כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור בvivo הגדלת הרגולטורים של הבטן הרגולציה האינדוקציה תא T. בפרוטוקול זה, תאים דנדריטים מהונדסים מקומית לייצר ריכוזים גבוהים של ויטמין D הפעיל (1, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D או 1, 25 [הו]2ד) ו ויטמין פעיל (חומצה RETINOIC או RA) דה נובו.
מחלות מעי דלקתיות (IBD) היא מחלה כרונית דלקתית במערכת העיכול (GUT). בארצות הברית, ישנם כ 1,400,000 מטופלים IBD. מקובל בדרך כלל כי תגובה חיסונית מוסדר לחיידקים המעיים יוזם את המחלה משבש את מכשול האפיתל רירית. אנו מראים לאחרונה כי התאים הרגולציה T (Treg) התקנות הם טיפול מבטיח IBD. בהתאם לכך, מאמר זה מציג פרוטוקול עבור vivo הגדלת הבטן האינדוקציה תא Treg. בפרוטוקול זה, תאים דנדריטים מתוכננים לייצר ריכוזים גבוהים מקומית של שתי מולקולות דה נובו, ויטמין D פעיל (1, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D או 1, 25 [הו]2ד) ו ויטמין פעיל a (חומצה RETINOIC או RA). בחרנו 1, 25 (הו)2d ו RA מבוסס על הממצאים הקודמים מראה כי 1, 25 (הו)2D יכול לגרום את הביטוי של מולקולות רגולטוריות (למשל, forkhead box P3 ו interleukin-10) וכי RA יכול לעורר את הביטוי של קולטני ביות בטן בתאי T. כדי ליצור תאים דנדריטים מהונדסים כגון, אנו משתמשים וקטור לויראלי כדי לשנות את התאים הדנדריטים כדי overexpress שני גנים. גן אחד הוא ציטוכרום P450 משפחה 27 תת B חבר 1 המקודד 25-hydroxyvitamin יטמין D 1α-הידרוקסילאז, אשר מזרז בפיזיולוגית את הסינתזה של 1, 25 (הו)2ד. הגן השני הוא בן משפחה דגנאז 1 A2 אשר מקודד retinאלדהיד דהידרוגנאז 2, אשר מזרז בפיזיולוגית את הסינתזה של RA. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקירה עתידית של תאים Treg המעיים בvivo.
מחלות מעי דלקתיות (IBD) היא מחלה כרונית דלקתית במערכת העיכול (GUT). בארצות הברית, ישנם כ 1,400,000 מטופלים IBD. זה מקובל בדרך כלל כי תגובה חיסונית מוסדר לחיידק המעיים יוזם את המחלה משבש את מכשול האפיתל רירית1,2. מסיבה זו, מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) הזמין בארה ב מעכב את התפקודים של מגשרים דלקתיים או לחסום את הביות של תאים חיסוניים לתוך הבטן. עם זאת, המגשרים דלקתיים תאים חיסוניים המיועדים גם נחוצים עבור הגנות החיסון. כתוצאה מכך, מעכבי מגשר דלקתית להתפשר ההגנה החיסונית מערכתית ואת חוסמי תא החיסון להחליש את הבטן החיסונית, שניהם יכולים להוביל להשלכות חמורות3,4. בנוסף, המערכת החיסונית חוסמי הביות יכול גם לחסום את הביות של תא T (Treg) תאים לתוך הבטן ומכאן יכול להחמיר את העמידות החיסונית כבר בסיכון בחולים IBD. יתר על כן, חסימת תא Treg מתביית לבטן עלול גם להוביל לדיכוי החיסונית מערכתית בשל הצטברות של תאים Treg בדם5. לבסוף, מעכבי וחוסמי לתפקד באופן מידי, ובכך, דורשים מנהלות תכופים. מינהל תכופים של מעכבי אלה חוסמי יכול עוד להחריף את תופעות לוואי בלתי צפוי.
