Summary
For at identificere nye regulatorer af transskription faktorer, vi udviklet en tilgang til at screene arrayed lentiviral eller retroviral RNAi biblioteker ved hjælp af en dual-luciferase-baserede transskriptions-reporter assay. Denne tilgang tilbyder en hurtig og relativt billig måde at screene hundredvis af kandidater i et enkelt eksperiment.
Abstract
Transskription faktorer kan ændre udtrykket af mange mål gener, der påvirker en række downstream processer gør dem gode mål for anti-cancer behandlinger. Men, direkte målretning transskription faktorer er ofte vanskeligt og kan forårsage bivirkninger, hvis transskription faktor er nødvendig i en eller flere voksne væv. Identifikation upstream regulatorer, der afvigende aktivere transskription faktorer i kræftceller tilbyder et mere realistisk alternativ, især hvis disse proteiner er nemme at narkotika. Her beskriver vi en protokol, der kan bruges til at kombinere arrayed medium-skala lentiviral biblioteker og en dual-luciferase-baserede transskriptions-reporter assay at identificere nye regulatorer af transskription faktorer i kræftceller. Vores tilgang tilbyder en hurtig, nem og billig måde at teste hundredvis af gener på i et enkelt eksperiment. For at demonstrere brugen af denne tilgang, udførte vi en skærm af en arrayed lentiviral RNAi bibliotek, der indeholder flere regulatorer af Ja-associeret protein (YAP) og transskriptionelle co-aktivator med PDZ-bindende motiv (TAZ), to transskriptionelle co-aktivatorer, der er downstream effektorer af Hippo pathway. Denne fremgangsmåde kan dog ændres til at screene for regulatorer af stort set alle transskriptionsfaktorer eller co-faktor og kan også bruges til at screene CRISPR/CAS9-, cDNA- eller ORF-biblioteker.
Introduction
Formålet med denne analyse er at bruge viralbiblioteker til at identificere regulatorer af transskriptionsfaktorer på en relativt hurtig og billig måde. Afvigende transskriptionsaktivitet er forbundet med kræft og metastase1,,2,3,4,5,6, så målretning transskription faktorer i kræftceller er en lovende terapeutisk tilgang. Transskriptionsfaktorer er imidlertid ofte vanskelige at målrette farmakologisk7 , og mange er nødvendige for normal cellefunktion i voksent væv8,9,10. Målretning af kræft-associerede veje, der afvigende aktivere transskription faktorer til at drive sygdom er en mere realistisk tilgang med potentiale til at have mindre alvorlige bivirkninger. Den kommercielle tilgængelighed af arrayed lentivirale og retrovirale RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA eller ORF biblioteker giver forskerne mulighed for at teste betydningen af mange gener i et enkelt eksperiment. Der kræves dog en pålidelig udlæsning for ændret transskriptionsaktivitet.
Her beskriver vi brugen af en dobbelt-luciferase-baserede transskriptionel reporter assay og arrayed lentiviral biblioteker til at identificere proteiner, der regulerer transskription faktorer i kræftceller. I denne analyse, shRNAs at målrette kræft-associerede gener leveres til pattedyr kræftceller via lentiviral transduktion og celler er udvalgt til stabil integration ved hjælp af puromycin. Cellerne er næste transfected med en reporter konstruktion, der udtrykker firefly luciferase drevet af en promotor specifikt til transskription faktor, der er ved at blive undersøgt, og en kontrol konstruktion, der udtrykker Renilla luciferase fra en konstituerende aktiv promotor, der ikke er lydhør ekonnert over for transskription faktor, der undersøges. Vi demonstrerer denne tilgang med en proof-of-concept skærm for lovgivere af YAP og TAZ, de kritiske downstream effektorer af Hippo pathway8,10,11. Unormal aktivitet af YAP og TAZ fremmer flere trin i den metastatiske kaskade11 og er observeret i mange kræftformer11,12,13. Men, hvordan YAP og TAZ bliver afvigende aktiveret i nogle kræftceller er endnu ikke fuldt forstået. YAP og TAZ binder ikke DNA, men rekrutteres i stedet til initiativtagere af andre transskriptionsfaktorer. Medlemmer af TEA domæne (TEAD) familie af transskription faktorer er de vigtigste bindende partnere for YAP og TAZ, og er afgørende for de fleste YAP og TAZ-afhængige funktioner. Vores reporter konstruere udtrykker firefly luciferase fra en YAP / TAZ-TEAD-lydhør promotor og tidligere undersøgelser har vist, at det trofast registrerer ændringer i YAP-TEAD og TAZ-TEAD transskriptionelle aktivitet2,14,15.
Vores tilgang er hurtig, medium-throughput, og kræver ikke screening faciliteter, automatiserede robotter, eller dyb sekventering af pooled biblioteker. Omkostningerne er relativt lave, og der er mange kommercielt tilgængelige biblioteker at vælge imellem. Det nødvendige udstyr og de nødvendige reagenser er også relativt standard i de fleste laboratorier. Det kan bruges til at screene for lovgivere af stort set enhver transskription faktor, hvis en luciferase-baserede reporter eksisterer eller genereres. Vi bruger denne tilgang til at screene shRNAs i kræftceller, men enhver celle linje, der kan transfected med rimelig effektivitet kunne bruges med enhver form for arrayed bibliotek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Et skematisk resumé af denne protokol er vist i figur 1.
1. Lentiviral vektor bibliotek forberedelse
BEMÆRK: Den demonstrerede skærm brugte et arrayed shRNA bibliotek købt som glycerol lagre i 96-brønd plader, men biblioteker kan også samles manuelt baseret på en liste over kandidater. Passende kontroller bør overvejes og indgå i ethvert bibliotek. Dette omfatter en ikke-målretning kontrol shRNA (shNTC), en kontrol shRNA rettet mod transskription faktor, der undersøges, og hvis det er muligt, en shRNA rettet mod firefly luciferase.
- Der tilsættes 1,3 ml Luria Bouillon (LB) (1% bacto-trypton, 0,5% gærekstrakt, 1% NaCl, pH 7,5) indeholdende 100 μg/ml ampicillin til hver brønd af en 96-brønd dyb brøndplade. Inokulerhver brønd med 2 μL glycerologog og voksved 37 °C natten over med konstant omrøring ved 225 omdrejninger i minuttet.
- Hver bakteriekultur overføres til et 1,5 ml centrifugerør, og bakterierne pelleteres ved centrifugering ved 21.000 x g ved 4 °C i 10 min.
- Rens hver vektor ved hjælp af en bakteriel mini-prep kit ved at følge producentens protokol.
- Koncentrationen af hver vektor bestemmes ved hjælp af et spektrofotometer.
- Plasmiderne opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her.
2. Emballering af det fremsaettende lentivirale bibliotek
BEMÆRK: Alt arbejde, der involverer lentivirus, herunder emballage, infektion og efterfølgende dyrkning af inficerede celler, bør nøje følge de institutionelle biosikkerhedsregler og -bestemmelser.
- Udvid 293FT-cellerne ved hjælp af komplette vækstmedier (Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM), der indeholder 4 mM L-glutamin, 4.500 mg/l glukose og natriumpyruvat, suppleret med 10% føtal kvægserum (FBS), 100 enheder/ml penicillin, 100 μg/mL streptomycin og antibiotikum og 2 mM L-glutamin).
- For hver vektor i biblioteket fra trin 1.4, frø en 24-brønd med 1 x 105 293FT celler.
BEMÆRK: Det anbefales, at nogle ekstra brønde af en kontrol viral vektor pakkes og bruges til at teste titer af virus før du fortsætter til trin 3 (se nedenfor). - Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer.
BEMÆRK: En generel protokol for emballage lentivirus, der blev beskrevet tidligere14 er blevet skaleret ned til 24 brønde for denne protokol. Det bruger psPAX2 for lentiviral emballage og VSVG som et pels protein. Hvis ectropic virus ønskes, en vektor leverer Eco kan bruges i stedet for VSVG. Det anbefales stærkt, at denne protokol er optimeret til at opnå en viral titer, der giver mellem 30% -70% infektion effektivitet af målcellerne (se Diskussion). Se Supplerende tabel 1 for at se en liste over alle anvendte vektorer. - Der skal oprettes en transfektionsblanding for hver virusvektor fra trin 1.4 som beskrevet nedenfor. Hver transfektion skal indeholde 250 ng af den virale vektor, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1,25 μL transfektionsreagens 1 og 23,75 μL transfektionsbuffer (se Materialetabel).
- Hver lentiviral vektor fortyndes til 50 ng/μL med nuklelefrit vand, og overfør derefter 5 μL (250 ng) til en brønd af en 96-brønd PCR plade.
- Gør transfection super mix ved at blande 1,25 μL * X af transfektionreagens 1 og 23,75 μL * X af forvarmet transfektion buffer, hvor "X" er det samlede antal transfections plus flere ekstra for at tage højde for volumen tab under pipettering.
- Inkuber transfection super mix ved stuetemperatur i 5 min.
- Tilføj 125 ng * X af psPAX2 og 125 ng * X af VSVG til røret af transfection super mix fra Trin 2.4.3 og forsigtigt pipet op og ned for at blande. Fortsæt hurtigt til trin 2.4.5.
- Straks aliquot blandingen fra trin 2.4.4 i hvert rør af en PCR strimmel, og derefter bruge multi-kanal pipette til at overføre 25 μL blandingen i hver godt indeholdende viral vektor fra trin 2.4.1.
- Inkuber ved stuetemperatur i 20 min.
- Alle 30 μLs overføres fra hver 96 brønd fra trin 2.4.6 til en brønd af de 24 brønd, der indeholder 293 FT-celler fra trin 2.3.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer, og udskift derefter mediet i alle brønden af 24-brøndpladen med 500 μL frisk komplet vækstmedie. Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i yderligere 24 timer.
- Ved hjælp af en multi-kanal pipette, indsamle viral supernatant fra hver brønd og aliquot 220 μL (nok til 1 infektion i trin 3 plus nogle ekstra volumen) i to 96-brønde hver. Det er de arrayed virale supernatant plader.
- De arrayed virale supernatantplader opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her. Det anbefales også at teste nogle af de ekstra kontrol virus, der blev pakket (se ovenfor) på de celler, der skal inficeres, før du fortsætter til trin 3. Dette er for at sikre, at titer er tilstrækkelig til at opnå mindst 30% infektion effektivitet.
3. Infektion af cellerne til skærmen
BEMÆRK: Humane melanomceller (A375) blev brugt til at demonstrere denne fremgangsmåde, men denne metode kan anvendes på alle tilførte celler, der inficerer med lentivirus. Cellekultur og pletteringsbetingelser skal dog optimeres for hver cellelinje (se Diskussion).
- Udvid cellerne til at blive inficeret i komplet vækst medier.
- Frø 24-brøndplader med 1 x 105 celler i 0,5 ml komplet vækstmedier pr. brønd. Frø en brønd for hver viral vektor, der skal testes (herunder kontrol) og omfatter en ekstra brønd, der ikke vil blive smittet, som vil tjene som en kontrol for udvælgelse af lægemidler i trin 3.7.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer.
- Inficere hver brønd fra trin 3.2 med en anden viral supernatant fra den frosne arrayed lentiviral supernatant som følger.
- Forbered komplette vækstmedier, der indeholder 20 μg/ml polybrene.
- Tø de arrayed lentiviral bibliotek supernatants fra trin 2,7 til stuetemperatur.
- Sug vækstmediet fra 24-brøndspladerne fra trin 3.2 og tilsættes straks 200 μL polybreneholdige vækstmedier til hver brønd.
- Ved hjælp af en multikanalpipette overføres 200 μL viral supernatant fra hver 96-brønd fra trin 3.4.2 til de 24 brønde fra trin 3.4.3.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 24 - 48 timer.
BEMÆRK: Nogle cellelinjer kan kræve længere end 24 timer for at udtrykke shRNA'erne og blive puromycinresistente. Den virale vektor, der anvendes her, leverer en Turbo-GFP-IRES-puroR med et miR30-baseret shRNA i 3'UTR af puroR (Figur 1). Infektionseffektiviteten og ekspressionen af puromycinresistensgenet og shRNA blev overvåget af grønt fluorescerende protein. - Forbered komplette vækstmedier, der indeholder 2,5 μg/mL puromycin.
BEMÆRK: Udvælgelseskoncentrationen af puromycin varierer mellem cellelinjerne. Det anbefales, at der udføres en antibiotisk drabskurve for hver cellelinje, der skal assayes før skærmen. - Aspirat medierne fra hver brønd og erstatte med 500 μL puromycin-holdige komplet vækst medier.
BEMÆRK: Sørg for også at tilføje puromycin til en kontrol ikke-inficeret brønd, der kan bruges i efterfølgende trin for at sikre puromycin udvælgelse er færdig. - Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 48 timer.
BEMÆRK: Det er bedst at vælge i 48 timer, så pletteringtæthed og viral titer skal optimeres, så cellerne ikke er overkontiende før 48 timer. - Sørg for, at de inficerede celler er grønne under det fluorescerende mikroskop, og at celler på en kontrol, der ikke er inficeret med puromycin, alle er døde, før de fortsætter til trin 4.
4. Seeding celler til transfection af dual-luciferase reporter
BEMÆRK: Der skal foretages en testtransfektion for at bestemme den optimale såtæthed for hver ny cellelinje.
- Trypsinize hver brønd fra trin 3.9 og overføre omkring 1 x 105 celler i brønde på den tilsvarende position på den nye 24-brønd plade som følger.
BEMÆRK: Denne protokol er designet til screening af biblioteker med hundredvis af shRNAs, så det er ikke muligt at tælle alle brønden af inficerede celler. Derfor blev nedenstående trin brugt til at estimere celletal i hver brønd for at sikre nogenlunde lige belægningstæthed.- Gruppér brøndene fra trin 3.9 til 3- 4 grupper, således at alle brønde i en gruppe har en lignende celletæthed.
- Trypsinize 1 repræsentativ tet fra hver gruppe med 200 μL trypsin-EDTA (1x PBS suppleret med 0,5 mM EDTA og 0,1% trypsin) i 5 min ved 37 °C. Neutralisere derefter trypsin-EDTA ved at tilføje 400 μL puromycin indeholdende komplette vækstmedier.
- Tæl hver repræsentant godt for at bestemme det samlede celletal og fortynde cellesuspensionen fra hver repræsentant godt til 2 x 105 celler/ml ved hjælp af komplette vækstmedier.
- Frø 0,5 ml (1 x 105 celler) af hver brønd fra trin 4.1.3 til den tilsvarende position på en ny 24-brøndplade og inkuberer denne nye 24-brøndsplade ved 37 °C med 5% CO2 for 24 timer.
- For hver gruppe fra trin 4.1.1 skal du bruge det samlede celletal, der er bestemt i trin 4.1.3, til at beregne mængden af trypsin-EDTA, der skal føjes til hver brønd, så den resulterende cellesuspension bliver 1 x 106 celler/ml.
- Der tilsættes det passende volumen af trypsin-EDTA til hver brønd og inkuberes i 5 min ved 37 °C.
BEMÆRK: For større skærm anbefales det, at de 24-brøndplader prøves og replateres i grupper i stedet for alle på én gang for at sikre cellernes levedygtighed. - Under ovenstående inkubation anvendes en multikanalpipette til at tilsætte 400 μL puromycinholdige komplette vækstmedier til de tilsvarende brønde på en ny 24-brøndplade.
- 100 μL cellesuspension (ca. 1 x 105 celler) overføres fra hver brønd til den tilsvarende position på de nye 24-brøndplader, der er fremstillet i trin 4.1.7.
- Trin 4.1.6 til 4.1.8 gentages for alle plader af grupperede brønde fra trin 4.1.1, én plade ad gangen.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer.
5. Transfection af dobbelt-luciferase reporter
- Transfect hver brønd fra trin 4.2 med dual-luciferase reporter konstruerer som følger.
BEMÆRK: Den samlede mængde DNA og det optimale forhold mellem firefly luciferase reporter vektor til at kontrollere Renilla luciferase vektor bør bestemmes, før du starter denne analyse. Her blev 400 ng af en DNA-blanding, der indeholder 20 dele firefly luciferase reporter og 1 del kontrol Renilla luciferase brugt.- Fortyndingsblandingen (rør A) og reporterfortyndingsblandingen (rør B) fremstilles ved at blande de angivne mængder af hvert reagens (tabel 1) ganget med det samlede antal transfekt (plus flere ekstra).
BEMÆRK: Denne protokol er optimeret til transfektionsreagens 2 (se Materialetabel). Hvis der anvendes et andet transfektionsreagens, skal transfektionen optimeres før dette trin. - Transfektionsblandingen (rør A) blandes med reporterfortyndingsblandingen (rør B) og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter for at frembringe transfektionsblanding.
- Under ovenstående inkubation skylles hver 24 brønd fra trin 4.2 med 0,25 ml fosfatbuffersaltvand (PBS) og der tilsættes 447 μL komplet vækstmedie til hver brønd.
- Efter 15 min inkubation, bruge en multi-kanal pipette til at distribuere 53 μL af transfektion mix til hver brønd af 24-brønd plader.
- Fortyndingsblandingen (rør A) og reporterfortyndingsblandingen (rør B) fremstilles ved at blande de angivne mængder af hvert reagens (tabel 1) ganget med det samlede antal transfekt (plus flere ekstra).
- Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 24 timer.
6. Kvantificering af dobbeltluciferase-aktivitet
- Mål luciferase aktivitet ved hjælp af en pladelæser og en dual-luciferase reporter assay kit som beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Denne protokol er optimeret til det angivne reporteranalysesæt (se Materialetabel)og følger producentens anbefalede protokol.- Forbered nok 1x passiv lysis buffer til alle brønde plus flere ekstra (75 μL er nødvendig pr. brønd) ved at fortynde 5x passiv lysis buffer (leveres i kit) 1 til 5 med deioniseret vand. Tø reagens A og reagens B Buffer (leveres i kit, 100 μL af hver er nødvendig for hver brønd).
- Aspirate medierne fra hver brønd af 24-brønden plade fra trin 5.2.
- Der tilsættes 75 μL 1x passiv lysisbuffer til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter ved lejlighedsvis omrystning.
- Reagens B fremstilles ved at fortynde 50x reagens B-substrat (leveres i kit) 1:50 med optøet reagens B buffer.
- Der tilsættes 30 μL 1x passiv lysisbuffer til 4 brønde til afblænding (se supplerende tabel 2).
- 30 μL lysat fra trin 6.1.3 overføres til toeksemplarer af en 96-brønd flad bundhvid analyseplade.
- Brug en multikanalpipette til at tilsætte 50 μL reagens A til hver brønd og aflæse ildfluenluciferasesignalet med en pladelæser.
- Brug en multikanalpipette til at tilsætte 50 μL reagens B fra trin 6.1.4 til hver brønd og aflæs Renilla luciferase-signalet med en pladelæser.
- Behandl rådata på følgende måde (for en detaljeret beskrivelse finder du i Supplerende tabel 2).
- Ekskluder prøver med meget lavt Renilla luciferasesignal, da lave værdier indikerer, at den virale konstruktion var giftig, eller at der blev assayret for få transfected celler.
BEMÆRK: Som forklaret i diskussionen, betydeligt "lav" Renilla luciferase signal kan resultere i unormale resultater. Her blev brønde, hvor Renilla luciferase-signalet var mere end 1 standardafvigelse under middelværdien, udelukket (se supplerende tabel 2). Dette var baseret på tidligere undersøgelser udført ved hjælp af denne reporter system i disse celler14, men kan variere i andre cellelinjer. - Normalisere den rå firefly luciferase værdi af hver brønd til den rå Renilla luciferase værdi af samme brønd for at opnå firefly /Renilla forholdet.
- Gennemsnit firefly /Renilla nøgletal for alle replikere kontrol brønde og derefter opdele firefly /Renilla forholdet mellem hver anden godt med dette nummer for at få en fold forandring.
- Kontroller kontrolprøven tildel ogRenilla sæt dens firefly/Renilla-forholdsværdi til 1.
- Gennemsnit firefly /Renilla nøgletal af de dublerede brønde og plot med standardafvigelsen.
BEMÆRK: Standardafvigelsen anvendes ikke til statistisk analyse, men i stedet som et middel til at identificere brønde, hvor replikaterne afviger betydeligt.
- Ekskluder prøver med meget lavt Renilla luciferasesignal, da lave værdier indikerer, at den virale konstruktion var giftig, eller at der blev assayret for få transfected celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores YAP / TAZ-TEAD reporter konstruktion (pGL3-5xMCAT (SV)-492,,14,,15) indeholder en minimal SV-49 promotor med 5 gentagelser af kanoniske TEAD bindende element (MCAT)15 køre firefly luciferase genet ( Figur1). Det er co-transficeret i celler sammen med PRL-TK kontrol vektor (Promega), som udtrykker Renilla luciferase fra konstituerende aktive HSV TK promotor (Figur 1). Det er afgørende at sikre, at YAP/TAZ-TEAD reporterkonstruktionen opfører sig som forventet i den eller de cellelinje(r), der testes. Derfor har vi først co-transficeret PRL-TK og pGL3-5xMCAT (SV)-49 konstruktioner i A375 celler stabilt udtrykke enten en kontrol vektor, en meget aktiv LATS-ufølsom mutant af YAP (YAP2SA), eller en mutant af YAP2SA ude af stand til at binde TEADs (YAP2SA, S94A). Som forventet blev firefly luciferase-aktiviteten signifikant forøget med YAP2SA, men ikke kontrolvektoren eller YAP2SA, S94A (Figur 2A). Dette tyder på, at YAP øger aktiviteten af YAP / TAZ-TEAD reporter i en TEAD-afhængig måde. Vigtigt er det, YAP2SA ikke væsentligt ændre niveauet af Renilla luciferase. Som en ekstra kontrol bekræftede vi også, at YAP2SA ikke ændrer aktiviteten af en minimal promotor konstruktion, der mangler MCAT TEAD bindende elementer (Figur 2B).
Et andet kontroleksperiment blev også udført, hvor A375-celler blev inficeret med virale konstruktioner, der enten leverer en ikke-rettet kontrol shRNA (shNTC) eller en konstruktion med tandem YAP og TAZ shRNAs. Efter en stabil udvælgelse blev cellerne co-transfected med PRL-TK konstruktionen og enten YAP/TAZ-TEAD reporter konstruktionen eller den minimale promotorkonstruktion. I celler transfected med YAP/TAZ-TEAD reporter konstruktion, YAP / TAZ shRNA væsentligt reduceret firefly luciferase niveauer, men kontrol shNTC ikke (Figur 2C). Firefly luciferase niveauer blev ikke ændret ved hverken shNTC eller YAP / TAZ shRNA i celler transfected med den minimale promotor (Figur 2C). I overensstemmelse med ovenstående resultater blev Renilla-signalet i hver brønd heller ikke væsentligt ændret af kontrolshNTC eller YAP/TAZ shRNA (figur 2C), hvilket yderligere indikerer, at PRL-TK-kontrolkonstruktionen ikke reagerer på YAP eller TAZ. Samlet set viser disse eksperimenter, at reportersystemet opfører sig som forventet i A375-celler, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser ved hjælp af disse vektorer2,14.
Som et proof of concept eksperiment screenede vi et lille lentiviralshRNA-bibliotek i A375-celler. Vores test bibliotek indeholdt shRNAs rettet mod flere gener, der tidligere blev vist sig at regulere YAP / TAZ funktion i andre celletyper. Men, rolle flere af disse gener i reguleringen af YAP og TAZ i melanom er ukendt. Vores bibliotek omfattede gener, der kræves for YAP / TAZ aktivitet, såsom RAF1, MDM2, PIK3CA, MAPK8, PAK4, EZH2, PDK1, ERBB4, og CCNE216,17,18,19,20,,21,,22,23,24,25,26,27,28,2929, 30,31,32,33,34,35,36,37,38og gener, der forventes at hæmme YAP/TAZ-aktiviteten, såsom CSK, ERBB2, ATM, CDH1, Gelsolin (GSN), PTEN, ATR og RB139,40,41,42,43,44, 45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. Som kontrol inkluderede vi en tandem YAP/TAZ shRNA14,en ikke-målrettet kontrol shRNA (shNTC) og en shRNA-målretning Src, som vi tidligere viste var nødvendig for maksimal YAP/TAZ aktivitet i A375 celler14.
De rådata og analyser for denne skærm er vist i supplerende tabel 2. Flere shRNAs (shPDK-1, shMDM2-1, shMDM2-2, shPAK4, shMAPK8-1 og shMAPK8-2) reduceret Renilla luciferase signal i forhold til den gennemsnitlige Renilla signal for alle brønde, hvilket tyder på, at disse shRNAs var årsag cytotoksicitet i A375 celler. Faktisk disse brønde havde betydeligt færre celler på tidspunktet for analysen (ikke vist). Dette gør det meget vanskeligt at skelne kandidater, der kan regulere YAP / TAZ fra dem, der er afgørende for celle overlevelse. Resultaterne fra disse stikprøver er derfor udelukket fra yderligere dataanalyse. Som forventet reducerede shRNAs rettet mod YAP og TAZ eller Src yap/TAZ-TEAD-aktiviteten betydeligt (figur 3). I overensstemmelse med offentliggjorte arbejde, der viser, at PIK3CA fremmer YAP og TAZ aktivitet21,,26,31, fandt vi, at shRNAs målretning PIK3CA reduceret normaliseret firefly luciferase niveauer. shRNAs målretning ATM, CDH1, CSK, ERBB2, GSN hver øget normaliseret firefly luciferase niveauer, hvilket er i overensstemmelse med offentliggjorte undersøgelser, der viser, at disse proteiner undertrykke YAP og / eller TAZ39,41,42,43,45,46,47,48,50,51,53,54 . Trods etablerede roller for ATR, CCNE2, og ERBB4 i andre celletyper27,28,35,36,38,49, shRNAs rettet mod disse gener ikke væsentligt ændre normaliseret firefly luciferase niveauer i A375 celler. shRNAs, der var rettet mod EZH2 og RB1 , viste en effekt på niveauet for ildflueluciferase , som var modsat det forventede baseret på undersøgelser i andre celletyper32,34,40,52. Både PTEN og RAF1 blev ramt af to forskellige shRNA'er, som havde modsatrettede virkninger på luciferaseaktiviteten. Resultater, der ikke var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, kunne indikere, at disse proteiners indflydelse på YAP/TAZ-TEAD-funktionen er celletypeafhængig; Men, Det kan også skyldes dårlig knockdown effektivitet eller off-target effekter af nogle shRNAs. Som en n = 1 "blind" skærm, nogle falske positiver og falske negativer ville også forventes. Som diskuteret mere detaljeret i diskussionen, yderligere validering eksperimenter vil skulle gøres ved hjælp af andre analyser såsom qPCR for gener, der er reguleret af YAP og TAZ og vestlige blots for post translationelle ændringer, der påvirker YAP / TAZ funktion. Denne validering vil også omfatte bekræftelse af, hvilke shRNAs effektivt slået ned protein af interesse. Det er også vigtigt at bemærke, at da vores reporter er TEAD lydhør, eventuelle gener identificeret af vores skærm kunne påvirke TEADs, men ikke YAP og TAZ direkte. Opfølgende mekanistiske undersøgelser vil være nødvendige for at afgøre, om det var YAP og / eller TAZ eller TEADs, at det identificerede protein regulerer. Men, YAP og TAZ er de vigtigste drivkræfter for TEAD-medieret transskription, så det er sandsynligt, at de fleste af disse gener regulerer YAP og TAZ. Faktisk, som nævnt ovenfor, de fleste af de shRNAs, der ramte i skærmen mål proteiner, der er kendt for at regulere YAP og / eller TAZ direkte.
Figur 1: Skemadiagram over arbejdsprocessen. De kritiske trin i denne protokol er opsummeret med trinnumre, der svarer til tallene i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Optimering af YAP/TAZ-TEAD dual-luciferase transskriptionel reporter system. (A) A375 celler stabilt udtrykker kontrol vektor (MSCV-IRES-Hygro), LATS-ufølsom YAP (YAP2SA),eller LATS-ufølsom YAP ude af stand til at binde TEADs (YAP2SA, S94A) blev co-transfemected med PRL-TK (Renilla) og pGL3-5xMCAT (SV)-49 (YAP/ TAZ-TEAD reporter) konstruktioner og luciferase signal blev målt 24 timer senere. n = 7 uafhængige forsøg. (B) A375-cellerne blev co-transficeret med enten YAP2SA eller kontrolvektor, PRL-TK-konstruktionen og enten pGL3-5xMCAT (SV)-49-konstruktionen eller pGL3-konstruktionen (SV)-49-konstruktionen (minimal promotor) og luciferase-signalet blev målt 24 timer senere. n = 1 forsøg transfemeret i firdoblet. (C) A375-celler var inficeret med retrovirus, der koder for et ikke-målkontrolshRNA (shNTC) eller tandem YAP og TAZ shRNAs (shYAP/TAZ). Efter en stabil udvælgelse blev cellerne co-transficeret med PRL-TK konstruktionen, og enten pGL3-5xMCAT (SV)-49 konstruktioneller pGL3 (SV)-49 konstruktion og luciferase signal blev målt 24 timer senere. n = 4 uafhængige infektioner Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tukey's multiple sammenligningstest; n.s. = p>0.05, * p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Resultater af repræsentativ skærm. Resultatet fra hver knock down vektor sammenlignes med shNTC og præsenteres som fold forskel. Søjlegrafen viser gennemsnittet af firefly luciferase/Renilla luciferase ratio ± standardafvigelse. n = 1 eksperiment. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Rør A – Transfektionsfortynding | |
| Reagens | Volumen |
| Transfection Buffer | 25 μl pr. reaktion |
| Transfection Reagens 2 (tilføj sekund) | 1,5 μl pr. reaktion |
| Rør B – Reporter fortynding | |
| Reagens | Volumen |
| Transfection Buffer | 25 μl pr. reaktion |
| 20:1 Firefly luciferase reporter: kontrol Renilla mix (tilføj sekunder) | 400 NG pr. reaktion |
| Transfection Reagens 3 (tilføj tredje) | 1 μl pr. reaktion |
| I alt: 26,5 μl pr. reaktion | |
Tabel 1: Fremstilling af transfektionsblanding. Ved transfektion i hver brønd af pladerne med 24 brønd fortyndes 1,5 μL transfektionsreagens 2 til 25 μL transfektionsbuffer for at frembringe transfektionsfortyndingen (rør A). mens 400 ng af 20:1 firefly luciferase reporter: kontrol Renilla mix og 1 μL af transfektionreagens 3 fortyndes i 25 μL af Transfection Buffer til at producere reporter fortynding (rør B).
| Eksisterende/købt/gavevektorer | |
| Vektor | Kilde |
| GIPZ menneskelige shRNA lentivirale vektorer | GE Healthcare |
| VSVG | Hynes Lab [2] |
| psPAX2 delte et ben PAX2? | Addgene (#12260) |
| gag /pol | Addgene (#14887) |
| pGL3-(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| pGL3-5xMCAT(SV)-49 | Iain Farrance [15] |
| PRL-TK | Promega (Promega) |
| MSCV-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-YAP-S127A, S381A-IRES-Hygro | LAMAR LAB [2] |
| MSCV-ZSGreen-2A-Puro-hYAP7/hTAZ3 | LAMAR LAB [14] |
| Nye vektorer | |
| Vektor | Kilde Rygrad |
| MSCV-YAP-S94A,S127A,S381A-IRES-Hygro | MSCV-IRES-Hygro |
Supplerende tabel 1: Tabel over vektorer. Alle vektorer, der anvendes, vises med nye vektorer beskrevet. Standard molekylærbiologi teknikker blev brugt til at generere nye vektorer.
Supplerende tabel 2: Analyse af data for Luciferase-analysen. ShRNA-bibliotekets placering er vist i det første bord. Den anden og tredje tabeller viser den rå firefly og Renilla luciferase signaler, henholdsvis. Middel- og standardafvigelsen for Renilla luciferase-signalet for alle brønde er angivet i de gule bokse. Brønde med et Renilla luciferase signal mere end 1 standardafvigelse under middelværdien fremhæves med rød tekst og udelukkes fra yderligere analyse. Firefly /Renilla forholdet mellem hver brønd blev opnået ved at dividere den rå firefly luciferase signal med den rå Renilla luciferase signal (fjerde tabel). Firefly /Renilla forholdet mellem hver brønd blev derefter normaliseret til gennemsnittet af firefly /Renilla forholdet mellem kontrol (shNTC) brønde (femte tabel). De dublerede brønde blev derefter gennemsnit for hver konstruktion, og standardafvigelsen blev beregnet (sjette tabel). Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse demonstrerer vi en tilgang til medium-gennemløb screening af arrayed viral biblioteker i kombination med en dual-luciferase-baserede transskriptionsreporter assay, der kan bruges til at identificere og teste nye regulatorer af transskription faktorer. Det er vigtigt at karakterisere og optimere reportersystemet for hver cellelinje før enhver skærm. Der bør gøres forsøg for at bekræfte, at journalisten er lydhør over for ændret aktivitet af den transskriptionsfaktor, der undersøges, og omfanget af ændringer i aktiviteten bør testes i forhold til kontrolvektorer. Co-transfection af PRL-TK konstruktion sammen med reporter konstruktion er vigtig, fordi det hjælper med at kontrollere for antallet af celler transfemected med reporter og kopinummer af reporter konstruktion, som begge kan ændre størrelsen af luciferase signal. Optimeringsforsøg bør også sikre, at transskriptionsfaktoren ikke påvirker aktiviteten af den konstituerende Renilla-konstruktion eller en minimal promotorkonstruktion, da dette kan komplicere fortolkningen af resultaterne. Kontrol, der skal indgå i biblioteket, bør også overvejes nøje. Denne protokol er designet til en "blind skærm" af biblioteker med hundredvis af shRNAs, hvor det ikke er muligt at bekræfte effektiv knockdown af hver shRNA. Derfor er nogle falske positiver og negativer sandsynligvis. En forøgelse af antallet af tekniske og/eller biologiske replikater på skærmen kan hjælpe med at reducere antallet af falske positiver og negativer. Dette vil dog også øge antallet af brønde til kultur og analyse betydeligt, så der bør udvises forsigtighed for at sikre, at dette ikke resulterer i suboptimale dyrkningsforhold (se nedenfor). En anden tilgang til at reducere falske positiver og negativer ville være at gentage hele skærmen i samme cellelinje eller yderligere cellelinjer, eller at screene et mindre bibliotek, herunder kun "hits" ved hjælp af 3 biologiske replikater. I alle tilfælde bør eventuelle hits valideres ved hjælp af udlæsninger udover journalisten, såsom qPCR for kendte målgener. Effektiv knockdown af det målrettede gen bør også bekræftes i disse valideringstrin. Der bør ikke drages konklusioner om shRNA'er, der ikke ændrer aktivitet, medmindre den effektive knockdown af shRNA bekræftes. Valideringsforsøg bør også sikre, at den transskriptionsfaktor, der undersøges, er det, der reguleres af de målrettede gener, og at disse gener ikke påvirker Renilla eller minimale promotorkonstruktioner.
Det er også vigtigt at optimere cellekulturforholdene for hver cellelinje for at undgå suboptimale forhold såsom oversammenløb, for få celler, dårlig cellelevedygtighed eller variabel spredningskapacitet. Cellesåningstætheden er særlig vigtig på tidspunktet for transfektionen af dobbeltluciferase reporterkonstruktion (trin 5), og når reporteraktiviteten måles (trin 6). Transfection effektivitet kan variere betydeligt med celletæthed og dårlig transfektion effektivitet kan resultere i unormale resultater, hvis kun en lille brøkdel af cellepopulationen bliver assayed. De fleste testede cellelinjer viser den højeste transfektionseffektivitet, når de ved 40- 60% sammenløb, men det anbefales, at transfektionsbetingelser og såningstæthed optimeres for en given cellelinje ved hjælp af en vektor, der leverer et fluorescerende protein. Cellelinjer, der er svære at inficere og/eller transfect, såsom primære celler, er muligvis ikke egnede til denne skærm. Dårlig reporter transfection effektivitet eller dårlig celle levedygtighed typisk resultere i meget lav Renilla luciferase signal. Der bør dog udføres et pilotforsøg for at bestemme rækkevidden af Renilla luciferase-signalet for en cellelinje. Det er vigtigt, at titer af virus produceret fra arrayed biblioteket er høj nok til at give en infektion effektivitet på mindst 30% i den cellelinje, der assayed. Infektion effektivitet kan variere meget og flere faktorer kan påvirke viral titer. Den anvendte mængde viral supernatant skal optimeres for hver cellelinje, og om nødvendigt kan trin 2 optimeres yderligere for at forbedre viraltitre.
Celletæthed og celle levedygtighed kan også påvirke aktiviteten af cellulære veje, der regulerer transskription faktorer, så det er afgørende at frø cellerne til reporter transfection, så de alle er på en lignende tæthed på den dag dual-luciferase assay læses (Trin 6). Det er også vigtigt at sikre, at cellerne klæber ensartet på tværs af brønden i stedet for at gruppere i et tæt plaster i midten. Som beskrevet ovenfor kan en betydelig variation i Renilla luciferase-signalet fra brønd til brønd resultere i data, der er vanskelige at fortolke. Det er bedst at udelukke brønde, der viser en betydelig reduktion i Renilla luciferase signal i forhold til alle andre brønde, da dette tyder på, at enten den virale vektor er at reducere celle levedygtighed eller transfection effektivitet for at godt var meget lav. Her har vi udelukket brønde større end 1 standardafvigelse fra det gennemsnitlige Renilla luciferase signal, men optimeringsforsøg bør gøres for at bestemme passende cutoffs for hver cellelinje. Det er også muligt, at shRNAs at reducere celle levedygtighed kunne gøre det ved at ændre aktiviteten af transskription faktor, der assayed. Hvis dette er et problem, shRNAs at reducere Renilla luciferase signal kunne re-testet ved hjælp af inducible shRNAs eller andre analyser. Det er også vigtigt at begrænse den tid, som hængende celler er i suspension efter trypsinisering. Brug en multi-kanal pipette for de fleste trin under trypsinisering og såning af celler, og for større skærme, arbejde med pladerne i partier. Desuden er det bedst at begrænse tiden mellem infektion en af cellerne og reporter assay. Dette er især vigtigt, hvis transskription faktor, der assayed regulerer celleproliferation eller overlevelse. I dette tilfælde vil celler med effektiv knockdown blive udkonkurreret af celler med mindre effektiv knockdown.
Det er muligt at foretage flere ændringer af den beskrevne protokol. Denne tilgang kan bruges effektivt til at identificere regulatorer af enhver transskription faktor, hvis en luciferase-baserede reporter er genereret, og for mange af de mest almindelige transskription faktorer reporter konstruktioner allerede eksisterer. Denne protokol kan ændres til brug af en bred vifte kommercielt tilgængelige eller manuelt monterede biblioteker, herunder RNAi, CRISPR/CAS9, ORF eller cDNA. Faktisk har vi tidligere brugt en lignende strategi for at teste en lille cDNA bibliotek for YAP / TAZ regulatorer14. Biblioteker kan leveres ved hjælp af retrovirus, lentivirus, adenovirus, eller forbigående transfection. Den virale pels protein, der anvendes her (VSVG) genererer lentivirus, der er menneske-infektiøs. Hvis gnavere celler bliver brugt og ikke-menneskelige smitsomme økotropvirus ønskes, en vektor leverer Eco pels protein kan bruges i stedet for VSVG.
Andre metoder kan bruges til at screene biblioteker for regulatorer af en transskription faktor. Adgang til et screeningsanlæg med høj overførselsmængde vil gøre det muligt at screene meget større biblioteker på en automatiseret måde. Ligeledes kan genom-dækkende skærme gøres ved hjælp af pooled biblioteker med dyb sekventering som et middel til at identificere de "hits". Men begge disse tilgange kræver udstyr, der ikke er tilgængeligt for mange forskere, og gebyrerne for screening af højoverførselsmateriel eller dyb sekvensering kan være uoverkommeligt høje. Desuden ville pooled skærme kræver sortering af celler ved hjælp af en fluorescerende reporter eller en anden måde at berige de celler, der viser de ønskede ændringer i transskriptionel aktivitet. Screening af store arrayed udtryk biblioteker ved hjælp af en dual-luciferase-baserede transskriptionel reporter assay er blevet påvist tidligere ved hjælp af en benchtop robot55, men dette er ikke almindeligt tilgængelige for alle forskere. I modsætning her, den metode, der er beskrevet her, er hurtig, medium-throughput, relativt billigt, og bruger udstyr og reagenser, der sandsynligvis er tilgængelige for de fleste efterforskere. Denne metode kan afsløre flere regulatorer i et enkelt eksperiment, hvilket er en omkostningseffektiv og bekvem måde at opdage potentielle lovgivningsmæssige veje opstrøms for en transskription faktor.
I den beskrevne tilgang blev kandidatgener stabilt slået ned, og efter udvælgelsen blev reporterkonstruktionerne forbigående transfunderet ind i cellerne. Men, transfection effektivitet er dårlig i mange cellelinjer og kan indføre variation og forårsage cellulære toksicitet. En forbedret alternativ tilgang ville være at stabilt integrere reporter konstruere i genomet af cellelinje af interesse og derefter inficere reporter-udtrykke celler med virale biblioteker til screening. Denne forbedring vil reducere den variabilitet, der indføres ved den forbigående transfektion, og forhindre eventuelle ændringer i transskriptionsfaktoraktiviteten på grund af langvarig postinfektionskultur. Som nævnt ovenfor, ville brugen af en lille benchtop robot i høj grad strømline processen og øge størrelsen af de biblioteker, der kunne screenes. En anden væsentlig ændring er at bruge arrayed inducible vektor biblioteker, hvilket ville reducere sandsynligheden for udvælgelse mod celler med mere effektiv knockdown og reducere variabilitet forårsaget af ændringer i cellernes levedygtighed.
En væsentlig udfordring, der forhindrer en effektiv behandling af mange kræftformer er, at tumorceller erhverve resistens over for selv de mest effektive målrettede behandlinger. Identifikation af proteiner, der er nødvendige for denne terapeutiske resistens er nødvendig for at forbedre patientens resultat. Den beskrevne tilgang kunne nemt anvendes i kombination med målrettet terapi til at afsløre gener, der forårsager øget følsomhed eller resistens over for disse forbindelser. En anden potentiel fremtidig anvendelse af denne tilgang ville være at bruge denne opstækningsscreening til at teste kandidatterapeutiske mål i kombination. Til dette, celler ville blive inficeret med to virale vektorer hver med det formål at identificere proteiner, der har en synergistisk effekt på transskription faktor aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Emily Norton og Mikaelan Cucciarre-Stuligross for at hjælpe med udarbejdelsen af shRNA vektorer. Dette arbejde blev delvist støttet af en Susan G. Komen Career Catalyst Grant, der tildeles J.M.L. (#CCR17477184).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml 96-well deep well polypropylene plate | USA Scientific | 1896-2000 | For bacterial mini-prep |
| Trypsin - 2.50% | Gibco | 15090-046 | Component of trypsin-EDTA |
| 96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For dual-luciferase assay |
| Ampicillin - 100 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-10835242001-EA | For bacterial mini-prep |
| Bacto-tryptone - powder | Sigma-Aldrich | 95039 | Component of LB broth |
| Dual-luciferase reporter assay system, which include LAR II reagent (reagent A), Stop & Glo substrate (reagent B substrate) and Stop & Glo buffer (reagent B buffer) - Kit | Promega | E1960 | For dual-luciferase assay |
| Dulbecco's phosphate buffered saline w/o calcium, magnesium and phenol red - 9.6 g/L | Himedia | TS1006 | For PBS |
| EDTA - 0.5 M | VWR | 97061-406 | Component of trypsin-EDTA |
| Ethanol - 100% | Pharmco-AAPER | 111000200 | For bacterial mini-prep |
| Foetal Bovine Serum - 100% | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) - 8 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For virus infection |
| HyClone DMEM/High glucose - 4 mM L-Glutamine; 4500 mg/L glucose; sodium pyruvate | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
| I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For dual-luciferase assay | |
| L-Glutamine - 200 mM | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
| Lipofectamine 3000 (Transfection Reagent 2) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
| Molecular Biology Water - 100% | VWR | 02-0201-0500 | For dilution of shRNA vector for virus packaging |
| NaCl - powder | BDH | BDH9286 | Component of LB broth |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | For measuring vector DNA concentration | |
| Opti-MEM (Transfection Buffer) - 100% | Gibco | 31985-062 | For transfections |
| Penicillin Streptomycin - 10,000 Unit/ml (Penicillin); 10,000 µg/ml (Streptomycin) | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit | Thermo Fisher Scientific | K210010 | For bacterial mini-prep |
| Puromycin - 2.5 mg/ml | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection after infection |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For cell counting | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Transfection Reagent 1) - 100% | Roche | 6365787001 | For virus packaging |
| Yeast extract - powder | VWR | J850 | Component of LB broth |
| P3000 (Transfection Reagent 3) - 100% | Life technologies | L3000008 | For transfections |
References
- Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
- Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
- Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
- Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
- Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L.
- Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
- Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
- Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
- Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
- Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
- Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S.
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
- Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
- Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
- de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
- Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
- Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
- Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
- Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
- Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
- Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
- Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
- Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
- Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
- Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
- Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519 (2015).
- Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
- Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
- Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
- Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
- Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
- Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
- Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
- Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269 (2018).
- Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
- Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
- Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
- Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
- Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
- He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
- Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
- Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
- Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
- Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
- Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
- Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
- Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976 (2013).
- Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
- Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
- Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
- Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
