Summary
Para identificar novos reguladores de fatores de transcrição, desenvolvemos uma abordagem para tela de bibliotecas RNAi lentivirais ou retrovirais usando um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase. Esta abordagem oferece uma maneira rápida e relativamente barata de selecionar centenas de candidatos em um único experimento.
Abstract
Fatores de transcrição podem alterar a expressão de numerosos genes-alvo que influenciam uma variedade de processos a jusante tornando-os bons alvos para terapias anticâncer. No entanto, direcionar diretamente os fatores de transcrição é muitas vezes difícil e pode causar efeitos colaterais adversos se o fator de transcrição for necessário em um ou mais tecidos adultos. Identificar reguladores a montante que ativam aberrrantamente fatores de transcrição em células cancerosas oferece uma alternativa mais viável, particularmente se essas proteínas são fáceis de drogar. Aqui, descrevemos um protocolo que pode ser usado para combinar bibliotecas lentivirais de média escala e um ensaio de repórter transcricional baseado em dupla luciferase para identificar novos reguladores de fatores de transcrição em células cancerosas. Nossa abordagem oferece uma maneira rápida, fácil e barata de testar centenas de genes em um único experimento. Para demonstrar o uso desta abordagem, realizamos uma tela de uma biblioteca RNAi lentiviral organizada contendo vários reguladores de proteína associada a Sim (YAP) e co-ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ), dois co-ativadores transcritores que são os efeitos a jusante da via Hipopótamo. No entanto, essa abordagem pode ser modificada para os reguladores de praticamente qualquer fator de transcrição ou co-fator e também pode ser usada para tela de bibliotecas CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF.
Introduction
O objetivo deste ensaio é usar bibliotecas virais para identificar reguladores de fatores de transcrição de forma relativamente rápida e barata. A atividade transcricional aberrante está associada ao câncer e à metástase1,2,3,4,5,6, então direcionar fatores de transcrição em células cancerosas é uma abordagem terapêutica promissora. No entanto, fatores de transcrição são muitas vezes difíceis de atingir farmacologicamente7 e muitos são necessários para a função celular normal em tecidos adultos8,9,10. Direcionar as vias associadas ao câncer que ativam aberrrantamente fatores de transcrição para conduzir a doença é uma abordagem mais viável com potencial para ter efeitos colaterais menos graves. A disponibilidade comercial de bibliotecas RAi, CRISPR/CAS9, cDNA ou ORF, lentiona ou ré, permite aos pesquisadores testar a importância de inúmeros genes em um único experimento. No entanto, é necessária uma leitura confiável para a atividade transcricional alterada.
Aqui, descrevemos o uso de um ensaio transcricional baseado em duas luciferases e bibliotecas lentivirais organizadas para identificar proteínas que regulam fatores de transcrição em células cancerosas. Neste ensaio, as shRNAs que visam genes associados ao câncer são entregues às células cancerígenas de mamíferos através da transdução lentiviral e as células são selecionadas para integração estável usando puromicina. As células são transfeccionadas em seguida com uma construção de repórter que expressa a luciferase de vagalume impulsionada por um promotor específico para o fator de transcrição que está sendo investigado e um conjunto de controle que expressa a luciferase de Renilla de um promotor constitutivamente ativo que não responde ao fator de transcrição que está sendo investigado. Demonstramos essa abordagem com uma tela de prova de conceito para os reguladores da YAP e da TAZ, os efeitos críticos a jusante da via Hipopótamo88,10,,11. A atividade anormal de YAP e TAZ promove várias etapas da cascata metastática11 e é observada em muitos cânceres11,12,13. No entanto, como yap e TAZ se tornam aberrantemente ativados em algumas células cancerosas ainda não é totalmente compreendido. YAP e TAZ não ligam DNA, mas são recrutados para promotores por outros fatores de transcrição. Os membros da família tea domain (TEAD) de fatores de transcrição são os principais parceiros vinculantes para YAP e TAZ, e são críticos para a maioria das funções dependentes de YAP e TAZ. Nossa construção de repórter expressa a luciferase de vagalumes de um promotor yap/taz-TEAD-responsivo e estudos anteriores demonstraram que detecta fielmente alterações na atividade transcricional YAP-TEAD e TAZ-TEAD2,14,15.
Nossa abordagem é rápida, de médio porte, e não requer instalações de triagem, robôs automatizados ou sequenciamento profundo de bibliotecas agrupadas. Os custos são relativamente baixos e há inúmeras bibliotecas disponíveis comercialmente para escolher. Os equipamentos e reagentes necessários também são relativamente padrão na maioria dos laboratórios. Ele pode ser usado para rastrear reguladores de praticamente qualquer fator de transcrição se um repórter baseado em luciferase existir ou for gerado. Usamos essa abordagem para tela shRNAs em células cancerosas, mas qualquer linha celular que possa ser transfeccionada com eficiência razoável poderia ser usada com qualquer tipo de biblioteca organizada.
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Protocol
NOTA: Um resumo esquemático deste protocolo é mostrado na Figura 1.
1. Preparação da biblioteca vetorial lentiviral
NOTA: A tela demonstrada usou uma biblioteca de shRNA organizada comprada como estoque de glicerol em placas de 96 poços, mas as bibliotecas também podem ser montadas manualmente com base em uma lista de candidatos. Os controles apropriados devem ser considerados e incluídos em qualquer biblioteca. Isso inclui um shRNA (shNTC) de controle, um shRNA de controle direcionado ao fator de transcrição que está sendo investigado e, se possível, um shRNA direcionado à luciferase de vagalume.
- Adicionar 1,3 mL de Caldo de Luria (LB) (1% bacto-tripton, 0,5% extrato de levedura, 1% NaCl, pH 7,5) contendo 100 μg/mL de ampicillin a cada poço de uma placa de poço profundo de 96 poços. Inocule cada poço com 2 μL de glicerol e cresça a 37 °C durante a noite com agitação constante a 225 rpm.
- Transfira cada cultura bacteriana para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e pelota as bactérias por centrifugação a 21.000 x g a 4 °C por 10 min.
- Purifique cada vetor usando um mini-kit de preparação bacteriana seguindo o protocolo do fabricante.
- Determine a concentração de cada vetor usando um espectrofotômetro.
- Armazene os plasmídeos a -20 °C.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Embalagem da biblioteca lentiviral organizada
NOTA: Todo o trabalho envolvendo lentivírus, incluindo embalagem, infecção e posterior cultivo de células infectadas, deve seguir rigorosamente as regras e regulamentos institucionais de biossegurança.
- Expanda as células de 293FT usando mídia de crescimento completo (o meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4 mM L-glutamina, 4.500 mg/L de glicose e piruvato de sódio, suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de esteptomicina e 2 mM
- Para cada vetor na biblioteca a partir do passo 1.4, semente um 24-well com 1 x 105 293FT células.
NOTA: Recomenda-se que alguns poços extras de um vetor viral de controle sejam embalados e utilizados para testar o título do vírus antes de prosseguir para a etapa 3 (veja abaixo). - Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 horas.
NOTA: Um protocolo geral para embalagem de lentivírus descrito anteriormente14 foi reduzido para 24 poços para este protocolo. Ele usa psPAX2 para embalagem lentiviral e VSVG como uma proteína de casaco. Se o vírus ectrópico for desejado, um vetor que entrega Eco pode ser usado em vez de VSVG. É altamente recomendável que este protocolo seja otimizado para alcançar um título viral que dê entre 30%-70% de eficiência de infecção das células-alvo (ver Discussão). Consulte a Tabela Suplementar 1 para obter uma lista de todos os vetores utilizados. - Configure uma mistura de transfecção para cada vetor viral da Etapa 1.4, conforme descrito abaixo. Cada transfecção deve conter 250 ng do vetor viral, 125 ng de psPAX2, 125 ng de VSVG, 1,25 μL de reagente de transfecção 1 e 23,75 μL de tampão de transfecção (ver Tabela de Materiais).
- Diluir cada vetor lentiviral a 50 ng/μL com água sem nuclease e, em seguida, transferir 5 μL (250 ng) para um poço de uma placa PCR de 96 poços.
- Faça a super mistura de transfecção misturando 1,25 μL * X do reagente de transfecção 1 e 23,75 μL * X de tampão de transfecção pré-aquecido onde "X" é o número total de transfecções mais várias extras para explicar a perda de volume durante a pipetação.
- Incubar a super mistura de transfecção em temperatura ambiente por 5 min.
- Adicione 125 ng * X de psPAX2 e 125 ng * X de VSVG ao tubo de transfecção super mix a partir do Passo 2.4.3 e suavemente pipet para cima e para baixo para misturar. Siga rapidamente para o Passo 2.4.5.
- Alíquota imediatamente a mistura do Passo 2.4.4 em cada tubo de uma tira PCR e, em seguida, use a pipeta multicanal para transferir 25 μL da mistura para cada poço contendo vetor viral da Etapa 2.4.1.
- Incubar em temperatura ambiente por 20 min.
- Transfira todos os 30 μLs de cada 96 poços da Etapa 2.4.6 para um poço de 24 poços contendo células de 293 FT do Passo 2.3.
- Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h e, em seguida, substituir a mídia em cada poço da placa de 24 poços com 500 μL de mídia de crescimento completo fresco. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por mais 24 horas.
- Usando uma pipeta multicanal, colete o supernadante viral de cada poço e alíquota 220 μL (suficiente para 1 infecção no Passo 3 mais algum volume extra) em dois poços de 96 cada. Estas são as placas supernatant virais.
- Armazene as placas supernatantes virais dispostas a -80 °C.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Também é recomendado testar parte do vírus de controle extra que foi embalado (veja acima) nas células a serem infectadas antes de prosseguir para a Etapa 3. Isto é para garantir que o título seja suficiente para atingir pelo menos 30% de eficiência de infecção.
3. Infecção das células para a tela
NOTA: As células de melanoma humano (A375) foram utilizadas para demonstrar essa abordagem, mas este método pode ser aplicado a quaisquer células aderentes que infectem com lentivírus. No entanto, as condições de cultura celular e de revestimento devem ser otimizadas para cada linha celular (ver Discussão).
- Expanda as células para serem infectadas em meios de crescimento completos.
- Semente sed24-well placas com 1 x 105 células em 0,5 ml de mídia de crescimento completo por poço. A semente um poço para cada vetor viral a ser testado (incluindo controles) e incluir um poço extra que não será infectado que servirá como um controle para a seleção de medicamentos na Etapa 3.7.
- Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 horas.
- Infectar cada poço do Passo 3.2 com um sobrenadante viral diferente do sobrenadante lentiviral congelado da seguinte forma.
- Prepare a mídia de crescimento completa que contenha 20 μg/mL de polibreno.
- Descongele os supernatantes da biblioteca lentiviral da Etapa 2.7 à temperatura ambiente.
- Apiratee a mídia de crescimento das placas de 24 poços da Etapa 3.2 e adicione imediatamente 200 μL de mídia de crescimento contendo polibrene a cada poço.
- Usando uma pipeta multicanal, transfira 200 μL de supernadante viral de cada 96 poços da Etapa 3.4.2 para os 24 poços da Etapa 3.4.3.
- Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 - 48 h.
NOTA: Algumas linhas celulares podem exigir mais de 24 h para expressar as shRNAs e tornar-se resistentes à puromicina. O vetor viral aqui utilizado fornece um Turbo-GFP-IRES-puroR com um shRNA à base de miR30 no 3'UTR de puroR(Figura 1). A eficiência da infecção e a expressão do gene de resistência à puromicina e do shRNA foram monitorados por proteína fluorescente verde. - Prepare a mídia de crescimento completa que contenha 2,5 μg/mL de puromicina.
NOTA: A concentração de seleção de puromicina varia entre as linhas celulares. Recomenda-se que uma curva de morte por antibiótico seja realizada para cada linha celular a ser ensaio antes da tela. - Apiratee a mídia de cada poço e substitua por 500 μL de mídia de crescimento completa contendo puromicina.
NOTA: Certifique-se também de adicionar puromicina a um poço de controle não infectado que pode ser usado em etapas subseqüentes para garantir que a seleção de puromicina esteja completa. - Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 48 h.
NOTA: É melhor selecionar por 48 h, por isso a densidade de chapeamento e o título viral devem ser otimizados para que as células não sejam superconfluentes antes das 48 h. - Certifique-se de que as células infectadas estão verdes o microscópio fluorescente, e que as células em um controle não infectado bem tratado sino estão todas mortas antes de seguir para o Passo 4.
4. Células de semeamento para transfecção de repórter de dupla luciferase
NOTA: Uma transfecção de teste deve ser feita para determinar a densidade ideal de semeada para cada nova linha celular.
- Tente cada poço a partir do Passo 3.9 e transfira aproximadamente 1 x 105 células para poços na posição correspondente na nova placa de 24 poços da seguinte forma.
NOTA: Este protocolo foi projetado para a triagem de bibliotecas com centenas de shRNAs, por isso não é viável contar todos os poços de células infectadas. Portanto, as etapas abaixo foram utilizadas para estimar os números das células em cada poço para ajudar a garantir aproximadamente igual densidade de revestimento.- Agrupar os poços do Passo 3.9 em 3 - 4 grupos de tal forma que todos os poços de um grupo têm uma densidade celular semelhante.
- Trippsinize 1 representante bem de cada grupo com 200 μL de trypsin-EDTA (1x PBS complementado com 0,5 mM EDTA e 0,1% de tripspsina) para 5 min a 37 °C. Em seguida, neutralizar a tripsina-EDTA adicionando 400 μL de puromicina contendo mídia de crescimento completo.
- Conte bem cada representante para determinar o número total da célula e diluir bem a suspensão celular de cada representante para 2 x 105 células/mL de usar mídia de crescimento completa.
- Semente 0,5 mL (1 x 105 células) de cada poço do Passo 4.1.3 para a posição correspondente em uma nova placa de 24 poços e incubar esta nova placa de 24 poços a 37 °C com 5% de CO2 para 24 horas.
- Para cada grupo da Etapa 4.1.1, use o número total de célula determinado na Etapa 4.1.3 para calcular o volume de trypsin-EDTA para adicionar a cada poço de modo que a suspensão celular resultante seja de 1 x 106 células/mL.
- Adicione o volume apropriado de trypsin-EDTA a cada poço e incubar por 5 min a 37 °C.
NOTA: Para tela maior recomenda-se que as placas de 24 poços sejam tripsinizadas e replacadas em grupos, em vez de todas de uma vez para garantir a viabilidade das células. - Durante a incubação acima, use uma pipeta multicanal para adicionar 400 μL de mídia de crescimento completa contendo puromicina aos poços correspondentes em uma nova placa de 24 poços.
- Transfira 100 μL de suspensão celular (aproximadamente 1 x 105 células) de cada poço para a posição correspondente nas novas placas de 24 poços preparadas na Etapa 4.1.7.
- Repita as etapas 4.1.6 a 4.1.8 para todas as placas de poços agrupados da Etapa 4.1.1, uma placa por vez.
- Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 horas.
5. Transfecção de repórter de dupla luciferase
- Transfect cada poço a partir do Passo 4.2 com o repórter de dupla-luciferase constrói da seguinte forma.
NOTA: A quantidade total de DNA e a proporção ideal de vetor de repórter de luciferase de vagalume para controlar o vetor de luciferase renilla devem ser determinados antes de iniciar este ensaio. Aqui, 400 ng de uma mistura de DNA que contém 20 partes de luciferase de vagalume e 1 parte de controle Renilla luciferase foi usado.- Faça a mistura de diluição de transfecção (Tubo A) e a mistura de diluição do repórter (Tubo B) misturando os volumes indicados de cada reagente(Tabela 1) multiplicados pelo número total de transfecções (mais várias extras).
NOTA: Este protocolo é otimizado para o reagente de transfecção 2 (ver Tabela de Materiais). Se for utilizado um reagente de transfecção diferente, a transfecção deve ser otimizada antes desta etapa. - Misture a mistura de diluição de transfecção (Tubo A) com a mistura de diluição do repórter (Tubo B) e incubar em temperatura ambiente por 15 min para produzir mistura de transfecção.
- Durante a incubação acima, enxágue cada 24-well da Etapa 4.2 com 0,25 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) e adicione 447 μL de mídia de crescimento completo a cada poço.
- Após a incubação de 15 min, use uma pipeta multicanal para distribuir 53 μL de mistura de transfecção para cada poço das placas de 24 poços.
- Faça a mistura de diluição de transfecção (Tubo A) e a mistura de diluição do repórter (Tubo B) misturando os volumes indicados de cada reagente(Tabela 1) multiplicados pelo número total de transfecções (mais várias extras).
- Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 24 horas.
6. Quantificação da atividade de dupla luciferase
- Meça a atividade da luciferase usando um leitor de placas e um kit de ensaio de repórter de dupla luciferase, conforme descrito abaixo.
NOTA: Este protocolo é otimizado para o kit de ensaio de repórter indicado (ver Tabela de Materiais) e segue o protocolo recomendado pelo fabricante.- Prepare tampão de lyse passiva suficiente de 1x para todos os poços mais vários extras (75 μL é necessário por poço) diluindo 5x tampão passivo de lyse (fornecido no kit) 1 a 5 com água deionizada. Também descongele o reagente A e o reagente B Buffer (fornecido no kit, 100 μL de cada um é necessário para cada poço).
- Aspirar a mídia de cada poço da placa de 24 poços do Passo 5.2.
- Adicione 75 μL de tampão de lyse passiva de 1x a cada poço e incubar em temperatura ambiente por 30 min com ocasionalmente tremendo.
- Prepare o reagente B diluindo o substrato B de reagente de 50x (fornecido no kit) 1:50 com tampão b descongelado.
- Adicionar 30 μL de tampão de lyse passiva de 1x a 4 poços para apagar (ver Tabela Suplementar 2).
- Transfira 30 μL de lisato da Etapa 6.1.3 para poços duplicados de uma placa de ensaio branco de fundo plano de 96 poços.
- Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 μL de reagente A a cada poço e leia o sinal de luciferase de vagalume com um leitor de placas.
- Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 μL de reagente B da Etapa 6.1.4 para cada poço e leia o sinal de luciferase renilla com um leitor de placas.
- Processe os dados brutos da seguinte forma (para uma descrição detalhada, consulte Tabela Suplementar 2).
- Exclua amostras com sinal de luciferase renilla muito baixo, pois valores baixos indicam que a construção viral era tóxica ou que poucas células transinfectadas foram ensaios.
NOTA: Como explicado na Discussão, o sinal de luciferase renilla significativamente "baixo" pode resultar em resultados anômalos. Aqui, foram excluídos os poços em que o sinal de luciferase de Renilla foi mais de 1 desvio padrão abaixo da média (ver Tabela Suplementar 2). Isso foi baseado em estudos anteriores realizados usando este sistema de repórter nestas células14,mas pode diferir em outras linhas celulares. - Normalize o valor bruto da luciferase de mosca-das-marmelade de cada poço para o valor bruto da luciferase renilla do mesmo poço para obter a razão vagalume/Renilla.Renilla
- Média das proporçõesfirefly/Renilla de todos os poços de controle de réplica e, em seguida, divide a proporção firefly/Renilla de todos os outros poços por esse número para obter uma mudança de dobra.Renilla
- Atribuir a amostra de controle e definir o valor da razãofirefly/Renilla para 1.
- Média das relaçõesfirefly/Renilla dos poços duplicados e parcela com o desvio padrão.
NOTA: O desvio padrão não é utilizado para análise estatística, mas sim como um meio de identificar poços onde as réplicas diferem significativamente.
- Exclua amostras com sinal de luciferase renilla muito baixo, pois valores baixos indicam que a construção viral era tóxica ou que poucas células transinfectadas foram ensaios.
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Representative Results
Nosso construto de repórter YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) contém um promotor SV-49 mínimo com 5 repetições do elemento de ligação CANônico TEAD (MCAT)15 que conduz o gene da luciferase de vagalume(Figura 1). É co-transfetado em células juntamente com o vetor de controle PRL-TK (Promega), que expressa a luciferase de Renilla do promotor HSV TK constitutivamente ativo(Figura 1). É fundamental garantir que a construção do repórter YAP/TAZ-TEAD esteja se comportando como esperado na linha celular que está sendo testada. Por isso, primeiro co-transfeccionamos os construções PRL-TK e pGL3-5xMCAT (SV)-49 em células A375 expressando firmemente um vetor de controle, um mutante altamente ativo insensível à LATS de YAP (YAP2SA),ou um mutante de YAP2SA incapaz de ligar TEADs (YAP2SA, S94A). Como esperado, a atividade da luciferase de vagalume foi significativamente aumentada pelo YAP2SA,mas não pelo vetor de controle ou pelo YAP2SA,S94A (Figura 2A). Isso sugere que o YAP aumenta a atividade do repórter YAP/TAZ-TEAD de forma dependente do TEAD. É importante ressaltar que o YAP2SA não alterou significativamente os níveis da luciferase de Renilla. Como controle adicional, também confirmamos que o YAP2SA não altera a atividade de um construto de promotor mínimo que não possui os elementos de ligação MCAT TEAD(Figura 2B).
Um segundo experimento de controle também foi feito no qual as células A375 foram infectadas com construtos virais que fornecem um shRNA de controle não direcionado (shNTC) ou um construto com shRNAs Tandem YAP e TAZ. Após a seleção estável, as células foram co-transfeccionadas com a construção PRL-TK e a construção de repórter YAP/TAZ-TEAD ou a construção mínima do promotor. Em células transcontaminadas com a construção de repórter YAP/TAZ-TEAD, o shRNA YAP/TAZ reduziu significativamente os níveis de luciferase de vagalume, mas o controle shNTC não (Figura 2C). Os níveis de luciferase de firefly não foram alterados nem pelo shNTC nem pelo shRNA YAP/TAZ em células transcontaminadas com o promotor mínimo(Figura 2C). Consistente com os resultados acima, o sinal renilla em cada poço também não foi significativamente alterado pelo controle shNTC ou pelo yap/TAZ shRNA(Figura 2C),indicando ainda que a construção de controle PRL-TK não responde a YAP ou TAZ. Coletivamente, esses experimentos mostram que o sistema de repórteres está se comportando como esperado em células A375, o que é consistente com estudos anteriores usando esses vetores2,14.
Como prova de experiência conceitual, examinamos uma pequena biblioteca lentiviral shRNA em células A375. Nossa biblioteca de testes continha shRNAs visando vários genes que foram mostrados anteriormente para regular a função YAP/TAZ em outros tipos de células. No entanto, o papel de vários desses genes na regulação de YAP e TAZ no melanoma é desconhecido. Nossa biblioteca incluiu genes necessários para a atividade YAP/TAZ, como RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4, e CCNE216,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38, e genes previstos para inibir a atividade YAP /TAZ, como CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR, e RB139,40,41,42,43,44, 45,,46,,47,,48,,49,,50,,51,,52,,53,,54. Como controles, incluímos um shRNA14de controle tandem/TAZ , um shRNA de controle não direcionado (shNTC) e um shRNA direcionado ao Src, que anteriormente mostramos que era necessário para a atividade máxima yap/TAZ em células A37514.
Os dados brutos e a análise para esta tela são mostrados na Tabela Suplementar 2. Vários shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 e shMAPK8-2) reduziram significativamente o sinal de luciferase de Renilla em relação ao sinal médio de Renilla para todos os poços, sugerindo que esses shRNAs estavam causando citotoxicidade nas células A375. De fato, esses poços tinham significativamente menos células no momento do ensaio (não mostrado). Isso torna muito difícil distinguir candidatos que podem regular o YAP/TAZ daqueles que são essenciais para a sobrevivência celular. Portanto, os resultados dessas amostras são excluídos da análise de dados posteriores. Como esperado, shRNAs direcionados yap e TAZ ou Src reduziram significativamente a atividade YAP/TAZ-TEAD(Figura 3). Consistente com o trabalho publicado mostrando que o PIK3CA promove a atividade YAP e TAZ21,26,31, descobrimos que shRNAs direcionados pik3CA reduziram os níveis de luciferase de vagalume normalizada. shRNAs que visam ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN aumentaram cada um dos níveis de luciferase de mosca-de-fogo normalizada, o que é consistente com estudos publicados mostrando que essas proteínas reprimem YAP e/ou TAZ39,,41,,42,,43,,45,46,47,48,50,51,53,54 . Apesar dos papéis estabelecidos para ATR, CCNE2 e ERBB4 em outros tipos de células27,,28,,35,,36,38,49, shRNAs direcionados a esses genes não alteraram significativamente os níveis normalizados de luciferase de vagalume em células A375. shRNAs direcionados ao EZH2 e RB1 mostraram um efeito sobre os níveis de luciferase de vagalume que era oposto ao esperado com base em estudos de outros tipos de células32,,34,40,52. Tanto o PTEN quanto o RAF1 foram alvo de dois shRNAs distintos que tiveram efeitos opostos na atividade da luciferase. Resultados inconsistentes com estudos anteriores podem indicar que a influência dessas proteínas na função YAP/TAZ-TEAD é dependente do tipo celular; no entanto, também pode ser devido à baixa eficiência de knockdown ou efeitos fora do alvo por alguns shRNAs. Como uma tela n = 1 "cega", alguns falsos positivos e falsos negativos também seriam esperados. Como discutido com mais detalhes na Discussão, experimentos adicionais de validação precisariam ser feitos usando outros ensaios, como qPCR para genes que são regulados pela YAP e TAZ e manchas ocidentais para modificações pós-translacionais que influenciam a função YAP/TAZ. Esta validação também incluiria a confirmação de quais shRNAs efetivamente derrubaram a proteína de interesse. Também é importante notar que, uma vez que nosso repórter é responsivo tead, qualquer gene identificado por nossa tela pode estar influenciando OS TEADs, mas não YAP e TAZ diretamente. Estudos mecanicistas de acompanhamento seriam necessários para determinar se era YAP e/ou TAZ ou os TEADs que a proteína identificada está regulando. No entanto, YAP e TAZ são os principais impulsionadores da transcrição mediada pelo TEAD, por isso é provável que a maioria desses genes esteja regulando yap e TAZ. De fato, como dito acima, a maioria das shRNAs que atingem na tela proteínas alvo que são conhecidas por regular yap e/ou TAZ diretamente.
Figura 1: Diagrama esquemático do fluxo de trabalho. As etapas críticas deste protocolo são resumidas com números de etapacorrespondentes aos números do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Otimização do sistema de repórter transcricional de dupla luciferase YAP/TAZ-TEAD. (A) Células A375 expressam firmemente o vetor de controle (MSCV-IRES-Hygro), YAP insensível ao LATS (YAP2SA),ou YAP insensível ao LATS incapaz de vincular TEADs (YAP2SA,S9 4A) foram co-transfeccionados com os construções PRL-TK (Renilla) e pGL3-5xMCAT (SV)-49 (yap/taz-tead repórter) e o sinal de luciferase foi medido 24 horas depois. n = 7 experimentos independentes. (B) As células A375 foram co-transfecidas com yap2SA ou vetor de controle, o construto PRL-TK, e o construto pGL3-5xMCAT (SV)-49 ou o construto pGL3 (SV)-49 (promotor mínimo) e o sinal de luciferase foi medido 24 horas depois. n = 1 experimento transffecido em quadruplicato. (C) As células A375 foram infectadas com a codificação de retrovírus de um shRNA (shNTC) ou shRNAs Tandem YAP e TAZ (shYAP/TAZ). Após a seleção estável, as células foram co-transfeccionadas com o construto PRL-TK e o construto pGL3-5xMCAT (SV)-49 ou o sinal de construção pGL3 (SV)-49 e a luciferase foram medidos 24 horas depois. n = 4 infecções independentes; A significância estatística foi determinada por meio de ANOVA unidirecional seguido do teste de múltiplas comparações de Tukey; n.s. = p>0,05, * p<0,05, ** p<0,01, **** p<0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados da tela representativa. O resultado de cada vetor knock down é comparado com shNTC e apresentado como diferença de dobra. O gráfico da barra mostra a média da luciferase de mosca-vaga/relação de luciferasede Renilla ± desvio padrão. n = 1 experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tubo A - Diluição de Transfecção | |
| Reagente | Volume |
| Tampão de transfecção | 25 μl por reação |
| Reagente de Transfecção 2 (adicionar segundo) | 1,5 μl por reação |
| Tubo B - Diluição de Repórter | |
| Reagente | Volume |
| Tampão de transfecção | 25 μl por reação |
| 20:1 Firefly luciferase reporter: control renilla mix (adicionar segundo) | 400 ng por reação |
| Reagente de Transfecção 3 (adicionar terceiro) | 1 μl por reação |
| Total: 26,5 μl por reação | |
Tabela 1: Preparação da mistura de transfecção. Para a transfecção em cada poço das placas de 24 poços, 1,5 μL de reagente de transfecção 2 é diluído em 25 μL de tampão de transfecção para produzir a diluição transfecção (tubo A); enquanto 400 ng de 20:1 firefly luciferase reporter: controlar a mistura renilla e 1 μL de reagente de transfecção 3 é diluído em 25 μL de Tampão de Transfecção para produzir a diluição do repórter (tubo B).
| Vetores existentes/comprados/presentes | |
| Vetor | Fonte |
| Vetores lentivirais humanos GIPZ shRNA | GE Healthcare |
| VSVG | Laboratório Hynes [2] |
| psPAX2 | Addgene (#12260) |
| gag/pol | Addgene (#14887) |
| pGL3-(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| pGL3-5xMCAT(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| PRL-TK | Promega |
| MSCV-IRES-Hygro | LABORATÓRIO LAMAR [2] |
| MSCV-YAP-S127A,S381A-IRES-Hygro | LABORATÓRIO LAMAR [2] |
| MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 | LABORATÓRIO LAMAR [14] |
| Novos Vetores | |
| Vetor | Espinha dorsal fonte |
| MSCV-YAP-S94A,S127A, S381A-IRES-Hygro | MSCV-IRES-Hygro |
Tabela suplementar 1: Tabela de vetores. Todos os vetores utilizados estão listados com novos vetores descritos. Técnicas padrão de biologia molecular foram usadas para gerar novos vetores.