לאחרונה, הציעו אסטרטגיה הרומן שיכול לרכך או אפילו לחסל את תופעות הלוואי הקשורות התרופות הנוכחיות עבור טיפול IBD6. אסטרטגיה זו מגבירה את האינדוקציה של תאים Treg הבטן ברקמות הלימפה ההיקפית6. הרציונל של אסטרטגיה זו היא כי המעיים מתביית בתאי Treg במיוחד הבית לבטן ולכן לא להתפשר על הגנות החיסונית מערכתית. בנוסף, מאז התאים treg יכול ליצור את הזיכרון7,8, בתאי המעיים treg התאים עלולים לספק שליטה יציבה של דלקת הבטן כרונית בחולים ibd, ובכך, הטיפול לא צריך להיות מנוהל בתדירות גבוהה. יתר על כן, מאז אסטרטגיה זו מגבירה את האינדוקציה של תאים treg המעיים ב vivo, אין לו את הדאגה של vivo אי-יציבות בסביבה proinflammatory מאוד כי הוא קשור העברה המאמצת של תאים מחוץ לבית מיון שנוצר על ידי מבחנה9,10. בהקשר זה, בתאי treg שנוצר מחוץ לתחום הם אחת האסטרטגיות המוצעות לטיפול במחלות אוטואימוניות11,12,13 ו השתלת השתלה14,15. בסופו של דבר, באסטרטגיה זו, תאים דנדריטים (DCs) מתוכננים לייצר ריכוזים גבוהים באופן מקומי של שתי מולקולות דה נובו: ויטמין D פעיל (1, 25-דיהידרוטסטוסטרון ויטמין D או 1, 25 [הו]2ד) ו-ויטמין פעיל (חומצה RETINOIC או RA). בחרנו 1, 25 (הו)2d ו RA כי 1, 25 (הו)2d יכול לגרום לביטוי של מולקולות רגולטוריות (למשל, forkhead box P3 [foxp3] ו interleukin -10 [IL-10])16,17 וכי RA יכול לעורר את הביטוי של קולטני המעיים בתאי T18. בגלל שניהם 1, 25 (הו)2D ו RA יכול גם tolerize dcs28,29, אנחנו מסיבה כי DCs הנדסה יהיה מתוחזק באופן בלתי נשכח במצב tolerize ב vivo ולכן לעקוף את החששות vivo אי-יציבות הקשורים בקרי מבחנה המופק בתחום ה-dc (toldcs)19,20,21. במובן זה, toldcs הם גם אחת האסטרטגיות המוצעות עבור ב vivo הגדלת של פונקציות תא treg19,20,21. כדי לתמוך ההיגיון שלנו, הראינו כי DCs הנדסה, על vivo משלוח, יכול להגדיל את אינדוקציה של בתאי המעיים Treg ברקמות הלימפה ההיקפית6.
יתרון נוסף של האסטרטגיה המוצעת שלנו היא כי 1, 25 (הו)2D יש גם פונקציות אחרות שעלולות להועיל לחולים ibd. אלה פונקציות אחרות כוללות את היכולת של 1, 25 (הו)2ד כדי לעורר את הפרשת antimicrobials22 וכדי לדכא קרצינובגנזה23. זיהומים וסרטן משויכים לעתים קרובות עם ibd24,25.
כדי ליצור את DCs שיכולים לייצר ריכוזים גבוהים באופן מקומי של שניהם 1, 25 (הו)2D ו RA דה נובו, אנו משתמשים וקטור לויראלי כדי להנדס DCs כדי לבטא שני גנים. גן אחד הוא ציטוכרום P450 משפחה 27 תת B חבר 1 (CYP27B1) המקודד 25-הידרוקסיל ויטמין D 1α-הידרוקסילאז (1α-הידרוקסילז), אשר מזרז פיזיולוגית את הסינתזה של 1, 25 (הו)2ד. הגן השני הוא האלדהיד דהידרוגנאז 1 בן משפחה A2 (ALDH1a2) המקודד retinאלדהיד דהידרוגנאז 2 (RALDH2), אשר מזרז בפיזיולוגית את הסינתזה של RA6.
בגלל שvivo הגדלת האינדוקציה של תא Treg בעלי המעיים הוא פוטנציאל חשוב לטיפול IBD, בפרוטוקול הבא אנו פירוט את ההליכים לדור של 1α-הידרוקסילז-RALDH2-הבעת בקרי מחשבים (DC-CYP-בתאי ALDH) כי יכולה לשמש לחקירה עתידית של תאי טרג בעלי מעיים בvivo.
במאמר זה אנו מתארים את השימוש DC-CYP-ALDH התאים, לצורך הגדלת אינדוקציה של תאים Treg הבטן מתביית ברקמות הלימפה היקפית. הנתונים שלנו הראו כי התאים DC-CYP-ALDH יכול לסנתז ריכוזים גבוהים באופן מקומי של דה נובו של שניהם 1, 25 (הו)2D ו-RA בתחום הנוכחות של מצעים המקביל (כלומר, 25 [הו] D ו רטינול, בהתאמה). בגלל ריכ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי המשרד של עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות באמצעות עמית ביקורת המחקר הרפואי התוכנית תחת הפרס לא. W81XWH-15-1-0240 (XT). דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלה של המחבר והן לא בהכרח אושרו על-ידי משרד הביטחון. עבודה זו הייתה גם נתמכת באופן חלקי על ידי מלגות חדשנות מחקר מהמחלקה לרפואה באוניברסיטת לומה לינדה (681207-2967 [XT ו-GG], 681205-2967 [XT], ו 325491 [DJB]).
10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |