Vi beskriver en plattform som utnytter et bibliotek av isogenic antibiotika resistente Escherichia coli for dereplication av antibiotika. Identiteten til en antibiotika produsert av bakterier eller sopp kan utledes av veksten av E. coli uttrykke sine respektive motstand genet. Denne plattformen er økonomisk effektiv og tidseffektiv.
En av de viktigste utfordringene i jakten på nye antibiotika fra naturlige produkt ekstrakter er re-oppdagelsen av felles forbindelser. For å møte denne utfordringen, dereplication, som er prosessen med å identifisere kjente forbindelser, er utført på prøver av interesse. Metoder for dereplication som analytisk separasjon etterfulgt av masse massespektrometri er tidkrevende og ressurskrevende. For å forbedre dereplication prosessen, har vi utviklet antibiotikaresistens plattformen (ARP). ARP er et bibliotek på ca 100 antibiotikaresistens gener som er individuelt klonet inn Escherichia coli. Denne belastningen samlingen har mange programmer, inkludert en kostnadseffektiv og facile metode for antibiotika dereplication. Prosessen innebærer gjæring av antibiotika-produserende mikrober på overflaten av rektangulære Petri retter som inneholder solid medium, og dermed gir mulighet for utskillelsen og diffusjon av sekundære metabolitter gjennom mediet. Etter en 6 dagers gjæring periode, er den mikrobielle biomasse fjernet, og en tynn agar-overlegg er lagt til Petri parabolen å skape en glatt overflate og aktivere veksten av E. coli indikator stammer. Vår samling av ARP stammer deretter festet på overflaten av antibiotika-inneholdende Petri parabolen. Platen er neste inkubert over natten for å tillate E. coli vekst på overflaten av overlegget. Bare stammer som inneholder resistens mot en bestemt antibiotika (eller klasse) vokse på denne overflaten muliggjør rask identifisering av produserte sammensatte. Denne metoden har blitt brukt for identifisering av produsenter av kjente antibiotika og som et middel til å identifisere de produserende romanen forbindelser.
Siden oppdagelsen av penicillin i 1928, naturlige produkter avledet fra miljømessige mikroorganismer har vist seg å være en rik kilde til antimikrobielle forbindelser1. Omtrent 80% av naturlig produkt antibiotika er avledet fra bakterier av slekten Streptomyces og andre aktinomyceter, mens de resterende 20% er produsert av fungal arter1. Noen av de vanligste antibiotika stillaser som brukes i klinikken som β-lactams, tetracykliner, rifamycins og aminoglykosider, ble opprinnelig isolert fra mikrober2. Men på grunn av fremveksten av multidrug resistente (MDR) bakterier, vår nåværende panel av antibiotika har blitt mindre effektive i behandling3,4. Disse inkluderer “ESKAPE” patogener (dvs. Vancomycin enterokokker og β-Laktam-resistente Staphylococcus aureus, klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, og Enterobacter Sp.), som er et delsett av bakterier anses å være assosiert med den høyeste risikoen ved en rekke store offentlige helsemyndigheter som verdenshelseorganisasjon3,4,5. Fremveksten og global spredning av disse MDR patogener resulterer i en konstant behov for romanen antibiotika3,4,5. Dessverre har de siste to ti årene vist at oppdagelsen av romanen antibiotika fra mikrobielle kilder er stadig vanskeligere6. Dagens tilnærminger til narkotika funnet inkluderer høy gjennomstrømming screening av bioaktive forbindelser, inkludert naturlig produkt ekstrakt biblioteker, slik at for tusenvis av ekstrakter som skal testes på et gitt tidspunkt2. Men når antimikrobielle aktivitet oppdages, er neste trinn å analysere innholdet i råolje ekstrakt å identifisere den aktive komponenten og eliminere de som inneholder kjente eller overflødige forbindelser7,8. Denne prosessen, referert til som dereplication, er avgjørende for å forebygge og/eller redusere tiden brukt på re-oppdagelsen av kjente antibiotika7,9. Selv om det er et nødvendig skritt i naturprodukt oppdagelse, er dereplication notorisk arbeidskrevende og ressurskrevende10.
Helt siden Beutler et al. første innførte begrepet “dereplication”, omfattende innsats har blitt gjort for å utvikle innovative strategier for rask identifisering av kjente antibiotika11,12. I dag er de vanligste verktøyene som brukes for dereplication inkluderer analytiske kromatografiske systemer som høy ytelse flytende kromatografi, masse massespektrometri, og kjernefysiske magnetiske resonans-baserte deteksjon metoder11,13. Dessverre krever hver av disse metodene bruk av dyrt analytisk utstyr og sofistikert data tolkning.
I et forsøk på å utvikle en dereplication metode som raskt kan utføres uten spesialisert utstyr, etablerte vi antibiotikaresistens plattformen (ARP)10. ARP kan brukes til oppdagelsen av antibiotika adjuvans, profilering av nye antibiotika forbindelser mot kjente motstands mekanismer, og dereplication av kjente antibiotika i ekstrakter avledet fra actinobacteria og andre mikrober. Her fokuserer vi på anvendelsen i antibiotika dereplication. ARP utnytter et bibliotek med isogenic Escherichia coli stammer uttrykke individuelle motstand gener som er effektive mot de vanligste re-oppdaget antibiotika14,15. Når E. coli biblioteket dyrkes i nærvær av en sekundær metabolitten-produserende organisme, identiteten til det sammensatte kan utledes av veksten av E. coli stammer som uttrykker sin tilknyttede motstanden genet10. Når ARP ble først rapportert, biblioteket besto av > 40 gener overdragelse motstand mot 16 antibiotika klasser. Den opprinnelige dereplication malen ble utformet for å omfatte en undergruppe av motstands gener per antibiotika klasse for å gi informasjon om antibiotika underklasse under dereplication prosessen. I dag er ARP består av > 90 gener som tildeler motstand til 18 antibiotika klasser. Ved hjelp av vår omfattende samling av resistens gener, en sekundær dereplication mal har blitt utviklet og er kjent som minimal antibiotikaresistens plattform (MARP). Denne malen ble opprettet for å eliminere gen redundans og å bare gi informasjon om den generelle antibiotika klassen at en dereplicated metabolitten er relatert til. I tillegg MARP malen besitter både wildtype og en hyperpermeable/utstrømming mangelfull stamme av E. coli BW25113 (E. coli BW25113 ΔbamBΔtolC), sammenlignet med den opprinnelige inkarnasjonen av ARP, som bare utnytter hyperpermeable belastningen. Dette unike aspektet skaper ekstra fenotyper under dereplication, indikerer en forbindelser evne til å krysse den ytre membran av gram-negative bakterier. Her beskriver vi en robust protokoll som skal følges ved dereplicating med enten ARP og/eller MARP, fremhever de mest kritiske trinnene som skal følges, og diskuterer de ulike mulige utfall.
Protokollen beskrevet ovenfor kan brukes til både oppdagelsen av romanen antimikrobielle forbindelser og adjuvans som kan brukes i forbindelse med eksisterende antibiotika for å redde sin aktivitet. Plattformen utnytter det høye underlaget spesifisitet av motstands mekanismer og deres beslektet antibiotika, til dereplicate forbindelser innenfor råolje naturlige produkt ekstrakter. Selv om tiden som kreves for dereplication plater å være forberedt er lang (~ 2 uker), den dereplication prosessen i seg selv er fullfø…
The authors have nothing to disclose.
Forskning på Wright-laboratoriet vedrørende ARP/MARP ble støttet av Ontario Research Fund og Canadian Institutes of Health Research Grant (FRN-148463). Vi ønsker å erkjenne sommer Chou for å bistå i ekspansjon og organisering av ARP biblioteket.
Agar | Bio Shop | AGR003.5 | |
AlumaSeal CS Films for cold storage | Sigma-Aldrich | Z722642-50EA | |
Ampicillin Sodium Salt | Bio Shop | AMP201.100 | |
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton Dickinson | 212322 | |
BBL Phytone Peptone (Soytone) | Becton Dickinson | 211906 | |
Calcium Carbonate | Bio Shop | CAR303.500 | |
Casamino acid | Bio Basic | 3060 | |
Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour | Sarstedt | 72.379.992 | |
D-glucose | Bio Shop | GLU501.5 | |
Disposable Culture Tube, 16x100mm | Fisher Scientific | 14-961-29 | |
Ethyl Alcohol Anhydrous | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
Glass Beads, Solid | Fisher Scientific | 11-312C | |
Glycerol | Bio Shop | GLY001.4 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
Instant sealing sterilization pouch | Fisher Scientific | 01-812-54 | |
Iron (II) Sulfate Heptahydrate | Sigma-Aldrich | F7002-250G | |
Kanamycin Sulfate | Bio Shop | KAN201.50 | |
LB Broth Lennox | Bio Shop | LBL405.500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | M63-500 | |
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size | Millipore-Sigma | HAWP00010 | 10 FT roll, hydrophillic, white, plain |
Microtest Plate 96 well, round base | Sarstedt | 82.1582.001 | |
New Brunswick Innova 44 | Eppendorf | M1282-0000 | |
Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 264728 | with lid, sterile, non treated |
Petri dish 92x16mm with cams | Sarstedt | 82.1473.001 | |
Pinning tools | ETH Zurich | – | Custom order |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
Potato starch | Bulk Barn | 279 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
Sodium Nitrate | Fisher Scientific | S343-500 | |
Wood Applicators | Dukal Corporation | 9000 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 |