Tabela suplementar 2: Análise dos dados do ensaio de luciferase. O arranjo da biblioteca shRNA é mostrado na primeira tabela. As segunda e terceira tabelas mostram os sinais brutos de vagalume e renilla luciferase, respectivamente. A média e o desvio padrão para o sinal de luciferase renilla para todos os poços estão indicados nas caixas amarelas. Poços com sinal de luciferase renilla mais de 1 desvio padrão abaixo da média são destacados com texto vermelho e excluídos de análises posteriores. A relaçãovagalume/Renilla de cada poço foi obtida dividindo o sinal de luciferase de mosca-do-fogo cru pelo sinal bruto de renilla luciferase (quarta tabela). A razãovagalume/Renilla de cada poço foi então normalizada para a média de taxas de vagalume/Renilla dos poços de controle (shNTC) (quinta tabela).Renilla Os poços duplicados foram mediados em seguida para cada construção e o desvio padrão foi calculado (sexta tabela). Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
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Discussion
Neste estudo, demonstramos uma abordagem para a triagem de média-duração de bibliotecas virais organizadas em combinação com um ensaio de repórter transcricional baseado em duas luciferases que pode ser usado para identificar e testar novos reguladores de fatores de transcrição. É fundamental caracterizar e otimizar o sistema de repórteres para cada linha celular antes de qualquer tela. Experimentos devem ser feitos para confirmar que o repórter está respondendo à atividade alterada do fator de transcrição que está sendo investigado e a magnitude da mudança na atividade deve ser testada em relação aos vetores de controle. A co-transfecção da construção PRL-TK juntamente com a construção do repórter é importante porque ajuda a controlar o número de células transcontaminadas com o repórter e o número de cópia da construção do repórter, ambos podem alterar a magnitude do sinal de luciferase. Os experimentos de otimização também devem garantir que o fator de transcrição não influencie a atividade da construção constitutiva de Renilla ou uma construção mínima de promotor, pois isso poderia complicar a interpretação dos resultados. Os controles a serem incluídos na biblioteca também devem ser cuidadosamente considerados. Este protocolo é projetado para uma "tela cega" de bibliotecas com centenas de shRNAs, onde não é viável confirmar um knockdown efetivo por cada shRNA. Portanto, alguns falsos positivos e negativos são prováveis. O aumento do número de réplicas técnicas e/ou biológicas na tela pode ajudar a reduzir o número de falsos positivos e negativos. No entanto, isso também aumentará significativamente o número de poços para a cultura e o ensaio deve ser tomado para garantir que isso não resulte em condições de cultura subótimas (veja abaixo). Outra abordagem para reduzir falsos positivos e negativos seria repetir toda a tela na mesma linha celular ou linhas celulares adicionais, ou tela rúnica de uma biblioteca menor, incluindo apenas os "hits" usando 3 réplicas biológicas. Em todos os casos, quaisquer acertos devem ser validados usando leituras além do repórter, como qPCR para genes alvo conhecidos. O knockdown efetivo do gene alvo também deve ser confirmado nestas etapas de validação. Não devem ser feitas conclusões sobre shRNAs que não alteram a atividade a menos que um knockdown efetivo pelo shRNA seja confirmado. Os experimentos de validação também devem garantir que o fator de transcrição que está sendo investigado seja o que é regulado pelos genes-alvo e que esses genes não influenciem os construtos de Renilla ou promotores mínimos.
Também é importante otimizar as condições de cultura celular para cada linha celular para evitar condições subótimas, como excesso de confluência, poucas células, baixa viabilidade celular ou capacidade proliferativa variável. A densidade de semeadeamento celular é particularmente importante no momento da transfecção da construção de repórter de dupla luciferase (Passo 5) e quando a atividade do repórter é medida (Passo 6). A eficiência da transfecção pode variar significativamente com a densidade celular e a baixa eficiência da transfecção pode resultar em resultados anômalos se apenas uma pequena fração da população celular estiver sendo pesquisada. A maioria das linhas celulares testadas mostram a maior eficiência de transfecção quando em 40 - 60% de confluência, mas recomenda-se que as condições de transfecção e densidade de semeação sejam otimizadas para uma determinada linha celular usando um vetor que fornece uma proteína fluorescente. Linhas celulares difíceis de infectar e/ou transfect, como células primárias, podem não ser adequadas para esta tela. A má eficiência da transfecção do repórter ou a má viabilidade celular normalmente resultam em um sinal de luciferase renilla muito baixo. No entanto, um experimento piloto deve ser realizado para determinar o alcance do sinal de luciferase de Renilla para uma linha celular. É importante que o título do vírus produzido a partir da biblioteca de conjuntos seja alto o suficiente para dar uma eficiência de infecção de pelo menos 30% na linha celular que está sendo avaliada. A eficiência da infecção pode variar muito e vários fatores podem influenciar o título viral. A quantidade de sobrenadante viral utilizada deve ser otimizada para cada linha celular e, se necessário, o Passo 2 pode ser otimizado ainda mais para melhorar os títulos virais.
A densidade celular e a viabilidade celular também podem influenciar a atividade das vias celulares que regulam os fatores de transcrição, por isso é fundamental semear as células para a transfecção do repórter para que todas estejam todas em uma densidade semelhante no dia em que o ensaio de dupla luciferase é lido (Passo 6). Também é importante garantir que as células aderam uniformemente através do poço em vez de agrupar-se em um remendo denso no centro. Como descrito acima, uma variação significativa no sinal de luciferase de Renilla de bem a bem pode resultar em dados difíceis de interpretar. É melhor excluir poços que mostram uma redução significativa no sinal de luciferase renilla quando comparado a todos os outros poços, pois isso sugere que ou o vetor viral está reduzindo a viabilidade celular ou a eficiência de transfecção para esse poço foi muito baixa. Aqui excluímos poços maiores que 1 desvio padrão do sinal médio de luciferase renilla, mas experimentos de otimização devem ser feitos para determinar cortes apropriados para cada linha celular. Também é possível que shRNAs que reduzam a viabilidade celular possam estar fazendo isso alterando a atividade do fator de transcrição sendo ensaio. Se isso for uma preocupação, shRNAs que reduzem o sinal de luciferase renilla podem ser re-testados usando shRNAs indutíveis ou outros ensaios. Também é fundamental limitar a quantidade de tempo que as células aderentes estão em suspensão após a experimentação. Use uma pipeta multicanal para a maioria das etapas durante a tripsinização e semeação de células, e para telas maiores, trabalhe com as placas em lotes. Além disso, é melhor limitar o tempo entre a infecção das células e o ensaio do repórter. Isso é particularmente importante se o fator de transcrição que está sendo ensaio regula a proliferação celular ou a sobrevivência. Neste caso, as células com knockdown eficaz seriam superadas por células com knockdown menos eficiente.
