Здесь мы представляем протокол для in vivo увеличения кишки-самонаведения регулятивной индукции Т-клеток. В этом протоколе дендритные клетки разработаны для локального производства высоких концентраций активного витамина D (1,25-дигидроксивитамин D или 1,25-ОХ)2D) и активного витамина А (ретиноевая кислота или РА) де-ново.
Воспалительные заболевания кишечника (IBD) является воспалительным хроническим заболеванием в желудочно-кишечном тракте (GUT). В Соединенных Штатах, Есть около 1,4 миллиона пациентов IBD. Общепризнано, что дисрегулируемый иммунный ответ на кишечные бактерии инициирует болезнь и нарушает слизистую оболочку эпителиального барьера. Недавно мы показываем, что кишки homing нормативных T (Treg) клетки являются перспективными терапии для IBD. Соответственно, эта статья представляет протокол для in vivo увеличения кишки-homing Treg клетки индукции. В этом протоколе, дендритные клетки разработаны для производства локально высоких концентраций двух молекул de novo, активного витамина D (1,25-dihydroxyvitamin D или 1,25-OH2D) и активного витамина А (ретиноиновая кислота или РА). Мы выбрали 1,25 (OH)2D и RA на основе предыдущих выводов, показывающих, что 1,25 (OH)2D может вызвать выражение регуляторных молекул (например, вилочная коробка P3 и интерлейкин-10) и что РА может стимулировать экспрессию рецепторов самонаведения кишечника в Т-клетках. Для генерации таких инженерных дендритных клеток мы используем лентивирусный вектор для преобразить дендритные клетки, чтобы переэкспрессировать два гена. Одним из генов является цитохром P450 семейства 27 подсемейства B член 1, который кодирует 25-гидроксивитамин D 1 “гидроксилаза, которая физиологически катализа синтеза 1,25 (OH)2D. Другой ген альдегид дегидрогеназы 1 член семьи A2, который кодирует ретинальдегид дегидрогеназы 2, который физиологически катализа синтеза РА. Этот протокол может быть использован для будущего исследования кишки самонаведения Treg клеток in vivo.
Воспалительные заболевания кишечника (IBD) является воспалительным хроническим заболеванием в желудочно-кишечном тракте (GUT). В Соединенных Штатах, Есть около 1,4 миллиона пациентов IBD. Принято считать, что дисрегулируемый иммунный ответ на кишечные бактерии инициирует болезнь и нарушает слизистую оболочку эпителиального барьера1,2. По этой причине, в настоящее время доступны США пищевых продуктов и медикаментов (FDA) утвержденных препаратов подавляют функции воспалительных посредников или блокировать самонаведения иммунных клеток в кишечнике. Тем не менее, воспалительные посредники и иммунные клетки, которые являются мишенью также необходимы для иммунной защиты. В результате, ингибиторы воспалительного посредника компрометируют системную иммунную защиту, а блокаторы самонаводящихся иммунных клеток ослабляют иммунную защиту кишечника, оба из которых могут привести к тяжелым последствиям3,4. Кроме того, блокаторы самонаведения иммунных клеток могут также блокировать самонаводящиеся регулятивные Клетки T (Treg) в кишечник и, следовательно, могут ухудшить уже скомпрометированную иммунную толерантность кишечника у пациентов IBD. Кроме того, блокирование Treg ячейки самонаведения в кишечнике может также привести к системному подавлению иммунной системы из-за накопления клеток Treg в крови5. Наконец, ингибиторы и блокаторы функционируют временно и, таким образом, требуют частых вводом. Частое введение этих ингибиторов и блокаторов может еще больше усугубить неблагоприятные побочные эффекты.
Недавно мы предложили новую стратегию, которая потенциально может смягчить или даже устранить побочные эффекты, связанные с текущими препаратами для лечения IBD6. Эта стратегия дополняет индукцию клеток Treg, наводящих кишки в периферических лимфоидных тканях6. Обоснование этой стратегии является то, что кишки самонаведения Treg клетки специально дома в кишечнике и, следовательно, не будет идти на компромисс системной иммунной защиты. Кроме того, так как клетки Treg потенциально могут формировать память7,8, кишки-homing Treg клетки потенциально могут обеспечить стабильный контроль хронического воспаления кишечника у пациентов IBD и, таким образом, лечение не должно быть введено так часто. Кроме того, так как эта стратегия увеличивает индукции кишки hom-homing Treg клеток in vivo, она не имеет озабоченность in vivo нестабильности в высокопровистской среде, которая связана с приемной передачи in vitro генерируемых Treg клеток9,10. В связи с этим, в пробирке генерируемых Treg клетки являются одной из предложенных стратегий для лечения аутоиммунных заболеваний11,12,13 и трансплантации отказ14,15. Наконец, в этой стратегии, дендритные клетки (DCs) разработаны для производства локально высоких концентраций двух молекул de novo: активного витамина D (1,25-dihydroxyvitamin D или 1,25-ОГ)2D) и активного витамина А (ретиноиновая кислота или РА). Мы выбрали 1,25 (OH)2D и РА, потому что 1,25 (OH)2D может вызвать экспрессию регуляторных молекул (например, вилочная коробка P3 «foxp3» и интерлейкин-10 «IL-10»)16,17 и что РА может стимулировать выражение рецепторов кишки в Т-клетках18. Потому что оба 1,25 (OH)2D и РА может также tolerize DCs28,29, мы считаем, что инженерии DCs будет стабильно поддерживается в толерогенном статусе in vivo и, следовательно, обойти in vivo нестабильности проблем, которые связаны с in vitro генерируемых DCs (TolDCs)19,20,21. В этом отношении, TolDCs также являются одной из предлагаемых стратегий для in vivo увеличения Treg функции клеток19,20,21. Для поддержки наших рассуждений, мы показали, что инженерии DCs, после доставки in vivo, может увеличить индукцию кишечника hom-homing Treg клеток в периферических лимфоидныхтканей 6.
Дополнительным преимуществом нашей предлагаемой стратегии является то, что 1,25 (OH)2D также имеет другие функции, которые потенциально могут принести пользу пациентам IBD. Эти другие функции включают в себя способность 1,25 (OH)2D, чтобы стимулировать секрецию противомикробных препаратов22 и подавляет канцерогенез23. Инфекции и раковые заболевания часто связаны с IBD24,25.
Для генерации ЦС, которые могут производить локально высокие концентрации как 1,25 (OH)2D и RA de novo, мы используем ленцивирусный вектор для инженера DCs для переэкспресса двух генов. Одним из генов является цитохром P450 семейства 27 подсемейства B член 1 (CYP27B1), который кодирует 25-гидроксивитамин D 1 “гидроксилаза” (1″-гидроксилаза), который физиологически катализает синтез 1,25 (OH)2D. Другой ген альдегид дегидрогеназы 1 член семьи A2 (ALDH1a2), который кодирует дегидрогеназы ретинальдегида 2 (RALDH2), который физиологически катализа синтеза РА6.
Потому что in vivo увеличение кишки-homing Treg клеточной индукции потенциально важно в обработке IBD, в следующем протоколе мы подробно процедуры для генерации 1 “-гидроксилаза-RALDH2-переэкспрессии DCs (DC-CYP-ALDH клеток), что может быть использован для будущего исследования кишки самонаведения Treg клеток in vivo.
В этой статье мы описываем использование dc-CYP-ALDH клеток, для увеличения индукции кишки homing Treg клеток в периферических лимфоидных тканей. Наши данные показали, что клетки DC-CYP-ALDH могут синтезировать локально высокие концентрации de novo как 1,25(OH)2D и RA in vitro в присутствии соответствующих …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Управлением помощника министра обороны по вопросам здравоохранения в рамках программы медицинских исследований Peer Reviewed в соответствии с премией No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Мнения, толкования, выводы и рекомендации являются мнениями автора и не обязательно одобрены министерством обороны. Эта работа также была частично поддержана научно-исследовательскими инновационными грантами от Кафедры Медицины Университета Лома Линда (681207-2967 (XT и GG), 681205-2967 «XT» и 325491 «DJB»).
10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |