25113 | E3, D10 |
| N/a | N/a | N/a | ΔbamBΔtolC BW25113 | A1, A12, B1, B12, D6, D7, E6, E7, G1, G12, H1, H12 |
Tabell 4: brønn betegnelse tabell for ARP-stammer. Denne tabellen indikerer hvilken brønn av en 96 brønn plate som hver av ARP-stammene kan bli funnet i, i henhold til ARP bibliotek plate kartet. Tabellen viser også hvilken antibiotika klasse hvert gen tildeler motstand til. Vær oppmerksom på at noen gener kan gi motstand mot mer enn en antibiotika i den gitte antibiotika klassen.
Supplerende figur 1: biblioteket plate kart brukes for den opprinnelige antibiotikaresistens plattform (ARP) mal. Organisere de respektive E. coli stammer i en 96-brønn plate ved hjelp av dette formatet for å sikre at alle nødvendige kontroller og duplikater er inkludert. Dette tallet har blitt modifisert fra Cox et al.10. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 2: biblioteket plate kart brukes for minimal antibiotikaresistens plattform (MARP) mal. Organisere de respektive E. coli stammer i en 96-brønn plate ved hjelp av dette formatet for å sikre at alle nødvendige kontroller og duplikater er inkludert. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet ovenfor kan brukes til både oppdagelsen av romanen antimikrobielle forbindelser og adjuvans som kan brukes i forbindelse med eksisterende antibiotika for å redde sin aktivitet. Plattformen utnytter det høye underlaget spesifisitet av motstands mekanismer og deres beslektet antibiotika, til dereplicate forbindelser innenfor råolje naturlige produkt ekstrakter. Selv om tiden som kreves for dereplication plater å være forberedt er lang (~ 2 uker), den dereplication prosessen i seg selv er fullført etter en eneste natten inkubasjonsperiode, som er rask i forhold til den tiden det kan ta å isolere og karakterisere en sammensatt av råolje ekstrakter. I tillegg er det ikke nødvendig med dyrt eller høyt spesialisert utstyr, noe som gjør denne plattformen tilgjengelig og kostnadseffektiv.
En annen stor fordel med denne plattformen er dens fleksibilitet. ARP kan utvides til å inneholde resistens gener som omfatter mer antibiotika klasser. Dette oppnås ved å overvåke litteraturen for fremveksten av romanen motstand enzymer og bruke grunnleggende molekylær kloning teknikker for å legge til gener til E. coli biblioteket. Videre er dereplication malen tilpasses basert på ønsket nivå av bred eller smal rekkevidde substrat spesifisitet at en person ønsker å bruke når dereplicating. Enhver kombinasjon av gener i E. coli biblioteket kan brukes til å lage romanen biblioteket plater med evnen til å oppdage forbindelser med ulike profiler. For eksempel kan en β-laktamase uttrykker E. coli mal utvikles for å muliggjøre den svært spesifikke dereplication av β-lactams og deres ulike underklasser.
Mens denne plattformen ble opprinnelig utviklet for å dereplicate forbindelser på solid Media, det også vært arbeider i flytende Media. Dette er nyttig når du arbeider med forbindelser som allerede er renset der bare et begrenset beløp er tilgjengelig for testing, eller når du arbeider med forbindelser som ikke diffus lett eller konsekvent i solid Media. Til slutt, mens denne protokollen ble beskrevet ved hjelp av E. coli stammer BW25113 og BW25113 ΔbamBΔtolC, plattformen kan brukes med motstanden genet biblioteket uttrykt i ulike stammer av E. coli (dereplication fenotyper kan variere). Til syvende og sist er antibiotikaresistens plattformen fleksibel, har mange bruksområder, og er fordelaktig over andre dereplication metoder.
For å sikre at reproduserbar og ikke-forurenset resultater oppnås, er det avgjørende å følge egnede steriliserings-og aseptisk teknikker. Unnlatelse av å gjøre dette vil føre til forurensning av festeverktøy, bibliotek plate, eller den dereplication platen selv. Mens valgbar markører er til stede i E. coli biblioteket, som kan bidra til å forebygge forurensning forårsaket av bakterier mangler markør, betyr det ikke hindre krysskontaminering av stammer ved hjelp av samme markør. For å redusere risikoen for dette skjer er det viktig å nøye sterilisere bakteriell låsing verktøy før låsing fra biblioteket plate. Hver biblioteks plate bør bare festes fra 3 − 4 ganger maksimum før en ny mal skal fjernes. Dette forhindrer spredning av forurensning på tvers av alle dereplication plater hvis en biblioteks plate blir forurenset under feste prosessen. I tillegg, ingen antibiotika brukes når vaksinere den dereplication plate og så stor forsiktighet må tas for å hindre forurensning før det er igjen å gjære i seks dager. En annen mulig kilde til forurensning er i MHB agar overlegg av dereplication plate. Hvis overleggs mediene er forurenset, vil veksten bare vises etter overnight-inkubasjons på 37 ° c etter låsing. Overlay forurensning kan gjøre det svært vanskelig å analysere veksten av E. coli biblioteket på overlegget overflaten. For å redusere sjansene for overlay forurensning, forberede MHB agar friskt før helle overlegget. Det anbefales at inntil en person er komfortabel med denne metoden, bør dereplication plater alltid være forberedt i duplikat eller tre eksemplarer slik at i tilfelle av forurensning av en plate, kan data fortsatt være Hentet fra forhåpentligvis ikke-forurensede plater.
Til slutt er det viktig å merke seg at ARP/MARP har begrensninger. Denne protokollen er ikke egnet for de-replikering av produserende-stammer som produserer mer enn én bioaktive sammensatte. Hver stamme i E. coli biblioteket har blitt designet for å uttrykke en enkelt motstand genet. Hvis to antibiotika blir produsert av en organisme, verken motstand genet vil konferere motstand mot andre antibiotika, og dermed resulterer i celle død av begge stammer. Dermed, denne muligheten må vurderes når dereplication resultater tyder på tilstedeværelsen av en roman antibiotika fordi produksjonen av flere antibiotika ikke kan oppdages av dagens enkelt konstruere E. coli bibliotek. En tilnærming som kan tas for å bekjempe utfordringen med dereplicating stammer som produserer mer enn en antibiotika innebærer å bruke agar-plug prosedyren beskrevet i den opprinnelige ARP papir av Cox et al.10. I denne metoden, en del av en gjæret solid medium er fjernet fra en antibiotika-produsent som inneholder plate og plassert på en plen av indikator ARP belastning. Indikatoren belastningen kan være noen av de resistente E. coli stammer i ARP biblioteket. Soner av hemming blir deretter brukt til å sammenligne bioactivity av en produksjon-belastning mot ARP stammer og en vill-type belastning. ARP-stammer som danner en hemmende sone av redusert størrelse i forhold til den ville-type belastningen kan motstå sammensatt blir produsert. Denne metoden har vist seg å være effektiv på å identifisere stammer i stand til å produsere flere antibiotika10.
Oppsummert, for å oppnå de beste resultatene når dereplicating med ARP/MARP det anbefales at dereplication platene er utarbeidet i duplikat eller tre eksemplarer. Andre kritiske trinn i protokollen inkluderer låsing fra en ny bibliotek plate (aldri frosset) og fjerne så mye biomasse som mulig fra den produserende-belastningen under membranen fjerning scenen. Hvis alle nødvendige skritt er fulgt, bør man ha vellykkede dereplication resultater for en produksjon-stamme av interesse innenfor en to-ukers tidsramme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning på Wright-laboratoriet vedrørende ARP/MARP ble støttet av Ontario Research Fund og Canadian Institutes of Health Research Grant (FRN-148463). Vi ønsker å erkjenne sommer Chou for å bistå i ekspansjon og organisering av ARP biblioteket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
| AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
| Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
| BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
| BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
| Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
| Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
| D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
| Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
| Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
| Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
| Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
| Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
| Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
| LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
| MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
| Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
| Petri dish 92 mm x 16 mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Pinning tools | ETH Zurich | - | Custom order |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
| Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |
References
- Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).
- Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
- Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
- Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
- Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
- Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
- Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
- Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
- Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. Roessner, U., Dias, D. A. , Humana Press. Totowa, NJ. 227-244 (2013).
- Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
- Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
- Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
- Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
- Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
- Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).