Várias modificações do protocolo descrito são viáveis. Essa abordagem pode ser usada efetivamente para identificar reguladores de qualquer fator de transcrição se um repórter baseado em luciferase for gerado, e para muitos dos fatores de transcrição mais comuns que o repórter constrói já existem. Este protocolo pode ser modificado para o uso de uma ampla variedade de bibliotecas disponíveis comercialmente ou montadas manualmente, incluindo RNAi, CRISPR/CAS9, ORF ou cDNA. Na verdade, anteriormente usamos uma estratégia semelhante para testar uma pequena biblioteca de cDNA para reguladores YAP/TAZ14. Bibliotecas podem ser entregues usando retrovírus, lentivírus, adenovírus ou transfecção transitória. A proteína do casaco viral usada aqui (VSVG) gera lentivírus que é humano-infeccioso. Se as células roedores estão sendo usadas e o vírus ecotrópico infeccioso não humano é desejado, um vetor que fornece a proteína eco coat pode ser usado em vez de VSVG.
Outros métodos podem ser usados para tela de bibliotecas para reguladores de um fator de transcrição. O acesso a uma instalação de triagem de alto prazo permitiria a triagem de bibliotecas muito maiores de forma automatizada. Da mesma forma, as telas de genoma podem ser feitas usando bibliotecas agrupadas com sequenciamento profundo como um meio de identificar os "hits". No entanto, ambas essas abordagens exigem equipamentos que não são acessíveis a muitos pesquisadores, e as taxas para triagem de alto desempenho ou sequenciamento profundo podem ser proibitivamente altas. Além disso, telas agrupadas exigiriam a triagem de células usando um repórter fluorescente ou outra maneira de enriquecer as células que mostram as mudanças desejadas na atividade transcricional. A triagem de grandes bibliotecas de expressão de grande porte usando um ensaio de repórter transcricional baseado em duas luciferases foi demonstrada anteriormente usando um robô benchtop55, mas isso não é comumente disponível para todos os pesquisadores. Em contraste, o método descrito aqui é rápido, médio-throughput, relativamente barato, e usa equipamentos e reagentes que provavelmente são acessíveis à maioria dos investigadores. Este método pode revelar vários reguladores em um único experimento, que é uma maneira econômica e conveniente de descobrir possíveis caminhos regulatórios a montante de um fator de transcrição.
Na abordagem descrita, os genes dos candidatos foram derrubados e, após a seleção, os construtos do repórter foram transfecentes transitoriamente nas células. No entanto, a eficiência da transfecção é pobre em muitas linhas celulares e pode introduzir variabilidade e causar toxicidade celular. Uma abordagem alternativa melhorada seria integrar o repórter no genoma da linha de interesse celular e, em seguida, infectar as células expressas por repórteres com as bibliotecas virais para triagem. Essa melhoria reduziria a variabilidade introduzida pela transfecção transitória e evitaria possíveis alterações na atividade do fator de transcrição devido à cultura pós-infecção prolongada. Como mencionado acima, o uso de um pequeno robô benchtop agilizaria muito o processo e aumentaria o tamanho das bibliotecas que poderiam ser exibidas. Outra alteração considerável é o uso de bibliotecas de vetores indutores, o que reduziria a probabilidade de seleção contra células com knockdown mais eficaz e reduziria a variabilidade causada por mudanças na viabilidade celular.
Um desafio significativo que impede o tratamento efetivo de muitos cânceres é que as células tumorais adquirem resistência até mesmo às terapias-alvo mais eficazes. A identificação das proteínas necessárias para essa resistência terapêutica é necessária para melhorar o desfecho do paciente. A abordagem descrita poderia ser facilmente usada em combinação com terapêuticas direcionadas para revelar genes que causam maior sensibilidade ou resistência a esses compostos. Outra aplicação futura potencial dessa abordagem seria usar essa triagem organizada para testar alvos terapêuticos candidatos em combinação. Para isso, as células seriam infectadas com dois vetores virais cada um com o objetivo de identificar proteínas que tenham um efeito sinérgico na atividade do fator de transcrição.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Emily Norton e Mikaelan Cucciarre-Stuligross por ajudarna preparação de vetores shRNA. Este trabalho foi apoiado em parte por uma Susan G. Komen Career Catalyst Grant que concedeu a J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin - 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin - 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone - powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA - 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol - 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum - 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine - 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water - 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl - powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin - 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract - powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
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